Duyuru

Collapse
No announcement yet.

Nattokinase, NATTO,

Collapse
X
  • Filtrele
  • Zaman
  • Göster
Hepsini Sil
new posts

  • Nattokinase, NATTO,

    Nattokinase: Kardiyovasküler Hastalıkların Önlenmesi ve Tedavisinde Umut Veren Bir Alternatif

    Hongjie Chen , 1 Eileen M McGowan , 2 Nina Ren , 3 Sara Lal , 2 Najah Nassif , 2 Fatima Shad-Kaneez , 2 Xianqin Qu , 2 ve Yiguang Lin 2
    Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk Reddi
    Bu makale, PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır .
    Git: Soyut

    Kardiyovasküler hastalık (KVH), dünyadaki önde gelen ölüm nedenidir ve KVH mortalitesinin kontrolü ve yönetimine yönelik yaklaşımımız sınırlıdır. Natto'nun en aktif bileşeni olan Nattokinase (NK), çeşitli olumlu kardiyovasküler etkilere sahiptir ve Natto tüketimi, CVD mortalitesinde bir azalma ile bağlantılıdır. Son araştırmalar, NK'nın güçlü fibrinolitik aktiviteye, antihipertansif, anti-aterosklerotik ve lipid düşürücü, antiplatelet ve nöroprotektif etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Bu derleme, NK'nın majör farmakolojik etkilerini, CVD ile klinik ilişkisine odaklanarak kapsamaktadır. NK'nin avantajlarını ve NK farmakokinetiğiyle ilgili öne çıkan konuları özetlemektedir. Mevcut kanıtlar, NK'nin KVH'li hastalar için birkaç önemli kardiyovasküler faydalı etkiye sahip benzersiz bir doğal bileşik olduğunu ve bu nedenle KVH'nin önlenmesi ve tedavisi için ideal bir ilaç adayı olduğunu göstermektedir. Nattokinase, CVD yönetiminde umut verici bir alternatiftir.

    Anahtar Kelimeler: Nattokinase, natto, kardiyovasküler hastalık, antitrombotik ajanlar, antihipertansif ilaçlar, ateroskleroz
    Git: Tanıtım

    Kardiyovasküler hastalıklar (KVH) dünya çapında en yaygın ölüm nedenidir. 2015 yılında, KVH ile ilişkili ölümlerin sayısı dünya çapındaki tüm ölümlerin %31'ini temsil ediyordu ( www.who.int/cardiovascular_diseases ). Bugüne kadar, KVH ile ilişkili mortalitenin kontrolü ve/veya yönetimi için sınırlı yaklaşımlar mevcuttur. 1

    Bacillus subtilis ile fermente edilmiş soya fasulyesinden yapılan peynir benzeri bir gıda olan Natto, 2000 yılı aşkın bir süredir Asya ülkelerinde geleneksel bir gıda olarak tüketilmektedir. Natto tüketiminin Japon nüfusunun uzun ömürlü olmasına önemli bir katkıda bulunduğuna inanılıyor. 2 Yakın zamanda yapılan araştırmalar, yüksek natto alımının toplam KVH ölüm riskinin azalmasıyla ve özellikle de iskemik kalp hastalıklarından kaynaklanan ölüm riskinin azalmasıyla ilişkili olduğunu göstermiştir. 2

    1980'lerden önce, natto tüketiminin genel kardiyovasküler sağlığa yol açtığı mekanizma hakkında çok az şey biliniyordu. 1987'de Sumi ve diğerleri, natto'nun nattokinaz (NK) adı verilen güçlü bir fibrinolitik enzim içerdiğini keşfetti. O zamandan beri, Japonya, Kore, Çin ve Amerika Birleşik Devletleri'nde NK üzerinde önemli miktarda NK araştırması yapıldı ve bu çalışmalar, moleküler ağırlığı yaklaşık 28 kDa olan 275 amino asit kalıntısından oluşan bir alkalin proteaz olan NK'nin, 4 , natto'nun en aktif bileşenidir ve kardiyovasküler sağlık üzerindeki birçok olumlu etkiden sorumludur. Birincisi, NK güçlü fibrinolitik/antitrombotik aktiviteye sahiptir. 3– 6 Ek olarak, hem hayvan hem de insan çalışmalarında NK ayrıca antihipertansif, 7 , 8 antiaterosklerotik, 9 , 10 lipid düşürücü, 9 , 11 antiplatelet/antikoagülan, 12 ve nöroprotektif etkilere sahiptir. 13 , 14 NK'nin tüm bu farmakolojik etkileri, CVD'nin önlenmesi ve tedavisi ile ilgilidir. Gerçekten de, NK takviyesinin insan deneklerde fibrinoliz ve antikoagülasyon belirteçlerini arttırdığı ve kan basıncını (BP) ve aterosklerozu azalttığı gösterilmiştir. 8 , 9 , 15– 17

    NK'nin en benzersiz özelliği, tek bir bileşik olarak, birden fazla CVD önleyici ve hafifletici farmakolojik etkiye (yani, antitrombotik, antihipertansif, antikoagülan, anti-aterosklerotik ve nöroprotektif etkiler) sahip olmasıdır. NK'ya benzer çoklu farmakolojik özelliklere sahip başka ilaç veya ilaç adayı yoktur. Ayrıca NK, ağızdan uygulanabilen, kanıtlanmış bir güvenlik profiline sahip, kullanımı ekonomik ve diğer farmasötik ürünlere göre belirgin avantajlar sağlayan doğal bir üründür. Bu nedenle, CVD'nin önlenmesi, tedavisi ve uzun süreli bakımı için yeni nesil bir ilaç olarak geliştirilme potansiyeline sahiptir. 7

    Bu derleme, NK'nın anahtar farmakolojik etkilerini ve etki mekanizmalarını, bunların CVD'nin önlenmesi ve tedavisi ile ilgisi ve potansiyeline odaklanarak kısaca özetlemeyi amaçlamaktadır. CVD'nin yönetimi için bir ajan olarak NK'nin avantajları ana hatlarıyla anlatılacaktır. NK'yi CVD için bir ilaç adayı olarak çevreleyen kalan bazı sorunlar eleştirel olarak gözden geçirilecek ve analiz edilecektir.

    NK'nin Farmakolojik Etkileri
    NK'nin farmakolojik etkileri ve etki mekanizmaları aşağıdaki alt başlıklar altında gözden geçirilecek ve özetlenecektir: fibrinolitik/antitrombotik etkiler, anti-aterosklerotik ve lipid düşürücü etkiler, antihipertansif etkiler, antitrombosit/antikoagülan etkiler ve aşağıdaki alt başlıklarda özetlendiği gibi nöroprotektif etkiler.Şekil 1.
    Resim, illüstrasyon vb. içeren harici bir dosya. Nesne adı 10.1177_117771918785130-fig1.jpg
    Şekil 1.
    Nattokinazın kardiyovasküler sağlık ve hastalıkla ilgili farmakolojik etkileri. NK'nin güçlü fibrinolitik/antitrombotik etkileri


    Natto Asya'da binlerce yıldır tüketilmiş olmasına rağmen, NK'nin fibrinolitik özelliği ancak 1987'de keşfedildi.3 Bu ilk keşiften bu yana, çok sayıda laboratuvar ve insan çalışması tutarlı bir şekilde NK'nin güçlü antitrombolitik etkisini bildirdi. 18 , 19

    NK'nin trombolitik etkilerini in vitro ve hayvan modellerinde değerlendirmek için önemli miktarda çalışma yapılmıştır. Bir sıçan modeli kullanarak, Fujita ve ark.5 NK'nın ortak karotid arterde (CCA) kimyasal olarak indüklenen trombüs üzerindeki etkisini inceledi ve NK'nın trombüs çözünmesinde plazminden 4 kat daha güçlü olduğunu buldu. 2836 FU konsantrasyonunda, NK 6 saat içinde trombüsün %88'ini parçaladı, 20 ve NK in vivo olarak önemli profilaktik antitrombotik etkiler sergiledi. NK'nin tromboza karşı etkinliği, karagenan kaynaklı bir kuyruk trombozu modelinde doğrulandı. 21 Pulmoner trombozlu farelerin hayatta kalma oranı NK tarafından arttırıldı ve farelerde tromboz oluşumu NK tarafından belirgin şekilde inhibe edildi, bu da önemli antitrombotik etkiler gösterdi.22 Ek olarak, sıçan deneysel pulmoner tromboz modelinde, NK'nın oral yoldan verilmesi, trombüs sayısında ve plazma öglobulin lizis süresinde (ELT) bir azalmaya ve ayrıca doku plazminojen aktivatöründe (tPA) bir artışa yol açtı; in vivo olarak plazma fibrinolizini aktive edebilir. 23 Omura ve diğerleri 24 ayrıca, esas olarak NK'den oluşan saflaştırılmış bir protein tabakası olan NKCP'nin, heparininkine benzer olarak tanımladıkları hem fibrinolitik hem de antitrombotik etkilere sahip olduğunu bulmuşlardır. Sıçanlarda, Natto tedavisi, tedavi edilmeyen bir sıçan grubuna kıyasla ELT'yi kısalttı ve kısmi tromboplastin süresini önemli ölçüde uzattı. 25

    Artık NK'nin sadece fibrini doğrudan ve etkili bir şekilde parçalamakla kalmayıp, aynı zamanda plazmin oluşumunda müteakip bir artışla tPA salınımını da arttırdığı bilinmektedir. 5 , 17 , 26– 28 Plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1), tPA'nın birincil inhibitörüdür ve fibrinolitik kaskaddaki fibrinolitik aktiviteyi düzenler. 29 NK'nın fibrinolitik etkisini uyguladığı mekanizmayı araştıran bir çalışmada, NK, PAI-1'in bölünmesi ve inaktivasyonu yoluyla fibrinolizi arttırdı. 4 Bu çalışmada, NK'nin aktif rekombinant prokaryotik PAI-1'i düşük moleküler ağırlıklı parçalara ayırdığı ve ayrıca doku tipi plazminojen aktivatörünün neden olduğu fibrin pıhtı lizizini geliştirdiği gösterilmiştir. PAI-1'in yokluğunda gözlemlenen arttırılmış fibrinolitik aktivitenin, NK tarafından doğrudan fibrin çözünmesi yoluyla indüklendiği görüldü. 4Nattokinaz ayrıca prourokinazın ürokinaz'a dönüştürülmesi yoluyla ürokinaz gibi pıhtı çözücü ajanların üretimini de arttırdı. 5 , 19 Ayrıca NK'nin, kanamanın yan etkisini üretmeden trombosit agregasyonunun inhibisyonu ile sonuçlanan tromboksan oluşumunu bloke edebildiği gösterilmiştir. 12 Böylece, NK'nin güçlü bir antitrombotik ajan olduğu ve trombüs oluşumunu azaltarak plak oluşumunun ilerlemesini yavaşlatabildiği ve gelişen aterosklerotik lezyonları tersine çevirebildiği bulundu. 10

    İnsan çalışmalarından elde edilen veriler ayrıca NK veya natto'yu güçlü ve umut verici bir fibrinolitik ajan olarak güçlü bir şekilde desteklemektedir. Erken bir insan denemesinde, NK'nın oral yoldan verilmesinin, plazma ELT ve tPA üretimi ile gösterildiği gibi, plazmada kademeli bir fibrinolitik aktivite artışı ürettiği gösterilmiştir. 6 Sağlıklı yetişkin gönüllülere natto basil (100 mg/kg) uygulamasını takiben, ELT azalmış ve tPA aktivitesi önemli ölçüde artmıştır ( P  < .05). 23 Açık etiketli, kendi kendini kontrol eden bir klinik çalışmada, Hsia ve ark. 172 aylık uygulamadan sonra fibrinojen, faktör VII ve faktör VIII düzeylerinin önemli ölçüde azaldığını ve bu da NK uygulamasından umut verici bir kardiyovasküler faydayı ima ettiğini bulmuştur. 2000 FU'da tek bir oral NK dozundan sonra bile, kan fibrin/fibrinojen bozunma ürünü seviyeleri, NK uygulamasından 4 saat sonra önemli ölçüde arttı ( P  < .05), tromboliz ve antikoagülasyon profillerinin yükseldiğini doğruladı. 16 Hsia'nın çalışması, insanlarda tromboz ve KVH riskini azaltmak için yararlı bir fibrinolitik/antikoagülan ajan olarak NK'yi destekledi.

    Tromboz, iskemik kalp hastalığı, iskemik inme ve venöz tromboembolizmin altında yatan yaygın bir patolojidir. 30 Trombolitik/fibrinolitik tedavi miyokard enfarktüsünde, beyin enfarktüsünde ve bazen de masif pulmoner embolide kullanılır. Fibrinolitik tedavi birçok durumda mortaliteyi azaltabilir. Sonuç olarak, bu tür tedavilerin kullanımı son yıllarda hızla artmıştır. 31Plazminojen aktivatörleri, streptokinaz ve anizoillenmiş plazminojen streptokinaz-aktivatör kompleksi gibi yaygın olarak kullanılan ticari trombolitik ajanların tümü ciddi dezavantajlar ve yan etkilerle birlikte gelir. Bu trombolitik ilaçlar genellikle pahalıdır, intravenöz uygulamadan sonra kısa bir yarı ömre sahiptir ve kontrol edilemeyen fibrinoliz ve kanama hızlanmasına yol açar. Bu risklerin üstesinden gelmek için, trombolitik bozuklukların veya CVD'nin tedavisi için NK gibi daha güvenli bir trombolitik ajana ihtiyaç vardır. 5

    NK'nin anti-aterosklerotik ve lipid düşürücü etkileri
    Birçok KVH tarafından paylaşılan altta yatan patolojik değişiklik, kalp hastalığı ve inmenin birincil nedeni olan aterosklerozdur. 32 Bu nedenle, anti-aterosklerotik etkileri olan ilaçların geniş bir klinik önemi olacaktır; ancak, bu tür ilaçlara ulaşmak zordur. Nattokinase, bu tür umut verici anti-aterosklerotik ve lipid düşürücü etkileri olan ilaçlardan biri gibi görünmektedir.

    NK'yi bir anti-aterosklerotik ajan olarak araştıran bir dizi hayvan çalışması, diyet natto özü takviyesinin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında sıçanlarda intimal kalınlaşmayı baskıladığını göstermiştir. 10 , 33 Vasküler yaralanmadan sonra intimal kalınlaşmanın baskılanması, NK'nin artan trombolitik aktivitelerine atfedilebilir. 10 , 33 Kontrol grubu ile hayvanların yaralanmadan 3 hafta önce natto özü veya NK ile beslendiği natto ile beslenen grup arasında intimal kalınlaşmada çarpıcı bir fark vardı. Hem NK hem de natto özü, endotel hasarı olan sıçanlarda intimal kalınlaşmayı bastırdı. Her ne kadar Chang ve diğerleri 34natto özütünün, antioksidan ve antiapoptotik özelliklerine atfedilen sinerjistik bir etki yoluyla intimal kalınlaşmayı bastırdığına inanılırken, diğer çalışma, NK'nin doğrudan antioksidan etkisiyle, lipid peroksidasyonunu azaltarak ve lipid metabolizmasını iyileştirdiğini (düşük yoğunluklu lipoprotein [LDL'nin inhibisyonu)] arteriosklerozu önlediğini göstermiştir. ] oksidasyon). 35 Kırmızı ginseng ile birlikte kullanıldığında, NK'nin hiperkolesterol diyetiyle beslenen tavşanlarda aort plak alanını azalttığı bulundu. 36

    Laboratuvarımızda yakın zamanda yürütülen bir klinik çalışmada, 9 günlük NK takviyesi, aterosklerotik plakları olan hastalarda aterosklerozun ilerlemesini baskılamanın etkili bir yoluydu. 26 hafta boyunca NK tedavisini takiben, tedavi öncesi başlangıca kıyasla CCA intima-media kalınlığında (CCA-IMT) ve karotis plak boyutunda önemli bir azalma oldu. Karotis plak boyutu ve CCA-IMT sırasıyla 0.25 ± 0.12 cm2'den 0.16 ± 0.10 cm2'ye ve 1.13 ± 0.12 mm'den 1.01 ± 0.11 mm'ye düşürülmüştür . NK grubundaki azalma daha anlamlıydı ( P < .01) simvastatin ile tedavi edilen gruptan (20 mg günlük doz). Verilerimiz, NK'nin aterosklerozu azaltmak için yaygın olarak kullanılan bir ilaç olan statinlere daha iyi bir alternatif olduğunu ve ayrıca NK'nın hastalarda kardiyovasküler atak ve inme için uygun bir alternatif tedavi olabileceğini ileri sürdü. 9

    NK'nin aterosklerozu baskıladığı altta yatan mekanizmalar bilinmemektedir. İlk çalışmalar, NK'nin trombolitik aktiviteleri arttırdığını göstermiştir. 10 , 33 Mevcut veriler, NK'nin anti-aterosklerotik etkisinin, NK veya NK içeren natto özütünün antitrombotik, antikoagülan, antioksidan ve lipid düşürücü etkilerinin kombinasyonunun toplu etkilerinden kaynaklandığını göstermektedir. 9 , 35- 37

    Anti-aterosklerotik etkilerine ek olarak, NK veya natto özütü ayrıca lipidler üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir. NK veya NK içeren natto özü kullanarak, çeşitli laboratuvarlardan yapılan çalışmalar 25 , 36– 41 , NK'nin hipolipidemik bir etkiye sahip olduğunu ve hayvan modellerinde artan serum trigliseritlerini, toplam kolesterolü ve LDL kolesterol (LDL-C) seviyelerini önemli ölçüde azaltabileceğini doğruladı. Çalışmalarımız hiperlipidemili hastalarda NK tedavisinin (6500 FU'de 26 hafta) toplam kolesterol, LDL-C ve trigliseritleri azalttığını buldu. Ek olarak, NK, yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol (HDL-C) seviyesini arttırdı. 9 Bununla birlikte, küçük bir pilot çalışmada, Wu ve ark. 424000 FU dozunda 8 haftalık tedaviyi takiben NK tedavi grubunda serum kolesterolü, LDL-C ve HDL-C'de bir düşüş gözlemledi, ancak fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Wu ve diğerleri tarafından gözlemlenen serum lipid seviyesindeki önemsiz değişiklik, kullanılan nispeten düşük dozajlar ve daha kısa bir tedavi süresi ile ilgili olabilir. Hipolipidemik etkilerin oldukça yüksek olduğunu gösteren laboratuvar çalışmalarında kullanılan dozlar dikkate alındığında (örn. Xie ve ark . 38 ratlarında günlük doz olarak 90 ile 360 ​​mg/kg arasında, Wu ve ark. hastalarında ise günde 400 mg kullanmışlardır) NK'nin lipid düşürücü etkisi muhtemelen nispeten daha yüksek bir doz veya daha uzun tedaviler gerektirir.

    NK'nin antihipertansif etkileri
    Natto'nun kan basıncını düşürerek kardiyovasküler hastalıklar üzerinde faydalı bir etkisi olduğu gözlemlenmiştir. Bir in vitro çalışmada, natto'nun, renin-anjiyotensin sisteminde hipertansif bir peptit hormonu olan anjiyotensin II'nin üretiminden sorumlu anahtar bir enzim olan anjiyotensin dönüştürücü enzimi (ACE) baskılayan nispeten güçlü inhibitörler içerdiği bulundu. 43

    2008'de Kim ve arkadaşları 8 , NK takviyesinin prehipertansiyon veya evre 1 hipertansiyon deneklerinde BP üzerindeki etkilerini araştırmak için ilk randomize çift kör, plasebo kontrollü çalışmayı gerçekleştirdi. NK'nin 8 hafta boyunca oral yoldan verilmesi hem sistolik hem de diyastolik KB'de azalma ile sonuçlandı (net değişiklikler sırasıyla -5.55 ve -2.84 mm Hg idi, P  < .05). Sonuçlar, NK'nin hipertansiyonun önlenmesi ve tedavisinde rol oynayabileceğini öne sürdü. 8 Çok yakın zamanda, Jensen ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma 158 hafta boyunca NK tüketiminin, hipertansiyonu olan hastalarda BP'de faydalı değişiklikler ile ilişkili olduğunu öne sürdü. Bu, NK uygulaması ile spontan hipertansif sıçanlarda BP'nin etkili bir şekilde azaldığını gösteren birkaç laboratuvar çalışması ile tutarlıdır. 7 , 44– 47

    NK'nin hipertansif koşullarda kan basıncını düşürme mekanizması açık değildir. Jensen ve arkadaşları 15 çalışmalarında hipertansif hastalarda BP'deki düşüşün plazma renin aktivitesinden bağımsız olduğunu ve ACE'nin NK'nin antihipertansif etkisindeki rolünün biraz tartışmalı olduğunu bulmuşlardır. İnsanlarda yapılan çalışmalar ACE konsantrasyonlarının NK tedavisi alan hastalarda istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermediğini gösterse de, hayvan modellerini kullanan diğer 8 çalışma NK'nin antihipertansif etkisinin anjiyotensin I dönüştürücü enzimin inhibisyonu ile ilişkili olduğunu ileri sürmüştür. 46 Spontan hipertansif sıçanların kullanıldığı bir çalışmada, NK ve onun parçaları, farklı mekanizmalarla hipertansiyonu azaltmıştır. 7Nattokinaz, plazmada fibrinojenin bölünmesi yoluyla BP'yi azaltabilirken, NK fragmanları, sıçanlarda hipertansiyonu baskılamak için plazma anjiyotensin II seviyesinin yükselmesini potansiyel olarak engelledi. 7 Ibe ve diğerleri 47 , natto'nun spontan hipertansif sıçanlarda oral uygulamadan 4 saat sonra BP'yi önemli ölçüde azalttığını ve natto'nun ACE inhibisyonunun doza bağlı olduğunu buldu. B subtilis -fermente güvercin bezelyesinden elde edilen Natto özleri, hipertansif sıçanlarda ACE inhibitör aktivitesini de önemli ölçüde arttırdı. 44

    Antihipertansif ilaçların uzun süreli kullanımıyla ilişkili önemli yan etkiler göz önüne alındığında, 48 NK, KVH'li hastalarda hipertansiyon tedavisi için umut verici bir alternatif olabilir. Bu nedenle, günlük NK kullanımı, hipertansiyon tedavisi için başarılı bir strateji olabilir. 45

    NK'nin antiplatelet/antikoagülan etkileri
    Güçlü bir antikoagülan ajan olarak düşük doz aspirin (günlük 85-100 mg), kalp krizi, felç ve aterotrombotik hastalıkların önlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Aspirin antiplatelet etkisini siklooksijenazı (COX) inhibe ederek ve ardından trombositlerde trombojenik tromboksan A2 (TXA2) sentezini azaltarak gösterir. Bununla birlikte, uzun süreli aspirin kullanımı ciddi gastrointestinal (GI) yan etkiler ve kanama ile birlikte gelir. 49 NK ve aspirinin antiplatelet etkilerini karşılaştıran bir çalışmada, NK'nin in vitro ve in vivo olarak mükemmel antiplatelet agregasyonu ve antitrombotik aktiviteler sergilediği, kolajen ile aktive olan trombositlerden tromboksan B2 oluşumunu inhibe ettiği gösterilmiştir. 12 Wang ve diğerleri 50NK'nin bir serebral iskemik modelde fibrinojen düzeylerini azalttığını bulmuş ve bunun aspirine benzer bir yolak tarafından aracılık edildiği sonucuna varmıştır. Natto, adenosin 5ʹ difosfat ve kollajen tarafından indüklenen trombosit agregasyonu üzerinde mükemmel bir inhibitör etki gösterdi. 25 Ek olarak, NK'nın kırmızı kan hücresi agregasyonunu ve düşük kesme viskozitesini azaltarak pozitif in vitro hemoreolojik etkilere sahip olduğu bulundu. 51

    Yukarıdaki tüm veriler, NK'nin, kan akışının iyileştirilmesi için herhangi bir belirgin yan etkisi olmaksızın iyi bir aday olabileceğini ve muhtemelen aspirinden daha üstün olabileceğini göstermektedir.

    NK'nin nöroprotektif etkileri
    Nattokinase, amiloid fibrillerini nötr pH ve normal vücut sıcaklığında parçalayabilir, bu da Alzheimer hastalığı (AD) gibi amiloid ile ilgili hastalıkların tedavisinde bir rol olduğunu düşündürür. 52 NK'nin amiloidi ayrıştırma yeteneği, NK'nin amiloid ile ilgili bozukluklar için potansiyel bir ilaç adayı olduğunu öne sürdü ve bu, hem in vivo hem de in vitro modelleri içeren yakın tarihli bir çalışmada doğrulandı. 53 AD'nin sıçan modelinde NK'nın oral yoldan verilmesi, AD yolundaki spesifik faktörlerin modülasyonunda olumlu bir etki göstermiştir. 13Kolşisin intoksikasyonu tarafından indüklenen AD'nin bilişsel eksikliklerinin bir sıçan modelinde, NK içeren nano-nutrasötiklerin, bozulmuş öğrenme ve hafıza kapasitesini arttırdığı ve amiloid-β ve BACE-1 aktivitesinin baskılanmasında etkili inhibitörler olduğu gösterildi, bu nedenle, NK'nin bir nöroprotektif etkinliği. 54 Ahmed ve ark . 55 , 360 FU/kg dozunda NK'nin kolinesteraz aktivitesini, TGF-β, IL-6 ve p53 seviyelerini önemli ölçüde azalttığını ve buna Bcl-2 seviyelerinde tedavi edilmemiş bir AD ile karşılaştırıldığında önemli bir artış eşlik ettiğini göstermiştir. kontrol grubu. Verileri, NK'nin nöroprotektif etkisinin, proteolitik, anti-inflamatuar ve antiapoptotik etkilerinden kaynaklandığını ileri sürdü.

    Akut iskemik inmeli hastalarda inme progresyonunun önlenmesinde NK'nin rolünü açıklayan erken klinik çalışmalardan birinde, yazarlar hastalarda net bir nöroprotektif etki gösterdiler. 56 NK'nin nöroprotektif etkileri, bir fototrombotik inme fare modelinde gösterildi. Ahn ve arkadaşları 57 , bir konferans özetinde bildirildiği gibi, iskemik beyindeki nöro-koruyucu etkinin, trombosit agregasyonunu ve tromboz oluşumunu NK tarafından inhibe ederek iyileştirilmiş kan akışı yoluyla indüklendiğini öne sürmüştür. NK'nın oral alımının ayrıca, artan fibrinolitik aktivite yoluyla gerbillerde azalmış enfarktüs hacmiyle kanıtlandığı gibi fokal serebral iskemiye karşı nöroprotektif etkiler sağladığı da gösterilmiştir. 50NK'nin iskemik inmede beyni koruduğu mekanizma ile ilgili olarak, Ji ve ark.14 tarafından yapılan bir çalışma, NK'nin nöroprotektif etkisinin, antiplatelet aktivitesi, antiapoptotik etkisi, vasküler düz kasları gevşetme yeteneği ve endotelyal koruyuculuğu ile ilişkili olduğunu göstermiştir. artan fibrinolitik aktivite yoluyla ve spontan trombolizi kolaylaştırarak.

    Kardiyovasküler sağlık, beyin sağlığı ile yakından bağlantılıdır. KVH risk faktörleri ile bilişsel gerileme ve AD insidansı arasında güçlü bir nedensel ilişki vardır. 58 Bu nedenle, KVH'li hastalarda kullanılan ilaçların nöroprotektif etkileri büyük potansiyele sahiptir ve hastaların genel sonuçlarına fayda sağlayacaktır. Yakın zamanda yapılan preklinik çalışmalarda fokal iskemik inme üzerinde nöroprotektif etkiler gösteren 100'den fazla nöroprotektif ajana rağmen, klinik çalışmalarda hiçbirinin faydalı olduğu kanıtlanmamıştır. 59Bu nedenle, iskemik kalp hastalığı ve felç gibi serebrovasküler hastalıkların tedavisi için kanıtlanmış nöroprotektif etkileri olan daha etkili ilaçlara acilen ihtiyaç vardır.

    NK Klinik İnsan Çalışmaları
    NK son zamanlarda CVD için aday bir ilaç olarak popülerlik kazanmış olsa da, insanlarda NK'nin klinik araştırmaları nispeten sınırlıdır. 1990'da yapılan ilk NK klinik çalışması, oral uygulamadan sonra sağlıklı deneklerde fibrinolitik aktivitesini değerlendirmeyi amaçladı. 6 Başka bir Japon çalışması, akut iskemik inmeli hastalarda inme progresyonunun önlenmesinde NK'nin etkinliğini incelemiş ve oral uygulamadan sonra bu hastalarda açık faydalı etkiler göstermiştir. 56 Gösterildiği gibitablo 1NK veya natto özütünün kullanımını kapsayan 10'dan fazla yayınlanmış klinik çalışma yoktur. Diğer ilgili NK klinik çalışmaları, Kuzey Amerika 15 ve Asya'daki hastalarda antihipertansif etkilerin araştırılmasını içerir . 8 Daha ileri çalışmalar ayrıca anti-aterosklerotik ve lipid düşürücü etkileri, 9 , 42 fibrinolitik aktiviteyi ve insanlarda pıhtılaşma, 6 , 16 ve farmakokinetik 60 ve toksikoloji 61 üzerindeki etkileri içerir . NK klinik çalışmalarının az sayıda olması, muhtemelen NK'nin bir ilaç olarak değil, besin takviyesi olarak kayıtlı olması ve bugüne kadar klinik kanıtların yeterince kesin olmamasıyla ilişkilidir. Tablo 1.


    NK ile ilgili yayınlanmış klinik çalışmaların listesi.
    1990 Japonya 12 fibrinolitik aktivite 3x NK günlük oral uygulama, plazmada fibrinolitik aktivitenin artmasına ve doku plazminojen aktivatörünün üretilmesine neden oldu Sumi ve diğerleri 6
    2004 Japonya 24 iskemik inme NK, akut iskemik inmeli hastalarda net bir nöroprotektif etki göstermiştir. Şah ve diğerleri 56
    2008 Kore 86 Hipertansiyon NK takviyesi, hem sistolik hem de diyastolik KB'de bir azalma ile sonuçlandı ( P  < .05) Kim ve diğerleri 8
    2009 Tayvan 45 Kan pıhtılaşma faktörleri 2 aylık NK tedavisi, fibrinojeni, faktör VII'yi ve umut verici bir kardiyovasküler yararı doğrulayan faktörü önemli ölçüde azalttı Hsia ve diğerleri 17
    2009 Tayvan 30 hiperglisemi 8 haftalık tedaviden (4000 FU) sonra NK grubunda serum kolesterolü, LDL-C ve HDL-C'de bir düşüş gözlendi, ancak fark istatistiksel olarak anlamlı değildi Wu ve diğerleri 42
    2013 Amerika Birleşik Devletleri 11 farmakokinetik NK, tek dozlamadan sonra doğrudan insan kanında ölçülebilir. NK'nin serum seviyeleri yaklaşık 13.3 saat ± 2.5 saatte zirve yaptı Ero ve diğerleri 60
    2015 Japonya 12 Tromboliz ve antikoagülasyon Kan fibrin/fibrinojen bozunma ürünleri (tromboliz ve antikoagülasyon profili), 2000 FU'luk tek bir dozun ardından NK uygulamasından 4 saat sonra önemli ölçüde arttı ( P  < .05), NK'yi tromboz riskini azaltmak için yararlı bir fibrinolitik/antikoagülan ajan olarak destekledi ve İnsanlarda CVD'ler Kurosawa ve diğerleri 16
    2016 Amerika Birleşik Devletleri 79 Hipertansiyon ve von Willebrand faktörü 8 hafta boyunca NK tüketimi, hipertansif hastalarda BP'de faydalı değişikliklere yol açtı. NK tüketen kadın popülasyonunda vWF'de bir azalma görüldü Jensen ve diğerleri 15
    2016 Amerika Birleşik Devletleri 11 Toksikoloji/toksisite 4 hafta boyunca 10 mg/kg/gün NK tüketimi sağlıklı insan gönüllülerde iyi tolere edildi, bu da NK'nin oral tüketiminin düşük toksikolojik endişe kaynağı olduğunu düşündürdü. Lampe ve İngilizce 61
    2017 Çin 76 Ateroskleroz ve hiperglisemi Günlük NK tedavisi (26 hafta için 6500 FU), aterosklerotik plakları olan hastalarda CCA-IMT ve karotis plak boyutunu önemli ölçüde azaltarak aterosklerozun ilerlemesini etkili bir şekilde bastırdı. NK tedavisi, hiperlipidemik hastalarda toplam kolesterol, LDL-C ve trigliseriti azalttı ve HDL-C'yi artırdı Ren ve diğerleri 9
    Ayrı bir pencerede aç
    Kısaltmalar: BP, kan basıncı; CCA-IMT, ortak karotid arter; KVH, kardiyovasküler hastalık; HDL-C, yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol; LDL-C, düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol; NK, nattokinaz.

    Clinical.gov'un bugüne kadar, NK veya natto'nun yaklaşık 10 klinik denemesini yayınlamış olduğu ve en sonuncusu "Nattokinase Aterotrombotik Önleme Çalışması" ( NCT02080520 ) başlıklı, şu anda Üniversitede bir araştırma ekibi tarafından yürütülmekte olduğu belirtilmelidir. Güney Kaliforniya (USC; ayrıntılar https://clinicaltrials.gov adresinde bulunabilir ). Bu çalışmalardan USC'den olan ( NCT02080520 ) oldukça büyük boyutlu bir faz 2 klinik çalışmadır ve bu çalışmanın sonuçlarını bekliyoruz.

    NK'nın etkinliğini, kullanım endikasyonlarını ve kardiyovasküler hastalığı olan hastaları tedavi etmek için kullanılan diğer ilaçlarla birlikte kullanıldığında olası ilaç etkileşimlerini belirlemek için daha fazla insan çalışmasına ihtiyaç vardır.

    Git: NK'nin Avantajları
    Yukarıda belirtildiği gibi, NK'nin avantajları arasında, uzun bir insan tüketimi geçmişine sahip kanıtlanmış bir güvenlik profili, oral uygulama kolaylığı (birçok antitrombotik ilaç enjekte edilebilir), seri üretim kolaylığı ve birçok önemli olumlu kardiyovasküler etkiye sahip olması sayılabilir.

    NK üzerinde çok sayıda klinik araştırmanın yürütülmüş veya yürütülmek üzere onaylanmış olması, insan deneklerde uygulama güvenliğinin iyi bir göstergesidir. Yakın tarihli toksikoloji çalışmaları (hem in vivo hem de in vitro), NK'nın oral tüketiminin güvenliğini güçlü bir şekilde doğrulamıştır ve bu çalışmalar, bugüne kadar NK insan tüketimi için toksikolojik bir endişe olmadığı sonucuna varmıştır. 61 , 62 NK'nin güvenliği, kemirgenlerde ve insan gönüllülerinde yapılan birkaç İyi Laboratuvar Uygulaması (GLP) uyumlu çalışmada kapsamlı bir şekilde değerlendirilmiştir. 61Nattokinazın in vitro olarak mutajenik ve klastojenik olmadığı bulundu ve normalden 100 kat daha yüksek olan 1000 mg/kg/gün'e kadar dozlarda sıçanlarda yürütülen 28 günlük ve 90 günlük subkronik toksisite çalışmalarında herhangi bir yan etki gözlenmedi. İnsanlarda kullanılan doz. İnsan gönüllülerde, 28 gün boyunca günlük 10 mg/kg dozda 4 haftalık NK tüketiminin ardından hiçbir yan etki gözlenmedi. 61 NK tedavisini takiben Ames testinde, kemik iliği hücresi mikronükleus testlerinde veya fare sperm anormalliği testlerinde hiçbir toksisite belirtisi gözlenmedi. Fu ve arkadaşları tarafından yürütülen bir akut toksikoloji çalışmasında, 6230 günlük bir süre boyunca 4 g/kg'a kadar günlük NK dozlarında hiçbir toksisite belirtisi gözlenmemiştir. Tüm bu veriler toplu olarak NK'nin toksikolojik kaygıları çok az olan veya hiç olmayan güvenli bir ürün olduğunu doğrulamaktadır.

    Japonya, Çin, Kore ve Avustralya, Amerika Birleşik Devletleri, Kanada ve Avrupa dahil olmak üzere Batı ülkelerinde, NK ürünleri, kan inceltme, kan pıhtılarının önlenmesi ve dolaşımın iyileştirilmesi dahil olmak üzere sağlığın teşviki için besin takviyeleri olarak tabletler veya kapsüller şeklinde yaygın olarak kullanılmaktadır. . NK takviyelerinin maliyeti nispeten ucuzdur ve 200 ila 400 mg günlük dozların maliyeti, ürünün kaynağına bağlı olarak yaklaşık olarak 0,3 ila 0,8 ABD dolarıdır. NK üretim ve saflaştırma teknolojilerinin ilerlemesiyle, NK'nin maliyetinin düşük kalmaya devam etmesi ve bu da onu ekonomik olarak uygun bir ilaç haline getirmesi beklenmektedir. 28

    NK'nın en büyük avantajlarından biri, oral olarak aktif bir bileşik olarak, KVH'li hastalar için birçok önemli olumlu kardiyovasküler etkiye sahip olmasıdır. Nattokinase, ilaç kullanımını düzene sokma ve KVH önleme ve tedavisinde hasta uyumunu iyileştirme potansiyeline sahiptir.

    Kalan sorunlar
    Yeterince ele alınmayan bir anahtar soru, oral uygulamadan sonra NK'nın kan dolaşımına emilme mekanizmasıdır. Oral doz olarak uygulanan NK'nin biyoyararlanımını ve metabolizmasını gösteren mevcut ikna edici veri yoktur. İlgili tek çalışma, sıçanlarda 80 mg/kg dozunda NK'nın intraduodenal uygulamasının plazmada fibrinojenin bozulmasına yol açtığını gösteren çalışmadır. 63 Kullanılan NK'nin sindirimi kolaylaştıran mide sıvılarına maruz bırakılmadığı ve dozun farmakolojik açıdan yüksek olduğu belirtilmelidir. Bu nedenle, verilerin alaka düzeyi sorgulanabilir. NK'nın farmakokinetiği üzerine yakın zamanda yapılan pilot çalışmalar, NK'nın vücuda nasıl emildiği sorusuna bir cevap vermemiştir. 16 , 60Aslında, farmakokinetik veriler oldukça tutarsızdır ve farmakodinamik aktivitelerle uyumsuzdur. Ero ve arkadaşları 60 , NK'nın doğrudan kendi çalışmalarında ölçüldüğünü ve oral uygulamadan 13.3 saat sonra bir tepe konsantrasyonu ile ölçüldüğünü iddia ederken, başka bir çalışmada ölçülen NK'nin trombolitik aktivitesinin, oral dozlamadan 2 ila 4 saat sonra zirveye ulaştığı gösterilmiştir. 16 Bu veriler, yayınlanmış çalışmalarda NK ölçümlerinin bozulmamış NK molekülünün ölçümleri olmayabileceğini ima etmektedir. NK'nın GI yolunda stabil olduğu varsayılmış olsa da 19 , 28NK'nin vücuda emilim mekanizmasının temel sorusunu daha ikna edici doğrudan kanıtlarla ele almak önemlidir. Aslında, birkaç grup, NK'nin moleküler boyutunun, GI yolu yoluyla oral absorpsiyon için genellikle çok büyük olduğuna dikkat çekmiştir. 19 NK'nin GI yolunda kimyasal oksidasyona ve ardından inaktivasyona veya denatürasyona duyarlı olabileceği kabul edilmektedir. 64 Bu nedenle, NK'nin farmakokinetiğini tam olarak anlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

    İnsanlarda NK kullanımına yönelik potansiyel ilaç etkileşimleri ve kontrendikasyonları şu anda bilinmemektedir. Aspirin ve NK (günde 400 mg) kullanan ve akut serebellar kanama yaşayan bir hastayla ilgili bir rapor mevcuttur. 65 Ek olarak, beyin manyetik rezonans görüntülerinde, kanamaya eğilimli serebral mikroanjiyopatisi olan ve aynı anda aspirin alan hastalarda NK'nin intraserebral kanama riskini artırabileceğini düşündüren çoklu mikro kanamalar gösterilmiştir. 65 Başka bir raporda, bir hastada varfarin olmadan yaklaşık bir yıl NK kullanımından sonra mekanik kapakta trombüs gelişti ve başarılı bir tekrar kapak değişimi yapıldı. 66KVH'li hastalarda aynı anda birden fazla ilacın kullanımı yaygındır. Bu nedenle, NK'nın kardiyovasküler sistem üzerinde etkili olan diğer ilaçlarla olası olası etkileşimlerini aydınlatmak özellikle önemlidir.

    Şu anda inme hastaları için klinik kullanımda olan serin proteazların tümör büyümesi ve metastazıyla ilişkili olduğu gerçeği göz önüne alındığında, 67 , 68 NK kullanımının potansiyel kanserojen etkilerini ve hücre invazivliği üzerindeki etkilerini değerlendirmek için çalışmalar tasarlamak gereklidir. in vitro ve in vivo model sistemleri ve bu bileşikle ilişkili herhangi bir kardiyotoksisitenin varlığını tespit etmek.

    Son sözler
    Son yıllarda NK, yararlı kardiyovasküler sağlık etkileri nedeniyle popülerlik kazanmıştır. NK'nin farmakolojik etkilerini tanımlayan ve NK'nin üretimini ve saflaştırılmasını rafine eden araştırmalar artmaktadır. NK ile ilgili her yıl güncel araştırmaların NK kullanımından kaynaklanan daha olumlu ve olumlu klinik faydalar bulmaya devam ettiğini gözlemlemek özellikle heyecan vericidir. Örneğin, yakın zamanda NK'nin fibrin yıkımı yoluyla nazal polip dokusunu etkili bir şekilde azalttığı gösterilmiştir, 69kronik rinosinüzit tedavisinde potansiyelini gösterir. NK'nin ortaya çıkan resmi, özellikle KVH'li hastalar için birçok olumlu sağlık etkisine sahip benzersiz doğal bileşiklerden biridir. Önemli olarak, NK, KVH'li hastalarda tromboz, hipertansiyon, ateroskleroz, hiperlipidemi, trombosit agregasyonu ve nöroproteksiyon için birkaç önemli olumlu yararı aynı anda etkiler. Hastalara yönelik bu çoklu faydalar, NK'nın rolünü, yaygın olarak geleneksel KVH ilaçlarıyla ilişkili azaltılmış yan etkilerle KVH'nin önlenmesi ve tedavisinde çok benzersiz kılmaktadır. NK'nin benzersiz çoklu işlevlerine ek olarak, hastaya sağladığı diğer avantajlar arasında oral uygulama kolaylığı, sağlam bir güvenlik profili ve uzun bir in vivo yarı ömür yer alır.

    Özetle, geleneksel antitrombotik ve antihipertansif ilaçlarla karşılaştırıldığında NK, yüksek güvenlik, düşük maliyet, basit üretim süreci, ağızdan temin edilebilirlik ve uzun in vivo yarı ömür ile karakterize edilir. Bu nedenle, trombotik bozukluklar veya KVH'ler için yeni nesil bir ilaç olması bekleniyor. İnsan denemeleri ve klinik çalışmalar, klinik ortamlarda NK'nin klinik faydalarını gösterse de, bir takım sınırlamalar mevcuttur. Bununla birlikte, mevcut tüm veriler cesaret verici ve umut vericidir ve KVH tedavisinde tPA, aspirin, varfarin veya daha yeni antikoagülanlara alternatif bir ilaç olarak NK olasılığını tam olarak incelemek için daha fazla klinik araştırmaya ihtiyaç vardır. Yakın gelecekte, KVH'li hastaların, KVH'nin önlenmesi ve yönetimi için uygulanan birden fazla ilacın yerine yalnızca tek bir NK hapına ihtiyaç duyması olasıdır,

    NK'nın CVD'ler için bir ilaç veya ilaç adayı olarak daha geniş çapta kabul görmesi için üstesinden gelinmesi gereken birkaç engel vardır ve bunlar arasında NK'nın insanlarda emilimine ve metabolizmasına ilişkin farmakokinetik kanıtların oluşturulması ve kapsamlı çalışmaların gerekliliği yer almaktadır. Etkilenen hastalarda KVH'nin önlenmesi, tedavisi ve yönetiminde yaygın olarak ve aynı anda kullanılan NK ve diğer kardiyovasküler ilaçlar arasındaki potansiyel ilaç etkileşimlerini aydınlatmak.

    Git: DipnotlaR

    Çatışan çıkarların beyanı: Yazar(lar) bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayınlanması ile ilgili olarak herhangi bir potansiyel çıkar çatışması beyan etmemiştir.

    Finansman: Yazar(lar) bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayınlanması için herhangi bir mali destek almamıştır.

    Yazar Katkıları: YL, incelemenin içeriğini ve yapısını tasarladı ve tasarladı; HC, EM ve YL incelemeyi kaleme aldı, gözden geçirdi ve düzenledi; NR, SL, NN, FS ve XQ makaleyi revize etti ve düzenledi.

    Açıklamalar ve Etik: Yazarlar, ICMJE yazarlık ve çıkar çatışması kriterlerini okudu ve onayladı. Yazarlar ayrıca bu makalenin benzersiz olduğunu ve başka bir yayında yayınlanmadığını ve yayınlanmadığını ve telif hakkıyla korunan herhangi bir materyali çoğaltmak için hak sahiplerinden izin aldıklarını onaylamıştır. Referanslar

    1. Wu Y, Benjamin EJ, MacMahon S. Çin'in hızla değişen ekonomisinde kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi ve kontrolü . sirkülasyon _ 2016; 133 :2545–2560. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    2. Nagata C, Wada K, Tamura T, et al. Japon erişkinlerinde diyet soya ve natto alımı ve kardiyovasküler hastalık mortalitesi: Takayama çalışması . J Clin Nutr mıyım ? 2017; 105 :426–431. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    3. Sumi H, Hamada H, Tsushima H, Mihara H, Muraki H. Natto sebze peynirinde yeni bir fibrinolitik enzim (nattokinase); Japon diyetinde tipik ve popüler bir soya fasulyesi yemeği . deneyim . 1987; 43 :1110–1111. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    4. Urano T, Ihara H, Umemura K, et al. Bacillus subtilis'ten saflaştırılan profibrinolitik enzim subtilisin NAT, plazminojen aktivatör inhibitörü tip 1'i ayırır ve inaktive eder . J Biol Chem . 2001; 276 :24690–24696. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    5. Fujita M, Hong K, Ito Y, Fujii R, Kariya K, Nishimuro S. Sıçanlarda kimyasal olarak indüklenen tromboz modelinde nattokinazın trombolitik etkisi . Biol Ecz Boğa . 1995; 18 :1387-1391. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    6. Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, Hiratani H. Nattokinazların oral yoldan verilmesiyle plazmadaki fibrinolitik aktivitenin arttırılması . Acta Hematol . 1990; 84 :139–143. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    7. Fujita M, Ohnishi K, Takaoka S, Ogasawara K, Fukuyama R, Nakamuta H. Spontan hipertansif sıçanlarda nattokinaz ve fragmanlarının sürekli oral uygulamasının antihipertansif etkileri . Biol Ecz Boğa . 2011; 34 :1696-1701. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    8. Kim JY, Gum SN, Paik JK, et al. Nattokinazın kan basıncı üzerindeki etkileri: randomize, kontrollü bir çalışma . Hipertans Res . 2008; 31 :1583–1588. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    9. Ren N, Chen H, Li Y, McGowan E, Lin Y. Nattokinazın karotid arter aterosklerozu ve hiperlipidemi üzerindeki etkisi üzerine klinik bir çalışma . Nat Med J Çin . 2017; 97 :2038–2042. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    10. Suzuki Y, Kondo K, Matsumoto Y, et al. Fermente soya fasulyesi, natto'nun diyet takviyesi, intimal kalınlaşmayı baskılar ve sıçan femoral arterinde endotelyal yaralanmadan sonra mural trombüsün parçalanmasını modüle eder . Hayat Bilimi . 2003; 73 :1289–1298. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    11. Duan Z, Jiang X, Jiang H, Zhang S, Dong M, Zhao X. Natto ekstraktının antioksidatif aktivitesi ve deneysel hiperlipidemi üzerindeki etkileri üzerine çalışma . Acta Nutrimenta Sinica . 2003; 26 :296–299. [ Google Akademik ]
    12. Jang JY, Kim TS, Cai J, et al. Nattokinase, trombosit agregasyonunu ve trombüs oluşumunu engelleyerek kan akışını iyileştirir . Laboratuvar Animasyon Arş . 2013; 29 :221–225. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    13. Fadl N, Ahmed H, Booles H, Sayed A. Sıçan modelinde Alzheimer hastalığı patofizyolojisini hafifletmek için Serrapeptase ve nattokinase müdahalesi . Hum Exp Toksikol . 2013; 32 :721–735. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    14. Ji H, Yu L, Liu K, et al. Serebral iskeminin korunmasında nattokinaz mekanizmaları . Eur J Pharmacol . 2014; 745 :144–151. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    15. Jensen GS, Lenninger M, Ero MP, Benson KF. Nattokinaz tüketimi, düşük kan basıncı ve bir kardiyovasküler risk belirteci olan von Willebrand faktörü ile ilişkilidir: randomize, çift kör, plasebo kontrollü, çok merkezli bir Kuzey Amerika klinik çalışmasının sonuçları . Entegre Kan Basıncı Kontrolü . 2016; 9 :95-104. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    16. Kurosawa Y, Nirengi S, Homma T, et al. Tek doz oral nattokinaz, tromboliz ve pıhtılaşma önleyici profilleri güçlendirir . Bilim Temsilcisi 2015; 5 :11601. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    17. Hsia CH, Shen MC, Lin JS, et al. Nattokinaz, insan deneklerde plazma fibrinojen, faktör VII ve faktör VIII düzeylerini düşürür . Nutr Res . 2009; 29 :190–196. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    18. Tai MW, Tatlı BV. Trombozun önlenmesi için Nattokinase . J Health Syst Ecz . 2006; 63 :1121–1123. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    19. Milner M, Makise K. Natto ve aktif bileşeni nattokinase: güçlü ve güvenli bir trombolitik ajan . Alternatif Tamamlayıcı Terapi . 2002; 8 :157-164. [ Google Akademik ]
    20. Wang P, Chen J, Chen H. Nattokinazın saflaştırılması ve in vitro trombolitik etkileri . Çene Eczanesi J. 2005; 39 :1669-1671. [ Google Akademik ]
    21. Kamiya S, Hagimori M, Ogasawara M, Arakawa M. Bir sıçan modelinde nattokinazın karagenan kaynaklı kuyruk trombozu üzerindeki etkisinin in vivo değerlendirme yöntemi . Acta Hematol . 2010; 124 :218–224. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    22. Yang M, Mei Y, Liang Y. Nattokinaz ekstraksiyonunun anti-tromboz işlevi üzerindeki etkisi . Gıda Bilimi Teknol . 2013; 38 :197–200. [ Google Akademik ]
    23. Sumi H, Yanagisawa Y, Yatagai C, Saito J. Oral fibrinolitik ajan olarak Natto Bacillus : nattokinaz aktivitesi ve Bacillus subtilis natto'nun yutma etkisi . Gıda Bilimi Teknol Arş . 2004; 10 :17–20. [ Google Akademik ]
    24. Omura K, Hitosugi M, Zhu X, Ikeda M, Maeda H, Tokudome S. Bacillus subtilis natto'dan hem antitrombotik hem de fibrinolitik etkileri olan yeni türetilmiş bir protein . J Pharmacol Sci . 2005; 99 :247–251. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    25. Park KJ, Kang JI, Kim TS, Yeo IH. Natto'nun hiperkolesterolemi sıçanlarında antitrombotik ve fibrinolitik etkisi . Önceki Nutr Gıda Bilimi . 2012; 17 :78-82. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    26. Yatagai C, Maruyama M, Kawahara T, Sumi H. İnsan hücrelerinden Nattokinaz destekli doku plazminojen aktivatör salınımı . Patofizyol Hemost Tromb . 2009; 36 :227–232. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    27. Weng Y, Yao J, Sparks S, Wang KY. Nattokinase: kardiyovasküler hastalığın önlenmesi için oral bir antitrombotik ajan . Int J Mol Sci . 2017; 18 : E523 . [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    28. Dabbagh F, Negahdaripour M, Berenjian A, et al. Nattokinase: üretim ve uygulama . Appl Mikrobiol Biyoteknoloji . 2014; 98 :9199–9206. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    29. Tjarnlund-Wolf A, Brogren H, Lo EH, Wang X. Plazminojen aktivatör inhibitörü-1 ve trombotik serebrovasküler hastalıklar . felç . 2012; 43 :2833–2839. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    30. Raskob GE, Angchaisuksiri P, Blanco AN, et al. Tromboz: küresel hastalık yüküne önemli bir katkıda bulunan . Arterioscler Tromb Vasc Biol . 2014; 34 :2363–2371. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    31. Denemeciler FT. Şüpheli akut miyokard enfarktüsünde fibrinolitik tedavi endikasyonları: 1000'den fazla hasta üzerinde yapılan tüm randomize çalışmalardan erken mortalite ve majör morbidite sonuçlarına ortak bir bakış . Lancet . 1994; 343 :311-322. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    32. Lusis AJ. ateroskleroz _ Doğa . 2000; 407 :233–241. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    33. Suzuki Y, Kondo K, Ichise H, Tsukamoto Y, Urano T, Umemura K. Fermente soya fasulyesi ile diyet takviyesi, intimal kalınlaşmayı bastırır . beslenme _ 2003; 19 :261–264. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    34. Chang CH, Chen KT, Lee TH, et al. Bir sıçan modelinde natto özütünün endotel hasarı üzerindeki etkileri . Acta Medica Okayama . 2010; 64 :399–406. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    35. Iwai K, Nakaya N, Kawasaki Y, Matsue H. Natto'nun antioksidan işlevleri, bir tür fermente soya fasulyesi: kolesterolle beslenen sıçanlarda LDL oksidasyonu ve lipid metabolizması üzerindeki etkisi . J Tarım Gıda Kimya . 2002; 50 :3597–3601. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    36. Kang SJ, Lim Y, Kim AJ. Nattokinaz ile kombine edilmiş Kore kırmızı ginsengi, yüksek kolesterolle beslenen tavşanlarda dislipidemiyi ve aort plakları alanını iyileştirir . Gıda Bilimi Biyoteknoloji . 2014; 23 :283–287. [ Google Akademik ]
    37. Meng F, Xue F, Shi H. Nattokinazın ateroskleroz model sıçanda kan lipidi ve kan reolojisi üzerindeki etkileri . Çene J Laboratuvar Teşhisi . 2013; 17 :1567–1569. [ Google Akademik ]
    38. Xie S, Yu Z, Liu X. Nattokinazın hazırlanması ve hipolipidemik etkisi üzerine çalışma . Çene J Biochem Ecz . 2015 ;35:17–20. [ Google Akademik ]
    39. Zhang Y, Hu XF, Li WP. Nattokinaz ekstraksiyonunun tavşanların deneysel hiperlipidemisi üzerindeki etkileri . Çene J Travma Engelli Med . 2010; 4 :49–51. [ Google Akademik ]
    40. Yuan S. Deneysel hiperlipidemi sıçanlarında nattokinazın serum lipidini azaltma üzerindeki etkisi . Modern Hastaneler . 2005; 5 :10–12. [ Google Akademik ]
    41. Duan Z, Jiang X, Jiang H, Zhang S, Dong M, Zhao X. Antioksidatif aktivite ve natto ekstraktının deneysel hiperlipidemi üzerindeki etkileri üzerine çalışma . Acta Nutrimenta Sinica . 2004; 26 :296–299. [ Google Akademik ]
    42. Wu DJ, Lin CS, Lee MY. Primer hiperkolesterolemili hastalarda nattokinazın lipid düşürücü etkisi . Acta Cardiologica Sinica . 2009; 25 :26–30. [ Google Akademik ]
    43. Okamoto A, Hanagata H, Kawamura Y, Yanagida F. Fermente soya fasulyesindeki anti-hipertansif maddeler, natto . Bitki Besinleri Hum Nutr . 1995; 47 :39-47. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    44. Lee BH, Lai YS, Wu SC. Bacillus subtilis ( natto ) ile fermente edilmiş güvercin bezelyesinin antioksidasyonu, anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibisyon aktivitesi, nattokinaz ve antihipertansiyonu . J Gıda İlaç Anal . 2015; 23 :750–757. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    45. Suwanmanon K, Hsieh PC. γ-aminobütirik asit ve nattokinaz ile zenginleştirilmiş fermente fasulyelerin kendiliğinden hipertansif ve normotansif Wistar-Kyoto sıçanlarının kan basıncı üzerindeki etkisi . J Gıda İlaç Anal . 2014; 22 :485–491. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    46.​​Murakami K, Yamanaka N, Ohnishi K, Fukayama M, Yoshino M. Bir Japon geleneksel fermente gıdası olan natto'da subtilisin NAT (nattokinase) tarafından anjiyotensin I dönüştürücü enzimin inhibisyonu . Yemek Fonksiyonu . 2012; 3 :674-678. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    47. Ibe S, Yoshida K, Kumada K, Tsurushiin S, Furusho T, Otobe K. Geleneksel bir Japon fermente gıdası olan natto'nun kendiliğinden hipertansif sıçanlarda antihipertansif etkileri . Gıda Bilimi Teknol Arş . 2009; 15 :199–202. [ Google Akademik ]
    48. Weber MA, Schiffrin EL, White WB, et al. Toplumda hipertansiyon yönetimi için klinik uygulama kılavuzları . J Clin Hipertansiyon . 2014; 16 :14–26. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    49. Antitrombotik Deneme Uzmanlarının İşbirliği. Yüksek riskli hastalarda ölüm, miyokard enfarktüsü ve inmenin önlenmesi için antiplatelet tedavisinin randomize çalışmalarının ortak meta-analizi . BMJ . 2002; 324 :71–86. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    50. Wang JM, Chen HY, Cheng SM, Chen SH, Yang LL, Cheng FC. Nattokinase, beyin enfarktüsü, fibrinojen ve aktive kısmi tromboplastin süresini serebral iskemi-reperfüzyon hasarına karşı azaltır . J Gıda İlaç Anal . 2012; 3 :686-691. [ Google Akademik ]
    51. Pais E, Alexy T, Holsworth J, Ralph E, Meiselman HJ. Pro-fibrinolitik bir enzim olan nattokinazın kırmızı kan hücresi agregasyonu ve tam kan viskozitesi üzerindeki etkileri . Clin Hemorheol Microcirc . 2006; 35 :139–142. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    52. Hsu RL, Lee KT, Wang JH, Lee LY, Chen RP. Bacillus subtilis natto'dan nattokinazın amiloid bozunma kabiliyeti . J Tarım Gıda Kimya . 2008; 57 :503–508. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    53. Metkar SK, Girigoswami A, Murugesan R, Girigoswami K. Serratiopeptidaz aracılı in vitro ve in vivo insülin amiloid bozunması . Mater Sci Müh C Mater Biol Uyg . 2017; 70 :728–735. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    54. Bhatt PC, Pathak S, Kumar V, Panda BP. Fermente soya fasulyesi nanonutrasötik ile Alzheimer hastalığının bilişsel eksikliklerinin hayvan modelinde nörodavranışsal ve nörokimyasal anormalliklerin zayıflaması . inflamatuar farmakoloji . 2017; 26 :105-118. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    55. Ahmed HH, Nevein NF, Karima A, Hamza AH. Mucize enzimler serrapeptaz ve nattokinaz, deneysel modelde Alzheimer hastalığı ile ilişkili nöroinflamasyonu ve apoptozu hafifletir . WJPPS . 2013; 3 :876-891. [ Google Akademik ]
    56. Shah AB, Rawat S, Mehta S. Akut iskemik inmede moleküler ağırlıklı heparin ve anti-trombositlere ek bir oral fibrinolitik ajan olan natto kinazların güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için açık bir klinik pilot çalışma . Japonya İlaç Tedavisi . 2004; 32 :437–451. [ Google Akademik ]
    57. Ahn YJ, Kim MH, Kim J, et al. Fototrombotik inmede trombosit agregasyonu ve trombozun inhibisyonunun aracılık ettiği nattokinazın nöroprotektif etkisi . felç . 2015; 46 : APW262 . [ Google Akademik ]
    58. Stampfer MJ. Kardiyovasküler hastalık ve Alzheimer hastalığı: ortak bağlantılar . J Stajyer Med . 2006; 260 :211–223. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    59. Kaur H, Prakash A, Medhi B. İnmede ilaç tedavisi: klinik öncesi çalışmalardan klinik çalışmalara . farmakoloji _ 2013; 92 :324–334. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    60. Ero MP, Ng CM, Mihailovski T, Harvey NR, Lewis BH. Tek, oral, günlük bir dozun ardından insanlarda nattokinazın serum farmakokinetiği üzerine bir pilot çalışma . Alternatif Ther Sağlık Med . 2013; 19 :16–19. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    61. Lampe BJ, İngilizce JC. Bacillus subtilis var'dan türetilen nattokinazın toksikolojik değerlendirmesi . natto . Gıda Kimyasal Toksikol . 2016; 88 :87-99. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    62. Fu YS, Li YL, Zhang Y. Nattokinaz kapsülünün güvenliğine ilişkin toksikolojik güvenlik değerlendirmesi . Prac Prev Med . 2012;19:1714–1716. [ Google Akademik ]
    63. Fujita M, Hong K, Ito Y, et al. Nattokinazın sıçan bağırsak yolu boyunca taşınması . Biol Ecz Boğa . 1995; 18 :1194–1196. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    64. Weng M, Zheng Z, Bao W, Cai Y, Yin Y, Zou G. Subtilisin nattokinazın oksidatif stabilitesinin, Escherichia coli'de eksprese edilen bölgeye yönelik mutajenez ile arttırılması . Biochim Biophys Açta . 2009; 1794 :1566–1572. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    65. Chang YY, Liu JS, Lai SL, Wu HS, Lan MY. Serebral mikro kanamalı bir hastada nattokinaz ve aspirinin birlikte kullanılmasıyla tetiklenen serebellar kanama . Stajyer Med . 2008; 47 :467-469. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    66. Elahi MM, Choi CH, Konda S, Shake JG. Aort kapağının mekanik bir protezle değiştirilmesinden sonra hastanın warfarin yerine nattokinaz ikamesinin sonucu . Proc (Bayl Univ Med Cent) . 2015; 28 :81-82. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    67. Tang L, Han X. Meme kanseri invazyonu ve metastazında ürokinaz plazminojen aktivatör sistemi . Biyomed Farmakoter . 2013; 67 :179-182. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    68. Placencio VR, DeClerck YA. Kanserde plazminojen aktivatör inhibitörü-1: gelecekteki terapötik testler için mantık ve içgörü . Kanser Araş . 2015; 75 :2969-2974. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    69. Takabayashi T, Imoto Y, Sakashita M, et al. Nattokinase, profibrinolitik enzim, nazal polip dokusunu etkili bir şekilde küçültür ve mukusun viskozitesini azaltır . Allergol Int . 2017; 66 :594-602. [ PubMed ] [ Google Akademik ]

  • #2
    Enflamasyon, oksidatif stres ve pıhtılaşma arasındaki kısır döngüyü kırmak, LPS kaynaklı inflamasyonu ve oksidatif stresi inhibe ederek nattokinazın yeni bir anti-trombüs anlayışı

    Hao Wu , a Ying Wang , a Yupeng Zhang , a Feng Xu , a Jiepeng Chen , b Lili Duan , b Tingting Zhang , a Jian Wang , c, ∗∗ ve Fengjiao Zhang a, ∗
    Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk Reddi
    Bu makale, PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır . İlişkili Veriler

    Ek Malzemeler
    Git: Soyut


    Tromboz, dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedeni olan kardiyovasküler hastalığın başlıca nedenidir; bununla birlikte, geleneksel anti-trombotik yaklaşım, kapsamlı klinik yönetim ve izlemeye rağmen sıklıkla kanama komplikasyonlarına yol açar. Enflamasyon ve pıhtılaşma arasındaki yoğun karışma ve ayrıca ROS'un hem enflamasyona hem de pıhtılaşmaya katkıda bulunan rolü göz önüne alındığında, korunmuş anti-enflamatuar ve anti-oksidatif stres aktiviteleri ile daha güvenli anti-trombotik ajanın geliştirilmesi oldukça arzu edilir. Nattokinase (NK), güçlü trombolitik ve antikoagülan aktiviteleri nedeniyle kardiyovasküler sistem üzerinde birçok faydalı etkiye sahiptir. Burada, NK'nin farelerde sadece ksilen kaynaklı kulak ödemini etkili bir şekilde önlemediğini gösterdik, fakat aynı zamanda, iltihabın başlaması ve ilerlemesinde merkezi bir oyuncu olan iltihabı ve oksidatif stresi sınırlayarak farelerde LPS'nin neden olduğu akut böbrek hasarına karşı da dikkate değer bir şekilde korunmuştur. Büyüleyici bir şekilde, in vivo verilerimizle uyumlu olarak, NK, LPS kaynaklı TLR4 ve NOX2 aktivasyonunu baskılayarak RAW264.7 makrofajlarında belirgin anti-inflamatuar aktivite ortaya çıkardı, böylece ilgili ROS üretimini, MAPK aktivasyonunu ve NF-KB translokasyonunu baskıladı. aktive makrofaj hücrelerinde TNF-α, IL-6, NO ve PAI-1 gibi proinflamatuar mediatörlerin ekspresyonuna aracılık ettiği çekirdeğe sitoplazma. Özellikle, makrofaj çalışmaları ile uyumlu olarak, NK, LPS tarafından indüklenen serum PAI-1 seviyelerini belirgin şekilde inhibe etti, böylece endotoksin ile tedavi edilen hayvanların glomerüllerinde fibrin birikmesini bloke etti. Özetle,

    Anahtar Kelimeler: Nattokinase, TRL4, NOX2, Enflamasyon, Oksidatif stres, Trombüs
    Git: grafik soyut



    Resim 1


    1. Giriş
    Büyük bilimsel gelişmelere rağmen, kardiyovasküler hastalıklar dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Gerçekten de, tromboz üç ana kardiyovasküler bozukluğun başlıca nedenidir: kalp krizleri, felç ve venöz tromboembolizm. Fibrin pıhtılarını parçalamak için trombolitik ilaçların (örn., tPA) uygulanması, trombotik olaylar için en yaygın ve tercih edilen tedavidir; bununla birlikte, bu yaklaşım, kapsamlı klinik tedaviye rağmen sıklıkla ciddi kanama komplikasyonlarına yol açar [ 1 ]. Bu nedenle, klinikte etkili ve güvenle kullanılabilecek anti-trombotik yaklaşımın belirlenmesinde zorlu bir zorluk devam etmektedir.

    Tarihsel olarak, trombüs çözünürlüğünün tromboliz ile elde edildiğine inanılıyordu, ancak artan kanıtlar, inflamasyon ve pıhtılaşma sistemleri arasında geniş bir çapraz konuşmaya işaret ediyor, bu sayede inflamasyon, sessiz katil, trombozu ve dolayısıyla trombozu uyaran pıhtılaşmanın aktivasyonuna yol açıyor. trombosit aktivasyonu, fibrin oluşumu ve fizyolojik antikoagülan yolaklar seviyelerinde meydana gelen iltihabı önemli ölçüde destekler [ [2] , [3] , [4]]. Örneğin, sepsis sırasında, patojenlerden ve aktive edilmiş bağışıklık hücrelerinden türetilen inflamatuar aracılar, sistemik bir pıhtılaşma aktivasyonuna yol açan sistemik inflamatuar yanıtı uyarır. Organ hasarının nihai kapsamı, yalnızca bakteriyel LPS'nin neden olduğu birincil hasara değil, aynı zamanda ardından gelen vasküler trombo-inflamatuar yanıtın boyutuna da bağlıdır. Şiddetli olduğunda, trombo-enflamasyon sistemik olarak yayılabilir ve uzak organlara, özellikle böbreklere AKI ve hatta ölüme yol açan hasar verebilir [ 5]. Bununla birlikte, bu tek yönlü bir süreç olmaktan ziyade, her iki sistem de yakından etkileşime girer, bu sayede pıhtılaşma faktörleri (trombin gibi) veya antikoagülan proteinler, mononükleer hücreler veya endotelyal hücreler üzerindeki spesifik hücre reseptörlerini aktive edebilir, bu da sitokin üretimini teşvik edebilir ve önemli bir amplifikasyon oluşturur. döngü. Özellikle, hem inflamasyonun hem de pıhtılaşmanın başlangıcında ve ilerlemesinde oksidatif stres vurgulanmıştır [ [6] , [7] , [8]]. Bu ortamda, bu sistemlerden birine yönelik spesifik tedaviler yerine hem pıhtılaşma, oksidatif stres hem de inflamasyonun eşzamanlı modülasyonunun trombotik bozuklukların tedavisinde daha başarılı olacağını önermek mantıklıdır. Bu nedenle, korunmuş anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres fonksiyonu ile daha güvenli anti-trombotik ajan geliştirmek oldukça arzu edilir.

    NK, geleneksel Japon yemeği Natto'dan bir serin proteazdır ve trombolitik ve antikoagülan aktivitelerinden dolayı birçok kardiyovasküler faydalı etkiye sahiptir [ 9 , 10 ]. Bir klinik deney, NK'nın oral tüketiminin herhangi bir yan etki ile ilişkili olmadığını göstermiştir [ 11 ]. Bu görüş doğrultusunda, yakın zamanda hiçbir genotoksisite göstermediğini ve farelerde maksimum günlük toleranslı NK dozunun, insanlar için önerilen günlük doza kıyasla 1000 kat daha fazla olduğunu bildirdik .]. Yine de, NK'nın hızlandırılmış tromboz oluşumunu önleyecek anti-enflamasyon ve/veya anti-oksidatif stres kapasitesine sahip bir anti-trombüs ajanı olarak umut vaat edip etmediği açık değildir. Bu çalışmada, NK'nin trombolitik ve antikoagülan aktivitelerine ek olarak, makrofajlarda LPS aracılı TLR-4 ve NOX2 sinyalleşmesini inhibe ederek anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres aktivitelerini ortaya çıkardığını ve LPS ile uyarılan AKI'ye karşı koruduğunu kanıtladık. farelerde glomerül trombüsünün yanı sıra, inflamasyon, oksidatif stres ve tromboz arasındaki bağlantıyı kırarak NK'nın yeni bir anti-trombüs anlayışı.

    2. Malzemeler ve yöntemler
    2.1. kimyasallar ve tepkimeler
    Nattokinase, Sungen Biotech Co., Ltd.'den temin edilmiştir. Lipopolisakkaritler (LPS), 2',7'-Diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH2-DA) ve Hoechst 33258'in tamamı Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD) elde edilmiştir. Duefflbecco'nun modifiye edilmiş kartal ortamı (DMEM) ve fetal sığır serumu (FBS), Life Technologies/Gibco Laboratories'den (Grand Island, NY, ABD) elde edildi. p-IκB-α (AF2002), P65 (AF0874), P38 (AF6455), ERK (AF0155), TRAF6 (AF5376), NRF2 (AF0639), p-AKT (AF0016), AKT (AF6261) ve β için antikorlar -aktin (T0022), Affinity bioscience'dan (Cincinnati, OH, ABD) elde edildi. p-JNK (ab130943), p-ERK (abs130614), p-P38 (abs131122) ve JNK (abs131832) antikorları Absin Bioscience Co., Ltd.'den (Shanghai, Çin) satın alındı. IκB-a (sc-1643) ve P47 (SC-365215) için antikorlar Santa Cruz Biotechnology, INC'den elde edildi. (Bergheimer Heidelberg Almanya). Ve ücretli benzeri reseptör 4 (TLR4, GB11519) ve NOX-2/gp91 (GB11391) antikorları Servicebio Co., Ltd.'den (Wuhan, Çin) elde edildi. Fibrinogen Alpha zincir antikoru Cloud-Clone Corp'tan satın alındı. Keçi anti-tavşan IgG (H + L) HRP (S0001) ve keçi anti-fare IgG (H + L) HRP (S0002), Affinity Science'dan ( Cincinnati, OH, ABD). 2.2. Hayvanlar


    Hem 6 haftalık Kunming fareleri (erkek, 18-22 g ağırlığında) hem de 6 haftalık sıçanlar (erkek, 180-220 g ağırlığında) Shenyang Eczacılık Üniversitesi (Shenyang, Çin) Deney Hayvanları Merkezinden elde edildi ve 12 L: 12 D aydınlık/karanlık döngüsünde standart barınma koşulları altında, yiyecek ve suya serbest erişim ile korunur. Hayvan deneyleri, Shenyang Eczacılık Üniversitesi'ndeki hayvan tesisinin yönergelerine uygun olarak tasarlanmış ve kurumsal etik kurul tarafından onaylanmıştır ve kullanılan hayvan sayısını ve bu çalışmada kullanılan prosedürlerin neden olduğu acıyı en aza indirmek için yapılmıştır. Tüm deneyler ve prosedürler, Laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirildi.

    2.3. Sıçan periton makrofajlarının hücre kültürü ve izolasyonu
    Murin makrofaj (RAW264.7) hücre çizgisi, Çin Bilimler Akademisi'nin (Şanghay, Çin) Hücre Bankasından elde edildi. Hücreler, bir inkübatörde % 5 C02'den oluşan nemli bir atmosfer altında 37 °C'de %10 FBS ile desteklenmiş DMEM içinde kültürlendi . Tüm deneyler, 5 ila 20 numaralı pasaj hücreleri kullanılarak yapıldı.

    6 haftalık erkek sıçanlardan (Shenyang Farmasötik Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezinden elde edilen) sıçan yerleşik peritoneal makrofajları daha önce tarif edildiği gibi hazırlandı [ 13 ]. Kısaca, periton hücreleri, 10 mL DMEM ile periton boşluğunun lavajıyla toplandı. Bu hücreler 2 saat inkübe edildi ve yapışmayan hücreler üç kez PBS ile yıkanarak çıkarıldı. Yapışan hücreler peritoneal makrofajlar olarak kullanıldı. İzole edilmiş peritoneal makrofajlar, nemlendirilmiş % 5 CO2 atmosferinde %10 FBS ile takviye edilmiş DMEM içinde 37°C'de kültürlendi .

    2.4. Farelerin ksilen kaynaklı kulak ödemi
    Fareler rastgele beş gruba ayrıldı (grup başına n = 6): kontrol grubu, ksilen model grubu ve NK ile tedavi edilen gruplar (3500, 7000 ve 14000 FU/kg). Hayvanlara , ksilen uygulamasından bir hafta önce belirtilen dozlarda NK veya ddH20 oral olarak uygulandı . Sağ kulak yüzeyine 30 dakika süreyle ksilen (30 µl) sürülür. Sol kulaklar tedavi edilmedi ve kontrol olarak kullanıldı. Hayvanlar, anestezi altında insanca kurban edildi ve iki kulak delgisi (8 mm, id) toplandı ve tartıldı. Sağ kulak delgisinin ağırlığındaki artış ile sol kulak delgisinin ağırlığındaki artış karşılaştırılarak ödem değerlendirildi.

    2.5. Farelerde LPS kaynaklı akut böbrek hasarı (AKI)
    LPS ile indüklenen AKI modeli, hafif modifikasyonlarla daha önce tarif edildiği gibi oluşturulmuştur [ 14 ]. NK'nin LPS ile indüklenen AKI üzerindeki etkisini gözlemlemek için, fareler rastgele beş gruba ayrıldı (grup başına n = 10): kontrol grubu, (LPS + salin) grubu, (LPS + NK 3000 FU/kg) grubu, (LPS + NK 6000 FU/kg) grubu ve (LPS + NK 9000 FU/kg) grubu. Kontrol ve (LPS + salin) grubuna tek intraperitoneal (ip) salin veya LPS (10 mg/kg) enjeksiyonu yapıldı. (LPS + NK) gruplarında, tüm hayvanlara 12 saat boyunca LPS ile zorlamadan önce 1 saat boyunca NK ile intraperitoneal olarak doz verildi. Tüm fareler insanca kurban edildi. GSH, MDA, GSH-px, TNF-ɑ, IL-6 ve PAI-1 düzeylerini ölçmek için kan örnekleri alındı. Histopatoloji için böbrek örnekleri alındı.

    2.6. Histopatolojik değerlendirme
    Dokular, oda sıcaklığında 72 saat boyunca %4 poliformaldehit ile sabitlendi. Dehidrasyondan sonra dokular parafine gömüldü. Daha sonra doku kesitleri kesildi ve hematoksilen-eozin (H&E) ile boyandı. Patolojik değişiklikler gözlendi ve bir ışık mikroskobu kullanılarak kaydedildi.

    2.7. Enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA)
    Hücre kültürlerinin süpernatanları veya belirtilen fare serumu toplandı. TNF-α, IL-6, t-PA ve PAI-1 seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre (Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü, Nanjing Şehri, Çin) ELISA kullanılarak ölçüldü. Tüm ölçümler üç kopya halinde yapıldı.

    2.8. MDA ve GSH seviyelerinin yanı sıra GSH-px aktivitesinin ölçümleri
    MDA ve GSH seviyeleri ile GSH-px aktiviteleri, üreticilerin talimatlarına göre (Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü, Nanjing Şehri, Çin) özel tahlil kitleri kullanılarak analiz edildi.

    2.9. Nitrit tayini ve MTT tahlili
    NO üretimi, Griess reaktifi kullanılarak ortamdaki nitrit (NO 2 - ) (NO metabolizmasının kararlı bir son ürünü) birikiminden tahmin edildi. Kısaca, eşit miktarlarda kültür süpernatanı ve Griess reaktifi (%5 fosforik asit içinde %1 sülfanilamid ve damıtılmış su içinde %0.1 a-naftiletilendiamin dihidroklorür) karıştırıldı ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. Reaksiyon, bir mikroplaka okuyucuda (Microplate Reader Benchmark, Bio-Rad, CA, ABD) 540 nm'de ölçüldü. MTT tahlili için hücrelere orijinal kültür hacminin onda birine eşit olacak şekilde MTT stok solüsyonu (5 mg/mL) ilave edildi ve 4 saat inkübe edildi. Mor MTT formazan, DMSO ile çözündürüldü ve mikroplaka okuyucu (492 nm) ile ölçüldü.

    2.10. immünofloresan
    RAW264.7 hücreler (1.0 × 105 hücreler/kuyu), 24 oyuklu plakalarda cam lamel üzerine ekildi ve 24 saat büyütüldü. Hücreler, belirtilen zaman noktaları için LPS (0.1 ug/ml) ile zorlamadan önce 1 saat boyunca NK (0.3 FU/ml) ile ön işleme tabi tutuldu. Hücreler PBS ile yıkandı ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlendi. Daha sonra hücreler, 15 dakika boyunca %1 BSA ve %0.1 Triton X-100 içeren PBS içinde geçirgenleştirildi ve 30 dakika süreyle %1 BSA ile bloke edildi. Daha sonra hücreler, 4 °C'de gece boyunca spesifik primer antikorlarla inkübe edildi, ardından keçi Anti-Rabbit lgG H&L (FITC) (ab6717, abcom) veya keçi Anti-Mouse lgG (H + L) Alexa Fluor 594-konjuge (S0005) ile inkübasyon yapıldı. , Affinity) karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat süreyle. Ek yıkamalardan sonra hücreler, 10 dakika boyunca Hochest montaj ortamı ile boyandı. Floresan sinyalleri konfokal mikroskopla analiz edildi.

    2.11. Western blot tahlili
    Hücreler 62.5 mM Tris-HCl (pH6.8), %2 SDS, %10 gliserol, proteaz ve fosfataz inhibitör kokteylleri içeren SDS lizis tamponunda homojenize edildi ve Bio-Rad protein tahlil kiti (Bio-Rad) kullanılarak protein konsantrasyonları belirlendi. Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD). Numuneler, SDS-poliakrilamid jellerinde çözüldü ve poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına (EMD Millipore, Billerica, MA) aktarıldı. Zarlar, %0.1 Tween 20 (TBS-T) içeren Tris tamponlu tuzlu su içinde %5 yağsız süt ile bloke edildi, ardından gece boyunca 4 °C'de birincil antikor ile inkübe edildi. Yıkamaların ardından, membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaban turpu peroksidazı ile birleştirilmiş ikincil antikor ile inkübe edildi. İmmünoblotlar, geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) reaksiyonu (Pierce, Thermo Scientific, Rockwell, IL) ve bir ChemiDoc XRS Sisteminde (BioRad, Hercules, CA) görüntülendi. Protein ekspresyonundaki değişiklikleri ölçmek için, seviyeler şu şekilde hesaplandı: (hedef proteinin immünoreaktif yoğunluğu)/(iç kontrolün immünoreaktif yoğunluğu) Image J yazılımı kullanılarak.

    2.12. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) belirlenmesi
    RAW264.7 hücreleri, 24 saat boyunca 1 x 105 hücre/ml yoğunluğa sahip 6 oyuklu plakalarda kültürlendi . Hücreler, 24 saat boyunca LPS'ye (0.1 μg/ml) maruz kalmadan önce çeşitli NK konsantrasyonları ile işlendi. Daha sonra hücreler karanlıkta 37 °C'de 30 dakika DCFH2-DA (5 uM) ile boyandı. PBS ile yıkandıktan sonra floresan sinyalleri konfokal mikroskopta analiz edildi. Floresan yoğunluğu, Image Pro Plus kullanılarak ölçülmüştür. Deneyler üç kez tekrarlandı.

    2.13. NK'yi TLR4'e yerleştirme
    NK'nin neden olduğu azalmış TLR4 içeriğinin olası moleküler mekanizmalarını araştırmak için, protein-protein kenetlenmesi, bağlanma serbest enerji hesaplaması ve moleküler dinamik (MD) simülasyonları dahil olmak üzere in silico stratejileri kullanıldı. Hem TLR4 hem de NK yapıları, NK için PDB kodu 5gl8 ve TLR4 için PDB kodu 2z64 ile protein veritabanı bankasından (PDB) [ 15 ] alındı . Protein-protein kenetleme simülasyonundan önce, protein yapıları Schrödinger paketindeki protein hazırlama sihirbazı ile hazırlandı ve OPLS-2005 [ 17 ]'nin dosyalanan kuvveti ile kısıtlı minimizasyon ile rafine edildi. Daha sonra hazırlanan protein yapıları HawkDock çevrimiçi sunucusuna (http://cadd.zju.edu.cn/hawkdock/ ) protein-protein yerleştirme için [ 18 ]. Hesaplama sürecinde TLR4 reseptör, NK ligand olarak ayarlanmış ve ilk 10 docking sonucu moleküler mekanik-genelleştirilmiş Born yüzey alanı (MM-GBSA) algoritması ile hesaplanan bağlanma serbest enerjilerine göre yeniden sıralanmıştır [ 19 ]. ]. İlk 10 protein kompleksi, bağlanmayan etkileşimler oluşturan temas eden yüzeyde yer alan kalıntıları saptamak için Discovery Studio 3.0 ile analiz edildi. Ayrıca, hem bağlanma modu hem de bağlanma serbest enerjisinin seçim kriterlerini karşılayan protein kompleksleri, Desmond 3.8 ile fizyolojik bir koşul altında stabilitelerini değerlendirmek için MD simülasyonuna yansıtıldı [ 20 ].]. Ve protein kompleksleri, su molekülleri için basit nokta yükü (SPC) modeliyle doldurulmuş ortorombik kutulara gömüldü ve uygun karşılaşma iyonları eklenerek nötralize edildi, bunlar daha sonra maksimum 5000 yineleme ile minimize edildi. Küçültülmüş sistemler 100 ns'lik bir MD'ye tabi tutuldu. varsayılan olarak ayarlanmış parametrelerle simülasyonlar. Her sistemdeki proteinlerin ortalama kare sapmaları (RMSD), MD simülasyonunun tüm süresi boyunca referans olarak ilk çerçeve ile hesaplandı. Ayrıca iki sistemin serbestlik derecesi, toplam enerjisi ve potansiyel enerjisi de hesaplanmıştır.

    2.14. Yara iyileştirici çizik tahlili
    RAW 264.7 hücreleri ilk önce bir birleşik hücre mono-katmanı oluşturmak için 6 oyuklu plakalarda 37 °C, %5 CO2 ve %95 nemde 24 saat kuluçkalandı . Daha sonra hücre tek tabakası boyunca bir p10 ucu çizilerek kuyunun merkezinde bir yara yapılmıştır. Hücre süpernatanları çıkarıldı ve daha sonra hücreler PBS ile yıkandı ve çeşitli konsantrasyonlarda (0.08, 0.15 ve 0.30 FU/mL) NK, ardından LPS (0.1 ug/ml) uyarımı ile işlendi. Yaraya hücre göçü, aynı yerde, önce (zaman 0) ve 24 saatlik inkübasyondan sonra mikrografi ile izlendi. Mikrograflar, bilgisayarlı bir görüntü yakalama sistemiyle birleştirilmiş, faz kontrastlı ters ışık mikroskobu ile elde edildi. Hücre göçü, zaman 0'a göre 24 saatlik inkübasyondan sonra içeriye doğru göç eden hücrelerin sayısı sayılarak değerlendirildi.

    2.15. Nötr kırmızı fagositoz tahlili
    RAW 264.7 hücreleri, NK (0.08, 0.15, 0.30 FU/ml) ile işlemden ve 24 saat boyunca LPS (0.1 ug/ml) ile zorlamadan önce 24 saat boyunca 96 oyuklu bir plakaya ekildi. Daha sonra her bir oyuğa %0.1 nötr kırmızı solüsyon (100 µl, 10 mmol/L PBS içinde çözülmüş) ilave edildi ve 4 saat yeniden inkübe edildi. Süpernatanlar atıldı ve hücreler PBS ile yıkandı, ardından 100 uL hücre lizis tamponu [etanol: glasiyal asetik asit = 1:1, (h/h)] eklendi ve sarılmış nötr kırmızıyı çıkarmak için 2 saat inkübe edildi. 540 nm'de absorbans değerleri mikroplaka okuyucu kullanılarak elde edildi.

    2.16. Farelerde LPS kaynaklı glomerüler tromboz modeli
    LPS ile indüklenen fare glomerüler tromboz modeli, hafif modifikasyonlarla daha önce tarif edildiği gibi oluşturulmuştur [ 21 ]. NK'nin LPS ile indüklenen glomerüler tromboz üzerindeki etkisini gözlemlemek için, fareler rastgele beş gruba ayrıldı (n = 10 grup başına): kontrol grubu, (LPS + salin) grubu, (LPS + NK 3000 FU/kg) grubu, ( LPS + NK 6000 FU/kg) grubu ve (LPS + NK 9000 FU/kg) grubu. Kontrol ve (LPS + salin) grubuna tek intraperitoneal (ip) salin veya LPS (0.5 mg/kg) enjeksiyonu yapıldı. (LPS + NK) gruplarında, tüm hayvanlar 1 saat boyunca NK ile intraperitoneal olarak ön işleme tabi tutuldu, ardından 12 saat boyunca LPS ile mücadele edildi. Bütün hayvanlar insanca kurban edildi. PAI-1 ve t-PA düzeylerini ölçmek için kan örnekleri alındı. İmmünohistokimyasal analiz için böbrek örneklerinin parçaları alındı.

    2.17. fibrin immünohistokimyası
    İmmünohistokimyasal analiz için böbrek kesitleri deparafinize edildi ve endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için 15 dakika boyunca %3 hidrojen peroksit solüsyonu ile işleme tabi tutuldu. Spesifik olmayan bağlanma bölgeleri Ultra V Block reaktifi ile bloke edildi, ardından gece boyunca 4 °C'de PBS içinde 1:100 oranında seyreltilmiş anti-fibrin(ojen) IgG ile inkübasyon yapıldı. Bir yıkama adımından sonra kesitler, streptavidin ile konjuge olan ikincil antikor (keçide üretilen biyotinlenmiş bir anti-tavşan IgG) ile inkübe edildi. Kromojenik reaksiyon, kesitler %0.05 diaminobenzidin solüsyonu ve %0.2 hidrojen peroksit ile inkübe edilerek geliştirildi. Reaksiyonun ilerlemesi ışık mikroskobu ile izlendi ve slaytlar yıkanarak durduruldu. Son olarak kesitler hematoksilen ile karşıt boyandı.

    2.18. istatistiksel analiz
    Tüm değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz, Windows için SPSS 17.0 yazılımı (SPSS Inc., Chicago, IL, ABD) kullanılarak yapıldı. İki deney grubu arasındaki farkı karşılaştırmak için Student t testi kullanılırken, üç veya daha fazla grup arasındaki farklılıkları karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA ve ardından çoklu karşılaştırma testleri (LSD) kullanıldı. Gruplar arasındaki varyans homojen değilse Dunnett's T3 testi yapıldı. Anlamlılık düzeyi p < 0.05 olarak kabul edildi.

    Git: 3. Sonuçlar
    3.1. NK, farelerde ksilen kaynaklı kulak ödemine ve LPS kaynaklı AKI'ye karşı etkili bir şekilde korunmuştur
    NK'nin anti-inflamatuar potansiyelini araştırmak için farelerde iki tip inflamasyon modeli kullanıldı. Ksilen ile indüklenen kulak ödemi modelinde, NK'nin oral yoldan uygulanmasının farelerde kulak ödemini doz bağımlı olarak azalttığı bulundu (1A), NK'nin in vivo olarak akut inflamasyonu belirgin şekilde bastırdığını gösterir. Alternatif olarak, LPS, proinflamatuar sitokinlerin üretimini uyarmadaki önemli rolü nedeniyle AKI'ye yol açan en önemli faktörler arasındadır [ 22 ]; bu nedenle LPS ile indüklenen AKI modeli daha sonra NK'nin sistemik inflamatuar yanıt üzerindeki etkisini incelemek için kullanıldı. H&E boyama ile yansıtıldığı gibi, böbrek dokuları kontrol hayvanlarında normal böbrek tübüllerini ortaya çıkardı, oysa LPS tedavisi glomerulusun atrofisine, tübüler yapıların tahrip olmasına ve NK tedavisi ile dikkate değer bir şekilde hafifletilen epitel hücrelerinin kaybına neden oldu (1B). Buna paralel olarak, NK, TNF-α gibi LPS ile indüklenen inflamatuar sitokin seviyelerini doza bağımlı olarak azalttı (1C) ve IL-6 (1D). Aynı zamanda, serumda MDA düzeylerinde ortaya çıkan artışın yansıttığı gibi, LPS yüklemesinin oksidatif stresi tetiklediği gözlendi (1E), lipid peroksidasyon belirteci ve ayrıca GSH'nin tükenmesi (1F) ve GSH-px seviyeleri (1G), LPS ile indüklenen bozuklukların ortaya çıkmasında oksidatif stresin anahtar rolünü yansıtır [ 23 ]. Not olarak, NK ön tedavisi sadece serum MDA seviyelerini önemli ölçüde azaltmakla kalmadı (1E), aynı zamanda LPS ile tedavi edilen hayvanlardakilerle karşılaştırıldığında GSH ve GSH-px seviyelerini önemli ölçüde arttırdı (1F ve G). Buna göre, NK, en azından kısmen, inflamasyonu ve oksidatif stresi sınırlayarak LPS'nin neden olduğu AKI'ye karşı etkili koruma sergiledi. Birlikte, bu veriler, NK'nin dikkate değer bir anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres etkinliğini gösterdi.
    1
    Ayrı bir pencerede aç
    1
    NK, farelerde ksilen kaynaklı kulak ödemini azalttı ve LPS kaynaklı AKI'ye karşı korudu .
    (A) NK'nin farelerde ksilen kaynaklı kulak ödemi üzerindeki etkileri. Kulak ödemine ksilen neden oldu. Fareler, sağ kulakta 30 dakika boyunca ksilen (30 ul) ile uyarılmadan önce 1 hafta boyunca NK (3500, 7000 ve 14000 FU/kg, ig) ile önceden dozlanmıştır. Kulak ağırlığı yöntem bölümünde anlatıldığı gibi ölçülmüştür. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edildi. ***P < 0,001 kontrole karşı; ## P < 0.01, ###P < 0,001, ksilen grubuna karşı (n = 6). (B) NK'nin farelerde LPS ile indüklenen AKI üzerindeki etkisi. Farelere, 12 saat boyunca LPS (10 mg/kg, ip) stimülasyonundan 1 saat önce araç veya NK (3000, 6000 ve 9000 FU/kg, ip) ile ön doz verildi. Histopatolojik inceleme için böbrek dokuları kesildi ve H&E ile boyandı. Alternatif olarak, kan örnekleri toplandı ve serumdaki TNF-a (C) ve IL-6 (D), ELISA kitleri kullanılarak belirlendi. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edildi. *P < 0.05, **P < 0.01 ve kontrol grubu; # P < 0.05 ve LPS grubu. (E) Farelerde LPS ile indüklenen AKI'de NK'nin MDA, GSH ve GSH-px seviyeleri üzerindeki etkisi. Serumdaki MDA içeriği (E), GSH seviyeleri (F) ve GSH-px içeriği (G), ayrı test kitleri kullanılarak belirlendi. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edildi. *P < 0.05, kontrol grubuna karşı; #P < 0.05 ve LPS grubu (n = 10).

    3.2. NK, hem RAW264.7 hem de sıçan primer peritoneal makrofaj hücrelerinde LPS kaynaklı nitrik oksit (NO) salınımını önemli ölçüde bastırdı
    NK'nin in vivo anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres etkinliği, altta yatan moleküler temelini in vitro olarak daha fazla aydınlatmak için aşamamızı oluşturdu. Makrofajlar klasik olarak LPS gibi proinflamatuar uyaranlar tarafından aktive edilir ve proinflamatuar bir geçişe yol açar ve bu anahtarın merkezinde, reaktif üretimine katkıda bulunan büyük miktarlarda NO üreten indüklenebilir nitrik oksit sentazın (iNOS) ifadesi bulunur. nitrojen türleri [ 24 ]. Bunun ışığında, NK'nin makrofaj hücrelerinde LPS ile indüklenen NO salınımı üzerindeki etkisini test ederek NK'nin anti-inflamatuar potansiyelini araştırmaya karar verdik. RAW264.7 hücreleri açısından, NK'nin konsantrasyona bağlı bir modelde LPS ile uyarılan NO seviyelerini belirgin şekilde bastırdığı bulundu (İncir. 2A). Bu arada, gösterildiği gibiİncir. 2B, NK, RAW264.7 makrofajın hücre canlılığını etkilemedi. Benzer şekilde, NK'nin sıçan primer peritoneal makrofajlarında hücre canlılığını etkilemeden LPS ile indüklenen NO seviyelerini doz bağımlı olarak azalttığı gözlendi (İncir. 2C ve D). Toplu olarak, bu bulgular NK'nin hem RAW 264.7 hem de sıçan primer peritoneal makrofajlarında LPS ile indüklenen NO salınımını baskıladığını ve makrofaj hücrelerinde NK'nin umut verici bir anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres potansiyelini ortaya koyduğunu gösterdi.
    İncir. 2
    Ayrı bir pencerede aç
    İncir. 2
    NK, hem RAW264.7 hem de sıçan primer peritoneal makrofaj hücrelerinde LPS kaynaklı NO salınımını inhibe etti. (A) NK'nin RAW264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen NO üretimi üzerindeki etkisi. Hücreler, 24 saat boyunca LPS (0.1 ug/ml) stimülasyonundan önce 1 saat boyunca belirtilen konsantrasyonlarda NK veya deksametazon (2 uM) ile inkübe edildi. Daha sonra, Griess tahlili kullanılarak nitrit seviyelerini belirlemek için ortam toplandı. (B) NK'nin RAW264.7 hücrelerinin hücre canlılığı üzerindeki etkisi. Hücre canlılığı MTT tahlili ile belirlendi. (C) Sıçan primer peritoneal makrofajında ​​NK'nin LPS ile indüklenen NO üretimi üzerindeki etkisi. Hücreler, 24 saat boyunca LPS (0.1 ug/ml) stimülasyonundan önce 1 saat boyunca belirtilen konsantrasyonlarda NK veya deksametazon (2 uM) ile inkübe edildi. Daha sonra, Griess tahlili kullanılarak nitrit seviyelerini belirlemek için ortam toplandı. (D) NK'nin sıçan birincil peritoneal makrofajlarının hücre canlılığı üzerindeki etkisi. Hücre canlılığı MTT tahlili ile belirlendi. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder. **p < 0.01, ***p < 0,001, kontrole karşı;## p < 0.01, ### p < 0,001, LPS ile uyarılan hücrelere karşı.

    3.3. NK, RAW264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen NF-κB aktivasyonunu ve aşağı akış proinflamatuar mediatör üretimini verimli bir şekilde inhibe etti
    NF-κB, çeşitli immün ve inflamatuar süreçleri düzenleyen çok sayıda geni aktive eden bir transkripsiyon faktörüdür [ 25 ]. NK'nin makrofajdaki anti-inflamatuar etkisini doğrulamak için, NK'nin RAW 264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen NF-KB aktivasyonu üzerindeki etkisi ayrıca araştırıldı. Tipik olarak, NF-KB aktivasyonuna IκB-α'nın fosforilasyonu ve hızlı bozunması aracılık eder, ardından NF-KB'nin proinflamatuar genlerin transkripsiyonunu aktive ettiği çekirdeğe translokasyonu gelir [ 26 ]. Bu bağlamda, LPS'nin, konsantrasyona bağlı bir modelde NK tarafından önemli ölçüde inhibe edilen IκB-α fosforilasyonu ve bozulmasını indüklediği gösterildi (Şekil 3A). Benzer çizgiler boyunca, LPS'nin NF-KB'nin çekirdeğe yer değiştirmesini uyardığı ortaya çıktı (Şekil 3B), burada proinflamatuar genlerin transkripsiyonunu aktive etti ve böylece TNF-α gibi aşırı proinflamatuar sitokin seviyelerine yol açtı (Şekil 3C) ve IL-6 (Şekil 3D). Büyüleyici bir şekilde, NK, NF-κB translokasyonunu etkileyici bir şekilde ortadan kaldırdı (Şekil 3B) ve ayrıca aşırı TNF-α seviyelerini önemli ölçüde azalttı (Şekil 3C) ve IL-6 (Şekil 3D) RAW264.7 hücrelerinde LPS tarafından indüklenir. Birlikte, bu veriler, NK'nin, makrofaj hücrelerinde NK'nin anti-enflamatuar etkinliğini doğrulayarak, RAW264.7 makrofajlarında LPS ile indüklenen NF-KB aktivasyonunu ve aşağı akış pro-inflamatuar aracıların üretimini verimli bir şekilde inhibe ettiğini gösterdi. Bu nedenle, in vivo anti-inflamatuar etkinliğe ek olarak NK, in vitro olarak da dikkate değer bir anti-inflamatuar aktivite sergiledi.
    Şekil 3
    Ayrı bir pencerede aç
    Şekil 3
    NK, RAW264.7 hücrelerinde LPS kaynaklı NF-KB aktivasyonunu inhibe etti . (A) NK'nin RAW264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen IκBa aktivasyonu üzerindeki etkisi. Hücreler, 6 saat boyunca LPS'ye (0.1 ug/ml) maruz bırakılmadan önce 1 saat boyunca NK (0.08, 0.15 ve 0.30 FU/mL) ile ön işleme tabi tutuldu. Toplam hücre lizatlarının eşit miktarları yüklendi ve immünoblot analizine tabi tutuldu. β-aktin, eşit protein yüklemesi ve protein bütünlüğü için kontrol olarak kullanıldı. **P < 0.01, Kontrole karşı; # P < 0.05, ##P < 0.01, vs. LPS ile uyarılan hücreler. (B) NK'nin RAW264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen P65 nükleer-çevirisi üzerindeki etkisi. Hücreler, 1 saat boyunca NK (0.30 FU/mL) ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından 6 saat boyunca LPS'ye (0.1 μg/mL) maruz bırakıldı. İmmünofloresan analizi yapıldı. P65 proteini yeşil floresan ile işaretlendi ve çekirdek Hochest ile maviye boyandı. Ölçek çubuğu: 40 μm. (C) NK'nin RAW264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen TNF-a salınımı üzerindeki etkisi. Hücreler, 24 saat boyunca LPS (0.1 ug/mL) stimülasyonundan önce 1 saat boyunca NK (0.08, 0.15, 0.30 FU/mL) ile ön işleme tabi tutuldu. ELISA ile TNF-a seviyesini saptamak için hücre süpernatanı toplandı. (D) NK'nin RAW264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen IL-6 salınımı üzerindeki etkisi. Hücreler, 24 saat boyunca LPS (0.1 ug/mL) stimülasyonundan önce 1 saat boyunca NK (0.08, 0.15, 0.30 FU/mL) ile ön işleme tabi tutuldu. ELISA ile IL-6 seviyesini saptamak için hücre süpernatanı toplandı. **p < 0.01, ***p < 0.# p < 0.05, ## p < 0.01 , ### p < 0.001, LPS ile uyarılan hücrelere karşı. (Bu şekil açıklamasında renk referanslarının yorumlanması için okuyucuya bu makalenin Web versiyonuna başvurulur.)

    3.4. NK, RAW264.7 hücrelerinde LPS kaynaklı ROS oluşumunu ve NOX2 aktivasyonunu bastırdı
    Proinflamatuar aracılara ek olarak, inflamasyonun başlaması ve ilerlemesinde oksidatif stres vurgulanır [ 6 ]. Gerçekten de LPS, NF-KB aktivasyonunda önemli bir rol oynayan makrofaj hücrelerinde ROS oluşumunu hızla indükler [ 27 ]. Bu nedenle, NK'nin makrofaj hücrelerinde LPS kaynaklı ROS üretimi üzerindeki etkisini daha da araştırdık. tasvir edildiği gibi4A, LPS'ye maruz kalma, ROS'un hücre içi seviyesini önemli ölçüde arttırdı; bununla birlikte, NK (0.08, 0.15 ve 0.30 FU/mL) ile ön tedavi, bu birikimi konsantrasyona bağlı bir şekilde önemli ölçüde ortadan kaldırdı ve bu, in vivo çalışmalarımızla iyi bir şekilde desteklendi (1ÖRNEĞİN). Bu görüş doğrultusunda, oksidatif stresin ana hücresel sensörü olan Nrf2 [ 28 ], benzer şekilde NK konsantrasyonuna bağlı olarak inhibe edilen LPS'ye maruz kalmada yukarı regüle edildi (Şekil 3B). Bu arada, ROS ve NF-κB arasında önemli bir sinyal köprüsü olan AKT, makrofaj hücrelerinde NK tarafından dramatik olarak ortadan kaldırılan LPS tedavisine yanıt olarak da aktive edildi (Şekil 3B).
    4
    Ayrı bir pencerede aç
    4
    NK, RAW264.7 hücrelerinde LPS kaynaklı ROS oluşumunu ve NOX2 aktivasyonunu bastırdı .
    (A) NK'nin RAW 264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen ROS üretimi üzerindeki etkisi. Hücreler, 1 saat boyunca NK (0.30 FU/ml) ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından 24 saat boyunca LPS'ye (0.1 μg/mL) maruz bırakıldı. Hücre içi ROS, konfokal mikroskopi altında yeşil göründü (Ölçek çubuğu 40 um'dir) ve yeşil floresan yoğunluğu Image Pro Plus ile ölçüldü. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder. Ortalama floresan yoğunluğu, LPS tedavi hücrelerine standardize edildi. **P < 0.01, kontrole karşı; ## P < 0.01, ###P < 0,001, LPS ile uyarılan hücrelere karşı. (B) NK'nin RAW264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen Nrf2 ve AKT aktivasyonu üzerindeki etkisi. Hücreler, 1 saat boyunca NK (0.08, 0.15, 0.30 FU/mL) ile ön işleme tabi tutuldu ve daha sonra 6 saat boyunca LPS (0.1 ug/mL) ile uyarıldı. Toplam hücre lizatlarının eşit miktarları yüklendi ve immünoblot analizine tabi tutuldu. β-aktin, eşit protein yüklemesi ve protein bütünlüğü için kontrol olarak kullanıldı. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder. *P < 0.01, kontrole karşı; # P < 0.05, ##P < 0.05, vs. LPS ile uyarılan hücreler. (C) NK'nin immünofloresan deneyi yoluyla LPS ile indüklenen P47 translokasyonu üzerindeki etkisi. Hücreler, 2 saat boyunca LPS (0.1 ug/mL) uyarımından önce 1 saat boyunca NK (0.30 FU/ml) ile ön işleme tabi tutuldu. Anti-NOX2 (yeşil) ve anti-p47phox (kırmızı) ile çift immün boyama yapıldı; çekirdekler Hochest (mavi) ile boyandı. Ölçek çubukları: 40 μm. (Bu şekil açıklamasında renk referanslarının yorumlanması için okuyucuya bu makalenin Web versiyonuna başvurulur.)

    Aslında, NADPH oksidaz (NOX-2/gp91phox), makrofajlarda ROS ve oksidatif stresin ana kaynağıdır [ 29 ]. Bu senaryo ile uyumlu olarak, LPS'nin p47phox'un sitozolden membrana hızlı translokasyonunu desteklediği gözlemlendi (4C), burada ROS üreten aktif bir kompleks halinde birleştiler (4A). İlginç bir şekilde, NK ön işlemi, LPS ile indüklenen NOX2 aktivasyonunu dikkate değer bir şekilde bastırdı (4C), NK'nin RAW264.7 makrofaj hücrelerinde LPS kaynaklı ROS üretimini ortadan kaldırmasının altında yatan mekanizmayı en azından kısmen tasvir eder. Toplu olarak, bu veriler NK'nin makrofaj hücrelerinde LPS kaynaklı oksidatif strese karşı koruyucu etkisini destekledi.

    3.5. NK, muhtemelen RAW264.7 hücrelerinde TRL4 proteolizini teşvik ederek LPS kaynaklı TLR4 aktivasyonunu azalttı
    Gerçekten de NOX2 ile birlikte TLR4 sinyali makrofajlarda NF-KB aktivasyonu ve ROS üretimi için gereklidir [ 27 , 30 ]. Özellikle TLR4, inflamatuar yanıtın yanı sıra doğal ve edinilmiş bağışıklığa aracılık eden LPS için kritik sinyal alıcısıdır. LPS stimülasyonu üzerine dimerleşir ve TRAF6 devreye girer, IRAK1-TRAF6 kompleksi TAB2/TAB3 ve TAK1'i fosforile eder ve böylece NF-KB ve MAPK'leri aktive ederek, proinflamatuar sitokinleri serbest bırakarak patojene özgü doğal bir bağışıklık tepkisine yol açar [ 31 ] . Bu nedenle, LPS'nin, konsantrasyona bağlı bir düzende NK tarafından belirgin şekilde bastırılan TLR4 ve TRAF6 seviyelerini önemli ölçüde arttırdığı gözlendi (Şekil 5A). MAPK sinyallemesi açısından, LPS'nin, RAW264.7 hücrelerinde doza bağımlı olarak kısıtlanmış p-JNK1/2, p-ERK1/2 ve p-p38'in gelişmiş seviyeleri tarafından yansıtıldığı gibi MAPK'leri önemli ölçüde aktive ettiği bulundu. NK tedavisi (Şekil 5A). Toplu olarak, bu veriler NK'nin RAW264.7 hücrelerinde LPS kaynaklı TRL4 aktivasyonunu etkili bir şekilde azalttığını gösterdi.
    Şekil 5
    Ayrı bir pencerede aç
    Şekil 5
    NK, muhtemelen RAW264.7 hücrelerinde TRL4 proteolizini teşvik etmesi nedeniyle LPS kaynaklı TLR4 aktivasyonunu azalttı .
    (A) NK'nin LPS ile indüklenen TLR4 sinyal yolları üzerindeki etkisi. Hücreler, 1 saat boyunca belirtilen konsantrasyonlarda NK ile ön işleme tabi tutuldu ve daha sonra 12 saat boyunca LPS'ye (0.1 μg/mL) maruz bırakıldı. Toplam hücre lizatlarının eşit miktarları yüklendi ve immünoblot analizine tabi tutuldu. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder. (B) NK, RAW264.7 hücrelerinde serin proteaz aktivitesi yoluyla TRL4 bozulmasını indükledi. Hücreler, belirtilen zaman noktaları için NK (0.3 FU/mL) ile 30 dakika boyunca PMSF ön muamelesi ile veya onsuz muamele edildi. Toplam hücre lizatlarının eşit miktarları yüklendi ve immünoblot analizine tabi tutuldu. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder. *P < 0.05, **P < 0.01 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında; #NK 12h grubuna kıyasla P < 0.05, ## P < 0.05; NK 24h grubuna kıyasla $ P < 0.05, $$ P < 0.05.

    NK'nin [ 12 ] serin proteaz aktivitesi göz önüne alındığında, makrofaj hücrelerinde TLR4 proteolizini teşvik edip etmeyeceğini ayrıca araştırdık. İlginç bir şekilde, NK inkübasyonu, RAW264.7 makrofajlarında TLR4 seviyelerinde zamana bağlı bir azalmaya aracılık etti (Şekil 5B). Not olarak, PMSF (güçlü bir serin proteaz inhibitörü), NK kaynaklı TLR4 proteolizini konsantrasyona bağlı bir şekilde önemli ölçüde tersine çevirdi (Şekil 5B), NK'nin serin proteaz aktivitesi yoluyla TLR4 bozulmasını desteklediğini öne sürer. Ayrıca, NK ve TLR4 arasındaki etkileşim modlarını aydınlatmak için moleküler yerleştirme yapıldı. Özetle, Hawkdock web sitesinden toplam 100 protein-protein yerleştirme verisi elde edildi ve TLR4 ve NK'nin ilk 10 kompleksi daha fazla analiz edildi. Tablo S1 (ek verilerde), MM-GBSA algoritması tarafından hesaplanan bağlanma serbest enerjilerinin yanı sıra bağ olmayan etkileşim bilgilerini listelemiştir. Ayrıca, bunların bağlanma modları ve karşılık gelen bağlanma serbest enerjisinin bozunmaları, Şekiller'de gösterildiği gibi analiz edildi. S1–S10ek malzemede. Bağlanma serbest enerjisinin ve NK'nin rapor edilen katalitik bölgesinin kapsamlı bir değerlendirmesinden sonra, daha fazla değerlendirme için model 3 seçildi (Şekil 6A). Kısaca, iki proteinin bağlanma yüzeyi arasında, elektrostatik etkileşimler, hidrojen bağı etkileşimleri, klasik olmayan hidrojen bağı etkileşimleri ve hidrofobik etkileşim dahil olmak üzere dört tip bağ olmayan proteinler arası etkileşim vardı.Şekil 6B). Aslında, Thr133, Ser105 ve Ser 130 gibi bu katılan NK tortuları, NK'nin rapor edilen temel substrat bağlama tortuları ile iyi bir şekilde desteklenmiştir [ 32 ] (Şekil 6B). Ayrıca, NK-TLR4 kompleksi için bağlanma serbest enerjisi -18.9 kcal/mol idi, Van geyiği Waals kompleksin yapısal stabilitesine en çok katkıda bulundu (Şekil 6C). Özellikle, kompleks oluşumunda rol oynayan önemli kalıntılar, NK'nin Arg60, Tyr157, Phe36, Glu108, Thr83, Asp238, Gln185 ve Asn241'inde ve TLR4'ün Thr255, Arg249, Lys12, Gln185 Ser183, Asn184 ve Thr240'ında yatmaktadır (Şekil 6C). Ek olarak, kompleksin kararlılığı MD simülasyonları ile doğrulandı. Açıklandığı gibiŞekil 6D, kompleks 30 ns içinde dengeye kolayca ulaştı ve en az 100 ns'ye kadar iyi korundu, bu da NK ve TLR4'ün RAW264.7 makrofajlarında TLR4 proteolizini kolaylaştıracak nispeten kararlı bir kompleks oluşturduğunu doğruladı. Toplu olarak, bu birleştirilmiş veriler, NK'nin, RAW264.7 makrofajlarında TLR4 proteolizini teşvik etmesi nedeniyle muhtemelen LPS kaynaklı TLR4 aktivasyonunu azalttığını göstermiştir. Gerçekten de, bu bulgu, NK'nin RAW264.7 hücrelerinde LPS ile indüklenen Nrf2 aktivasyonunu etkili bir şekilde inhibe ettiği Nrf2 verileriyle iyi bir şekilde desteklenmiştir (4B), bunda, NK doğrudan TLR4 bozulmasını teşvik etti (Şekil 5) ve ayrıca RAW264.7 hücrelerinde dikkat çekici şekilde bastırılmış NOX2 aktivasyonu (4), böylece LPS kaynaklı ROS oluşumunu ve karşılık gelen Nrf2 aktivasyonunu azaltır.
    Şekil 6
    Ayrı bir pencerede aç
    Şekil 6
    Protein-protein yerleştirme taramasından seçilen TLR4-NK kompleksinin analizi . (A) Protein kompleksinin bağlanma modu. TLR4 mavi ile temsil edildi ve NK pembe ile gösterildi. (B) TLR4 ve NK arasındaki kalıntı çiftlerinin etkileşim türleri ayrıntılı olarak gösterilmiştir. (C) Protein kompleksinin toplam bağlanma enerjisinin yanı sıra, MM/GBSA yöntemleriyle hesaplanan −1.0 kcal/mol'den daha iyi toplam enerjiyle temas eden kalıntı çiftleri. (D) Protein kompleksinin alfa karbon atomlarının, omurga atomlarının, yan zincir atomlarının ve ağır atomlarının RMSD değerleri, 100 ns MD simülasyonu boyunca dalgalandı. (Bu şekil açıklamasında renk referanslarının yorumlanması için okuyucuya bu makalenin Web versiyonuna başvurulur.)

    3.6. NK, LPS ile geliştirilmiş makrofaj göçünü ve fagositozu bastırdı
    Patojenlere ve inflamasyon bölgelerine göç, makrofaj hücrelerinin immün/inflamatuar etkilerinin çoğunu yerine getirmesi için gereklidir. NK'nin makrofaj migrasyonu üzerindeki etkisini daha fazla test etmek için yara iyileşme testi yapıldı [ 33 ]. Da gösterildiği gibi7A, NK, konsantrasyona bağlı bir şekilde göçlerini önemli ölçüde inhibe etti. Ayrıca, NK'nin makrofaj hücrelerinin fagositik aktivitesi üzerindeki etkisini aydınlatmak için fagositoz tahlili yapıldı. Resimde gösterildiği gibi7B, LPS, konsantrasyona bağlı bir düzende NK tarafından iptal edilen makrofajın fagositoz kabiliyetini önemli ölçüde arttırdı. Bu veriler, NK'nin, işlev açısından makrofaj hücrelerinde NK'nin anti-inflamatuar etkinliğini doğrulayan LPS ile geliştirilmiş makrofaj göçünü ve fagositozu baskıladığını ileri sürdü.
    7
    Ayrı bir pencerede aç
    7
    NK, LPS kaynaklı makrofaj hücre göçünü ve fagositozu baskıladı. (A) NK, RAW264.7 hücrelerinde LPS kaynaklı hücre göçünü inhibe etti. Hücre göçü tahlili, 24 saat boyunca çeşitli NK konsantrasyonlarının varlığında veya yokluğunda LPS (0.1 ug/mL) ile veya onsuz muamele edilmiş RAW264.7 hücrelerinde gerçekleştirildi. Mikrograflar hemen başlangıçta (0 saat) ve 24 saatte elde edildi. Noktalı çizgiler, 0 h süresi içinde çevrelenen yoldaki ("yara") kenarları temsil eder. 24 saat sonra yolda bulunan hücreler, göç eden hücreler olarak kabul edildi. Ölçek çubuğu 200 μm'yi temsil eder. Hücre sayıları ImageJ yazılımı kullanılarak analiz edildi. (B) NK, RAW264.7 hücrelerinde LPS kaynaklı fagositozu inhibe etti. Hücreler, 24 saat boyunca LPS (0.1 μg/mL) ile zorlamadan önce 1 saat boyunca NK (0.3 FU/mL) ile ön işleme tabi tutuldu. Daha sonra hücreler, 4 saat boyunca nötr kırmızı ile inkübe edildi, ardından fagositik leke çıkarıldı ve 540 nm'de mikroplaka okuyucu ile ölçüldü. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder. *p < 0.05, ***p < 0.001 ve kontrol;## P < 0.01, ### P < 0.001 LPS grubuna kıyasla.

    3.7. NK, farelerde LPS kaynaklı glomerüler trombüslere karşı etkili bir şekilde korunmuştur
    Artan kanıtlar, inflamasyon, oksidatif stres ve pıhtılaşma arasındaki yoğun karışmayı destekledi; Bu senaryo ile uyumlu olarak, LPS, hem insanların hem de deney hayvanlarının fibrinolitik sistemini derinden değiştirir, sıklıkla prokoagülan bir duruma yol açar ve histolojik olarak çeşitli organlarda mikrovasküler fibrin birikimi ile karakterize edilir, bunlar arasında böbreğin fibrin tarafından yaralanması diğer organlardan daha olasıdır. yüksek derecede vasküler doğası nedeniyle birikim [ 21 , 34 ]. Bu bağlamda, NK'nin etkileyici anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres etkinliği göz önünde bulundurularak farelerde LPS ile indüklenen glomerül trombüsü oluşumu üzerindeki NK'nin etkisini ayrıca araştırdık [ [35] , [36] , [37] ,[38] ]. İmmünohistokimya değerlendirmelerinde gösterildiği gibi, LPS, tedavi edilen hayvanların glomerüllerinde belirgin fibrin birikimine neden oldu (Şekil 8A) trombüs oluşumunda inflamasyonun kritik rolüne destek veren, akut böbrek yetmezliğinin önde gelen nedenidir. Not olarak, NK (6000 FU/kg ve 9000FU/kg, ip), endotoksin ile tedavi edilen hayvanların glomerüllerinde fibrin birikmesini, kırmızı okla gösterildiği gibi doza bağlı bir düzende önemli ölçüde inhibe etti.Şekil 8A. Gerçekten de, LPS ve/veya oksidatif stres, fibrinolizin ana fizyolojik inhibitörü olan plazminojen aktivasyon inhibitörü 1'in (PAI-1) artan bir seviyesine neden oldu [ 39 ], böylece fibrinolizi bloke etti ve ardından trombüs [ 4 ] ile sonuçlandı. Bu görüş doğrultusunda, PAI-1 seviyeleri, LPS ile tedavi edilen hayvanlarda, kontrol hayvanlarına kıyasla önemli ölçüde yükselmiştir (Şekil 8B), t-PA seviyeleri üzerinde herhangi bir etki gözlenmemesine rağmen (Şekil 8C). Spesifik olarak, üç farklı dozda NK uygulaması, PAI-1'in serum konsantrasyonunu önemli ölçüde azalttı (Şekil 8B), PAI-1'i inflamasyon ve tromboz arasında önemli bir bağlantı olarak güçlendirmek. Makrofaj hücrelerinde benzer sonuçlar bulundu, çünkü LPS, NK tedavisi ile önemli ölçüde ortadan kaldırılan yüksek bir PAI-1 üretimini tetikledi (Şekil 8D) t-PA düzeylerini etkilemeden (Şekil 8E). Bu bağlamda, makrofajdan türetilen PAI-1, enflamasyon, oksidatif stres ve tromboz arasında, fibrinolitik dengeyi bozabilen, böylece fibrolitik aktiviteyi inhibe eden ve glomerüllerde fibrin birikimini tetikleyen nedensel bir bağlantı olabilir. Büyüleyici bir şekilde, NK, farelerde NK'nin LPS aracılı tromboz oluşumuna karşı koruma mekanizmasının en azından kısmen altında yatan, LPS tarafından indüklenen PAI-1 seviyelerini etkili bir şekilde bastırdı.
    Şekil 8
    Ayrı bir pencerede aç
    Şekil 8
    NK, farelerde LPS kaynaklı trombozu önemli ölçüde inhibe etti . (A) NK, farelerde LPS ile indüklenen glomerüler trombozu inhibe etti. Farelere, 12 saat boyunca (n = 10) LPS (0.5 mg/kg, ip) stimülasyonundan 1 saat önce NK (3000, 6000 ve 9000 FU/kg, ip) önceden verildi. Böbrek dokuları toplandı ve anti-fibrin(ojen) antikoru ile immünohistokimyasal boyama yapıldı. Fibrin birikimleri, kırmızı okla gösterildiği gibi kahverengi lekeler olarak belirtildi ve ImageJ aracılığıyla nicelendirildi. ***p < 0,001, uyarılmamış gruba karşı; # p < 0.05, ###p < 0,001, LPS grubuna karşı. (B) NK, farelerde PAI-1 salınımını önemli ölçüde bastırdı. Fareler, 12 saat boyunca 1 saat LPS (0.5 mg/kg, ip) uyarımı için NK (3000, 6000 ve 9000 FU/kg, ip) ile önceden dozlandı. Farelerden kan alındı. Serum PAI-1 (B) ve t-PA (C), ELISA ile belirlendi. ***p < 0,001, kontrole karşı; ## p < 0.01, ### p < 0,001, LPS grubuna karşı. (D) NK, RAW264.7 hücrelerinde LPS kaynaklı PAI-1 üretimini önemli ölçüde bastırdı. Hücreler belirtilen konsantrasyonlarda NK ile 1 saat inkübe edildi ve daha sonra 24 saat boyunca LPS (0.1 μg/mL) ile uyarıldı. PAI-1 (D) ve t-PA (E) içerikleri ELISA ile belirlendi. ***p < 0,001, Kontrole karşı; ##p < 0.01, vs. LPS ile uyarılan hücreler. (Bu şekil açıklamasında renk referanslarının yorumlanması için okuyucuya bu makalenin Web versiyonuna başvurulur.)

    4. Tartışma
    Yaralanmalar hem etkili bir kan pıhtılaşması hem de istilacı patojenlere karşı inflamatuar bir bağışıklık tepkisi gerektirdiğinden, iltihaplanma ve pıhtılaşmanın yakın ilişkisinin evrimsel bir kökeni vardır; bununla birlikte, akut enflamasyon gibi abartılı bir yanıt, hemostatik dengeyi protrombotik ve antifibrinolitik bir duruma doğru kaydırabilir ve KVH'nin temel patofizyolojisi olan potansiyel olarak yıkıcı trombüslere yol açabilir [ 40 ]. Bunun ışığında, sistemik enflamatuvar yanıtı olan kritik durumdaki birçok hastada pıhtılaşma anormallikleri vardır [ 41 ].]. Epidemiyolojik veriler, C-reaktif protein seviyeleri ile ölçülen inflamasyonun gelecekteki miyokard enfarktüsü ve felç ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu gösterdi. Ayrıca, ilk miyokard enfarktüsü riskinde aspirin kullanımıyla ilişkili azalmanın, doğrudan C-reaktif protein düzeyi ile ilişkili olduğu ortaya çıktı ve bu, anti-inflamatuar ajanların kardiyovasküler hastalığın önlenmesinde klinik yararları olabileceğini desteklemektedir [ 42 , 43 ]. ]. Bu doğrultuda, ilk önce ksilen kaynaklı kulak ödemi modelini kullanarak NK'nin anti-inflamatuar potansiyelini doğruladık (1A). Bağışıklığın ksilen ile indüklenen aktivasyonunun TLR4'e bağlı olduğu ve uzun süreli inflamatuar yanıtın ödem ve endotoksemi gibi sistemik inflamatuar durumları tetikleyebileceği göz önüne alındığında [ 44 ], NK, makrofajdaki in vitro çalışmalarımızla daha da doğrulanan TLR4 sinyalini bozabilir. hücreler (Şekil 5,Şekil 6). Ayrıca, NK'nin sistemik inflamatuar yanıt üzerindeki etkisini değerlendirmek için LPS ile indüklenen AKI modeli kullanıldı. Büyüleyici bir şekilde, NK farelerde LPS ile indüklenen AKI'ye karşı belirgin bir şekilde korunmuştur (1B), buna TNF-ɑ gibi serum proinflamatuar sitokinlerin önemli bir inhibisyonu eşlik etti (1C) ve IL-6 (1D), ayrıca makrofaj hücrelerindeki bulgularımızla tutarlı bir sonuç (Şekil 3C ve D). Bu arada, NK, LPS ile uyarılan MDA artışını tersine çevirerek ve AKI farelerinde LPS ile uyarılan GSH ve GSH-px tükenmesini geri kazanarak gösterildiği gibi, LPS kaynaklı oksidatif stres üzerinde dikkate değer bir koruma sergiledi (1EG), NK'nın makrofaj hücrelerinde LPS ile indüklenen ROS oluşumunu önemli ölçüde inhibe ettiği in vitro çalışmalarımızla tekrar doğrulandı (4). Buna göre, burada NK'nin umut verici anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres etkinliği sergilediğine dair kanıt sağladık.

    Aslında, tromboz tek yönlü bir süreç olmaktan çok iltihabı önemli ölçüde artırır. Örneğin pıhtılaşma proteazları, makrofajların, lökositlerin, trombositlerin ve endotel hücrelerinin yüzeyindeki proteazla aktive edilmiş reseptörlere (PAR'lar) bağlanır ve böylece trombo-inflamatuar süreci ilerletir [ 45 , 46 ]. Ek olarak fibrinojen ve fibrin, mononükleer hücrelerde, endotelyal hücrelerde, fibroblastlarda ve çeşitli immün hücrelerde proinflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu doğrudan uyarabilir [ 47 ]. Özellikle, çalışmalar fibrinin TLR4 yoluyla RAW 264.7 makrofaj hücreleri ile etkileşimini göstermiştir, bunun sonucunda makrofaj inflamatuar protein-1alfa (MIP-1alfa), MIP-1beta, MIP-2 ve monosit kemoatraktan protein-1 [ 48], fibrinojen eksikliği olan fareler ise makrofaj yapışmasının inhibisyonunu ve in vivo olarak daha az trombin aracılı sitokin üretimini gösterir [ 47 ]. Gerçekten de, makrofajlar üzerindeki TLR4, proinflamatuar sitokinleri ve PAI-1'i uyararak inflamasyon ve tromboz arasında kritik bir moleküler bağlantıdır ve bu nedenle anti-trombotik tedavi için çekici bir hedef olarak önerilmektedir [ 47 , 49 ]. LPS'yi tanıyan kritik bir sinyal reseptörü olarak TLR4 yolu, makrofajlar da dahil olmak üzere birçok hücrede doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklığa aracılık etmede çok önemli bir rol oynar [ 50 ]. LPS tarafından aktive edildiğinde, TLR4 dimerize olur ve ardından NF-κB translokasyonunu ve MAPK sinyal iletimini aşağı yönde köprüleme adaptör molekülleri ile etkileşime girerek indükler [ 51 ].]. MyD88'e bağlı yol açısından, TRAF-6 (bağışıklık düzenleyici işlevlere sahip birden fazla reseptör ailesinin aşağı akışındaki bir aktör), daha sonra NF-κB ve/veya MAPK'ler yoluyla sinyalleşmeyi etkileyen ve sonunda pro-inflamatuar salınımını tetikleyen TAK1 aktivasyonunu kolaylaştırır. arabulucular [ 52 , 53 ]. Çalışmamızda, NK'nin TRAF6'nın LPS kaynaklı yukarı regülasyonunu baskıladığı ortaya çıktı (Şekil 5A), IκB-ɑ fosforilasyonu ve bozunması (Şekil 3A) ve ayrıca RAW264.7'de p65'in sitozolden çekirdeğe translokasyonu (Şekil 3B). Benzer şekilde, NK tedavisi ile inhibe edilen LPS ile indüklenen inflamatuar süreçte JNK1/2, ERK1/2 ve p38 MAPK aktivasyonunu kaydettik (Şekil 5A). Benzer çizgiler boyunca, NK'nin konsantrasyona bağlı bir modelde TNF-α, IL-6, NO ve PAI-1 gibi LPS ile indüklenen inflamatuar mediatörlerin ekspresyonunu bastırdığı gösterildi (İncir. 2A ve C,Şekil 3C ve D veŞekil 8D), NK'nin anti-inflamatuar potansiyelini sunar. Ayrıca, NK inkübasyonunun makrofaj hücrelerinde zamana bağlı olarak TLR4 seviyelerini azalttığı gösterildi (Şekil 5B) konsantrasyona bağlı bir şekilde PMSF (güçlü bir serin proteaz inhibitörü) tarafından yürürlükten kaldırılmıştır (Şekil 5B). Aslında, PMSF (10 μM), TLR4 seviyelerini neredeyse tamamen restore etti, bu da NK'nin serin proteaz aktivitesinin, TLR4 ekspresyonlarının azalması için ana neden olabileceğini düşündürdü. Bu yorumu desteklemek için, yerleştirme ve moleküler simülasyon verileri ayrıca, NK'nin katılan bağlanma kalıntılarının, NK'nin bildirilen anahtar substrat bağlama kalıntılarıyla örtüştüğünü ve böylece TLR4'ün hidrolizini kolaylaştırdığını doğruladı (Şekil 6).

    TLR4'e ek olarak LPS, makrofajlarda bol miktarda eksprese edilen NADPH oksidazı aktive ederek, makrofaj aktivasyonunu güçlendiren ve sonunda aşırı inflamasyona yol açan ROS üretimine yol açar [ 27 , 54 ]. Aslında, makrofajlarda eksprese edilen ana fagositik NADPH oksidaz izoformu, iki zara bağlı alt birim NOX2 (veya gp91phox) ve p22phox, sitozolik alt birimler p47phox, p67phox, p40phox ve küçük bir GTPaz Rac'tan oluşur. Aktif enzim kompleksinin montajı, ROS üretiminde bir patlama ile sonuçlanır. Özellikle, NK, LPS ile uyarılan RAW264.7 hücrelerinde p47phox'un sitozolden zara translokasyonunu önemli ölçüde inhibe etmek için sunuldu (4C), LPS kaynaklı ROS oluşumunu hafifletmek (4A). Gerçekten de, ROS'un kronik ve akut aşırı üretimi, oksidatif stres, inflamatuar yanıtı teşvik etmek, trombosit aktivasyonunu yükseltmek ve ayrıca adezyon moleküllerini (VWF, P- gibi) yukarı regüle etmekle ilişkili olduğundan, uzun süredir CVD'ye yol açan önemli bir patofizyolojik aracı olarak kabul edilmiştir. selektinler, αvβ3 ve ICAM-1) [ 64 ]. Ayrıca, aterosklerotik plağın omuz bölgelerinde NAD(P)H oksidaza bağlı O 2 −• üretimi bulunmuştur, bu da ROS'un inflamasyondaki rolüne destek sağlar [ 55]. Literatürde yaygın olarak bildirildiği gibi, verilerimiz LPS'nin hem TLR4'ü hem de enflamatuar makrofaj hücrelerinde bol miktarda eksprese edilen NOX2'yi aktive ettiğini ve proinflamatuar sitokinlerin salınmasının yanı sıra karşılık gelen ROS üretimine yol açtığını göstermiştir. Aslında, şiddetli sepsiste, bu proinflamatuar sitokinler tarafından uyarılan dolaşan mononükleer hücreler, pıhtılaşmanın sistemik aktivasyonuna yol açan doku faktörünü eksprese eder [ 56 , 57 ]. Sağlıklı denekler için bile, deneysel düşük doz LPS, kan monositlerinde doku faktörü haberci RNA düzeylerinde 125 kat artışa neden oldu [ 58 ]. Bildiğimiz kadarıyla, burada makrofaj hücrelerinde TLR4 ve NOX2 aracılı sinyalleşmeyi bloke etmesinden kaynaklanan NK'nin ilk anti-inflamatuar kanıtını sağladık.

    Kayda değer bir şekilde, inflamatuar süreç ve oksidatif stresin trombozu teşvik etmek için fibrinolitik sistemi etkilediği iyi bilinmektedir [ 39 , 59 ]. Tromboza karşı önemli bir endojen savunma mekanizması olarak fibrinolitik sistemin inhibitörü, fibrinoliz, inflamasyon ve tromboz arasında kritik bir moleküler bağlantıyı temsil eder [ 59 ]. PAI-1, fibrinoliz için anahtar inhibitör olan 50 kDa'lık bir glikoproteindir. İnflamatuar hastalıklarda (septik şok, akut akciğer inflamasyonu ve trombotik hastalıklar gibi) önemli bir patolojik rol oynar, öyle ki fibrinoliz PAI-1 tarafından aşağı regüle edildiğinde veya inhibe edildiğinde inflamasyon şiddetlenir [ 60 , 61 ]]. Aslında, LPS ile indüklenen inflamatuar reaksiyon sırasında, PAI-1 in vitro olarak TLR4/NF-KB yolu yoluyla inflamasyonu teşvik ederken, PAI-1'in silinmesi TLR4/NF-KB yol aktivitesinin azalması ve daha az inflamasyon ile sonuçlanmıştır [ 60 ]. Ayrıca, PAI-1 promotörü içinde korunmuş bir distal NF-kB bölgelerinin varlığını ortaya çıkardı [ 62 ]. Buna göre, verilerimiz PAI-1'in makrofaj hücrelerinde LPS stimülasyonuna yanıt olarak yukarı regüle edildiğini ve bu durumun muhtemelen TLR4/NF-kB yolakları yoluyla NK tarafından belirgin şekilde hafifletildiğini gösterdi (Şekil 8D). Benzer şekilde, inflamasyon da PAI-I'in yukarı regülasyonu yoluyla trombüsü teşvik eder. Örneğin, daha önce bildirildiği gibi, LPS uygulaması glomerüllerde tipik trombüs oluşumuna ve serumda yüksek PAI-1 seviyelerine neden olmuştur (Şekil 8) [ 21 ]. Bu arada, trombozda oksidatif stresin önemi, ROS'un endotelyal hücrelerde PAI-I ekspresyon seviyesini yukarı regüle ettiği [ 39 ] ve vaskülatürde artan PAI-1 ekspresyonunun ApoE'de protrombotik fenotip ve aterosklerozu desteklediği gözlemiyle vurgulanmıştır. (-/-) fareler [ 63 ]. Enflamasyon, oksidatif stres ve tromboz arasındaki kısır amplifikasyon döngüsü göz önüne alındığında, inflamasyonu ve oksidatif stresi inhibe eden tedavilerin trombüs tedavisinde faydalı olabileceğini varsaymak mantıklıdır. Özellikle, NK'nin endotoksinle tedavi edilen hayvanların glomerüllerinde fibrin birikimini doza bağlı bir şekilde etkili bir şekilde inhibe ettiği ortaya çıktı (Şekil 8A). Özellikle, NK, LPS tarafından indüklenen serum PAI-1 seviyelerini önemli ölçüde inhibe etti (Şekil 8B), in vitro makrofaj çalışmalarımızla tutarlıydı (Şekil 8D), protrombotik ve antitrombotik aktiviteler arasındaki dengenin önemini vurgulayarak. Bu nedenle, farmakolojik trombolitik tedaviye odaklanan geleneksel müdahalelerden farklı olarak, NK, yalnızca trombolitik ve antikoagülan işlevlere hizmet etmekle kalmayıp, aynı zamanda hızlandırılmış tromboz oluşumunu önleyecek anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres etkilerini ortaya çıkaran kapsamlı bir anti-trombüs ajanı olarak söz sahibidir.Şekil 9). Bu açıdan NK, inflamasyon, oksidatif stres ve tromboz arasındaki kısır döngüyü kırarak kapsamlı bir anti-trombüs stratejisi açabilir.
    Şekil 9
    Ayrı bir pencerede aç
    Şekil 9
    Enflamasyon, oksidatif stres ve pıhtılaşma arasındaki kısır döngüyü kırarak NK'nin yeni anti-trombüs anlayışının şeması. LPS, enflamatuar makrofaj hücrelerinde bol miktarda eksprese edilen hem TRL4 hem de NOX2'yi aktive ederek karşılık gelen ROS üretimine, NF-KB aktivasyonuna ve NO, TNF-α, IL-6 ve PAI gibi aşağı akış proinflamatuar mediatör üretimine yol açtı. -1. İlginç bir şekilde, NK, LPS'nin neden olduğu NOX2 ve TRL4 aktivasyonunu inhibe ederek, anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres etkinliğini göstererek, LPS'nin neden olduğu ROS oluşumunu ve NF-κB aktivasyonunu önemli ölçüde bastırdı. Tutarlı bir şekilde, NK, inflamasyonu ve oksidatif stresi kısıtlayarak farelerde LPS'nin neden olduğu AKI'ye karşı etkili bir şekilde korunmuştur. Enflamasyon, oksidatif stres ve pıhtılaşma arasındaki yoğun karışmayı desteklemek için NK, farelerde LPS ile indüklenen glomerüler trombüslere karşı etkili bir şekilde korunmuştur. Özellikle fibrinolizin ana fizyolojik inhibitörü olan PAI-1 seviyeleri, NK tedavisi ile önemli ölçüde azaltılan, LPS ile tedavi edilen hayvanlarda önemli ölçüde yükselmiştir. En azından kısmen, NK'nin farelerde LPS aracılı tromboz oluşumuna karşı koruma mekanizmasının altında yatan LPS ile aktive olan makrofajlarda benzer sonuçlar bulundu.

    Özetle, NK'nin LPS ile aktive olan makrofaj sinyalleşmesini iyileştirmede ve farelerde LPS ile uyarılan AKI'ye ve ayrıca glomerüler trombüsüne karşı koruma sağlamada NK'nin anti-inflamatuar ve anti-oksidatif stres etkilerini göstererek NK'nin anti-trombüs mekanizmasını genişlettik. inflamasyon, oksidatif stres ve tromboz arasındaki kısır döngüyü kırarak kapsamlı bir anti-trombüs stratejisi.

    Git: Rekabetçi çıkar beyanı
    Herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

    Git: Teşekkür
    Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21507093) tarafından verilen bir ödülle desteklenmiştir.

    Git: Dipnotlar
    Ek A Bu makalenin ek verileri çevrimiçi olarak https://doi.org/10.1016/j.redox.2020.101500 adresinde bulunabilir .

    Git: Kısaltmalar
    NK nattokinaz özgeçmiş kardiyovasküler hastalıklar tPA Doku plazminojen aktivatörü LPS lipopolisakkaritler TLR4 ücretli alıcı 4 TNF-α tümör nekroz faktörü-α HAYIR nitrik oksit iNOS indüklenebilir nitrik oksit sentaz NF-KB nükleer faktör-κB IL-6 interlökin-6 HARİTA mitojenle aktifleştirilmiş protein kinaz JNK c-Jun N-terminal kinaz ERK hücre dışı regüle protein kinazlar MyD88 miyeloid farklılaşması birincil yanıt geni 88 PVDF poliviniliden diflorür ROS Reaktif oksijen türleri DCFH 2 -DA 2',7'-Diklorodihidrofloresein diasetat AKI akut akciğer hasarı O hema toksini ve eozin ESK immünohistokimya doktor moleküler dinamik PDB protein veritabanı bankası MM-GBSA moleküler mekanik-genelleştirilmiş Doğan yüzey alanı SPC basit nokta şarjı RMSD ortalama kare sapmalar PAI-1 Plazminojen aktivatör inhibitörü-1



    Git: Ek A. Ek veriler
    Aşağıdakiler, bu makalenin Ek verileridir:
    Multimedya bileşeni 1:
    Görmek için buraya tıklayın. (2.2M, belge) Multimedya bileşeni 1


    Git: Referanslar
    1. Ouriel K., Welch EL, Shortell CK, Geary K., Fiore WM, Cimino C. İn vitro venöz tromboliz modelinde streptokinaz, ürokinaz ve rekombinant doku plazminojen aktivatörünün karşılaştırılması. J. Vasc. cerrah. 1995; 22 (5):593–597. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    2. Raffort J., Lareyre F., Clement M., Hassen-Khodja R., Chinetti G., MallatZ Monositler ve abdominal aort anevrizmalarındaki makrofajlar. Nat. Rev. Cardiol. 2017; 14 :457-471. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    3. Levi M., van der Poll T., Büller HR Enflamasyon ve pıhtılaşma arasındaki çift yönlü ilişki. dolaşım. 2004; 109 (22):2698–2704. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    4. Jackson SP, Darbousset R., Schoenwaelder SM Tromboinflamasyon: terapötik olarak pıhtılaşmayı ve diğer konak savunma mekanizmalarını hedeflemenin zorlukları. Kan. 2019; 133 :906-918. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    5. Quenot JP, Dargent A., Large A., Roudaut JB, Andreu P., Barbar S. Yoğun bakım ünitesinde sepsis kaynaklı akut böbrek hasarının tedavisi: terapötik hedefler henüz belirlenmemiştir. Anne. Tercüme Med. 2019; 7 :S181. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    6. Lei Y., Wang K., Deng L., Chen Y., Nice EC, Huang C. Enflamasyonun redoks regülasyonu: eski unsurlar, yeni bir hikaye. Med. Araş. Rev. 2015; 35 :06-340. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    7. Valen G., Yan ZQ, Hansson GK Nükleer faktör kappa-B ve kalp. J. Am. Kol. Kardiyol. 2001; 38 :307–314. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    8. Edith L., Diane EH, Joseph L. Aterotrombozda oksidatif stres ve nitrik oksidin rolü. Ön. Biosci. 2008; 13 :5323–5344. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    9. Nagata C., Wada K., Tamura T., Konishi K., Goto Y., Koda S. Japon erişkinlerinde diyet soya ve natto alımı ve kardiyovasküler hastalık mortalitesi: Takayama çalışması. Ben. J. Clin. Nutr. 2017; 105 (2):426–431. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    10. Jang JY, Kim TS, Cai J., Kim J., Kim Y., Shin K. Nattokinase, trombosit agregasyonunu ve trombüs oluşumunu engelleyerek kan akışını iyileştirir. laboratuvar Hayvan Araş. 2013; 29 (4):221–225. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    11. Kim JY, Gum SN, Paik JK, Lim HH, Kim KC, Ogasawara K. Nattokinazın kan basıncı üzerindeki etkileri: randomize, kontrollü bir çalışma. Hipertens. Araş. : Kapalı. J. Jpn Soc. Hipertens. 2008; 31 (8):1583–1588. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    12. Wu H., Wang H., Xu F., Chen J., Duan L., Zhang F. Kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi için umut verici bir ajan olan nattokinazın akut toksisitesi ve genotoksisite değerlendirmeleri. kural. Toksikol. farmakol. 2019; 103 :205–209. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    13. Estruel-Amades S., Massot-Cladera M., Garcia-Cerdà P., Pérez-Cano FJ, Franch À., Castell M. Hesperidin'in yoğun olarak eğitilmiş sıçanlarda yorucu bir egzersizin neden olduğu oksidatif stres üzerindeki koruyucu etkisi. besinler 2019;(11) (tanımsız.F) [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    14. Yuan R., Huang L., Du LJ, Feng JF, Li J., Luo YY Dihidrotanshinon, TLR4 dimerizasyonunu bloke ederek in vitro ve in vivo bir anti-inflamatuar etki sergiler. farmakol. Araş. 2019; 142 :102-114. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    15. Berman HM, Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat TN, Weissig H. Protein veri bankası. Nükleik Asitler Araş. 2000; 28 :235–242. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    16. Kim HM, Park BS, Kim JI, Kim SE, Lee J., Oh SC Bağlı endotoksin antagonisti Eritoran ile TLR4-MD-2 kompleksinin kristal yapısı. Hücre. 2007; 130 :906-917. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    17. Banks JL, Beard HS, Cao Y., Cho AE, Damm W., Farid R. Entegre modelleme programı, uygulamalı kimyasal teori (IMPACT) J. Comput. Kimya 2005; 26 :1752–1780. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    18. Weng G., Wang E., Wang Z., Liu H., Zhu F., Li D. HawkDock: hesaplamalı yerleştirme ve MM/GBSA'ya dayalı protein-protein kompleksini tahmin etmek ve analiz etmek için bir web sunucusu. Nükleik Asitler Araş. 2019; 47 :W322–W330. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    19. Ylilauri M., Pentikainen OT MMGBSA, filamin-peptid etkileşimlerinin bağlanma afinitelerini anlamak için bir araç olarak. J. Chem. Enf. modeli. 2013; 53 :2626–2633. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    20. Bowers KJ, Chow E., Xu H., Dror RO, Eastwood MP, Gregersen BA SC 2006 Konferansı, ACM/IEEE Bildirileri, 2006. 2006. Emtia kümeleri üzerinde moleküler dinamik simülasyonları için ölçeklenebilir algoritmalarda. 43-43. [ Google Akademik ]
    21. Tsantarliotou MP, Lavrentiadou SN, Psalla DA, Margaritis IE, Kritsepi MG, Zervos IA Plazminojen aktivatör inhibitörü-1 (PAI-1) aktivitesinin krosin tarafından baskılanması, sıçanlarda lipopolisakkarit kaynaklı trombozu iyileştirir. Gıda Kimyası Toksikol. 2019; 125 :190–197. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    22. Chen L., Yang SX, Zumbrun EE, Guan HB, Nagarkatti PS, Nagarkatti M. Resveratrol, makrofajlar tarafından tahrik edilen iltihabı baskılayarak lipopolisakkarit kaynaklı akut böbrek hasarını hafifletir. Mol. Nutr. Gıda Araş. 2015; 59 :853-864. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    23. Sakaguchi S., Furusawa S. Oksidatif stres ve septik şok: endotoksemi sırasında karaciğerde üretilen oksijenden türetilen serbest radikallerin metabolik yönleri. FEMS İmmünol. Med. Mikrobiyol. 2006; 47 (2):167–177. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    24. Bailey JD, Diotallevi M., Nicol T., McNeill E., Shaw A., Chuaiphichai S. Nitrik oksit, TCA döngüsü düzenlemesi ve itakonat birikimi yoluyla inflamatuar makrofajlarda metabolik yeniden şekillenmeyi modüle eder. Hücre Temsilcisi 2019; 28 :218–230. e7. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    25. Dorrington MG, Fraser IDC NF-κB makrofajlarda sinyalleşme: dinamikler, karışma ve sinyal entegrasyonu. Ön. immünol. 2019; 10 :705. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    26. Wen DY, Nong YH, Morgan JG, Gangurde P., Bielecki A., DaSilva J. Seçici bir küçük molekül I kappa B kinaz beta inhibitörü, insan fibroblast benzeri sinoviyositlerde, kondrositlerde nükleer faktör kappa B aracılı enflamatuar tepkileri bloke eder, ve mast hücreleri. J. Pharmacol. Tecrübe. terapi. 2006; 317 :989–1001. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    27. Komatsu W., Kishi H., Yagasaki K., Ohhira S. Urolithin A, lipopolisakkarit ile uyarılan RAW264 makrofajlarında PI3-K/Akt/NF-κB ve JNK/AP-1 sinyal yollarını baskılayarak pro-inflamatuar aracı üretimini azaltır : NADPH oksidazdan türetilen reaktif oksijen türlerinin olası katılımı. Avro. J. Pharmacol. 2018; 833 :411–424. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    28. Ma Q. Oksidatif stres ve toksisitede nrf2'nin rolü. Annu. Rev. Pharmacol. Toksikol. 2013; 53 :401–426. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    29. Brandes RP, Weissmann N., Schröder K. NOX ailesi NADPH oksidazlar: aktivasyonun moleküler mekanizmaları. Ücretsiz Radic. Biol. Med. 2014; 76 :208–226. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    30. Singh A., Singh V., Tiwari RL, Chandra T., Kumar A., ​​Dikshit M. IRAK-ERK-p67phox-NOX-2 ekseni TLR4, IL-1β transkripsiyonu ve işlenmesi için 2-indüklenmiş ROS üretimine aracılık eder monositlerde. Hücre. Mol. immünol. 2016; 13 :745–763. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    31. Saad MA, El-Sahhar AE, Arab HH, Al-Shorbagy MY Nicorandil, TLR4-MyD88-TRAF6 sinyal yolunu ele geçirerek sıçanlarda tam Freund adjuvanının neden olduğu artritik bozulmaları azaltır. Hayat Bilimi. 2019; 218 :284–291. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    32. Wu S., Feng C., Zhong J., Huan L. Nattokinazın S3 bölgesi kalıntılarının aktivitesi ve substrat spesifikliği üzerindeki rolleri. J. Biochem. 2007; 142 (3):357–364. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    33. Hulkower Keren I., Herber Renee L. İlaç keşfi için araçlar olarak hücre göçü ve istila deneyleri. Eczacılık. 2011; 3 :107–124. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    34. Yamamoto K., Shimokawa T., Yi H., Isobe KI, Kojima T., Loskutoff DJ Yaşlanma, endotoksin kaynaklı trombozu hızlandırır: yaşlanma ile birlikte plazminojen aktivatör inhibitörü-1 ve lipopolisakarit sinyalinin artan tepkileri. Ben. J. Pathol. 2002; 161 (5) 0-1814. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    35. Wang L., Duan J., Bian T., Meng R., Wu L., Zhang Z. Enflamasyon, serebral ven trombozunun şiddeti ve sonucu ile ilişkilidir. J. Nöroinflamasyon. 2018; 15 :329. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    36. Hirahashi J., Hishikawa K., Kaname S., Tsuboi N., Wang Y., Simon DI Mac-1 (CD11b/CD18), glomerüler yaralanmadan sonra inflamasyon ve trombozu birbirine bağlar. dolaşım. 2009; 120 :1255–1265. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    37. Yao X., Chen W., Liu J., Liu H., Zhan JY, Guan S. Derin ven trombozu, bir sıçan modelinde sirtuin 1/NF-KB sinyal yolu aracılığıyla düzenlenen inflamasyon ile modüle edilir. trombüs. Hemostaz. 2019; 119 :421–430. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    38. Day SM, Duquaine D., Mundada LV, Menon RG, Khan BV, Rajagopalan S. Kronik demir uygulaması vasküler oksidatif stresi artırır ve arteriyel trombozu hızlandırır. dolaşım. 2003; 107 :260–266. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    39. Swiatkowska M., Szemraj J., Al-Nedawi KN, Pawlowska Z. Reaktif oksijen türleri, endotel hücrelerinde PAI-1 ekspresyonunu yukarı doğru düzenler. Hücre. Mol. Biol. Lett. 2002; 7 :1065-1071. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    40. Okamoto K., Tamura T., Sawatsubashi Y. Sepsis ve yaygın damar içi pıhtılaşma. J. Yoğun Bakım. 2016; 4:23 . [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    41. Levi M., Opal SM Kritik hastalarda pıhtılaşma anormallikleri. Kritik. Bakım. 2006; 10 :222–228. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    42. Berk BC, Weintraub WS, Alexander RW “Aktif” koroner arter hastalığında C-reaktif proteinin yükselmesi. Ben. J. Cardiol. 1990; 65 :168-172. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    43. Ridker PM, Cushman M., Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens CH Enflamasyon, aspirin ve görünüşte sağlıklı erkeklerde kardiyovasküler hastalık riski. N. İngilizce J. Med. 1997; 336 :973-979. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    44. Liu Yl, He Wj, Mo L., Shi Mf, Zhu Yy, Pan S. Monochasma savatieri Franch'dan feniletanoid glikozitlerin antimikrobiyal, anti-inflamatuar aktiviteleri ve toksikolojisi. eski Maxim. J. Etnofarmakol. 2013; 149 :431-437. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    45. Cunningham MA, Romas P., Hutchinson P., Holdsworth SR, Tipping PG Doku faktörü ve faktör VIIa reseptörü/ligand etkileşimleri, makrofajlarda proinflamatuar etkileri indükler. Kan. 1999; 94 :3413–3420. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    46. ​​Coughlin SR Trombin sinyali ve proteazla aktive olan reseptörler. Doğa. 2000; 407 :258–264. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    47. Szaba FM, Smiley ST Sitokin/kemokin üretiminde ve in vivo makrofaj yapışmasında trombin ve fibrin(ojen) için Roller. Kan. 2002; 99 :1053–1059. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    48. Smiley ST, King JA, Hancock WW Fibrinojen, geçiş ücreti benzeri reseptör 4 aracılığıyla makrofaj kemokin salgılanmasını uyarır. J. Immunol. 2001; 167 :2887–2894. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    49. Croce K., Libby P. Aterosklerozda tromboz ve inflamasyonun iç içe geçmesi. Kör. Görüş. hematol. 2007; 14 (1):55–61. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    50. Di Lorenzo F., Kubik L., Oblak A., Lore NI, Cigana C., Lanzetta R. İnsan ücretli benzeri reseptör 4 (TLR4) merkezi nokta miyeloid farklılaşma faktörü 2'nin (MD-2) hipoasillenmiş lipopolisakarit ile aktivasyonu Burkholderia cenocepacia'nın klinik izolatından. J. Biol. Kimya 2015; 290 :21305–21319. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    51. Xu XL, Yin P., Wan CR, Chong XL, Liu MJ, Cheng P. Punicalagin, TLR4 aracılı MAPK'lerin baskılanması ve NF-kappa B aktivasyonu yoluyla LPS ile indüklenen RAW264.7 makrofajlarındaki iltihabı inhibe eder. Enflamasyon. 2014; 37 :956–965. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    52. Yu Y., Ge NL, Xie M., Sun WJ, Burlingame S., Interlökin (IL)-1-aracılı optimal NF için TAK1 T-döngüsündeki Thr-178 ve Thr-184'ün Pass AK Fosforilasyonu gereklidir kappa B ve AP-1 aktivasyonunun yanı sıra IL-6 gen ekspresyonu. J. Biol. Kimya 2008; 283 :24497–24505. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    53. Kawai T., Akira S. Ücretli alıcı aşağı akış sinyali. Artrit Araş. orada. 2005; 7 :12-19. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    54. Zhang WB, Yang F., Wang Y., Jiao FZ, Zhang HY, Wang LW HDAC6'nın inhibisyonu, oksidatif stresi düzenleyerek ve TLR4-MAPK/NF-κB yollarını baskılayarak makrofajlarda LPS kaynaklı iltihabı hafifletir. Biyomedya. Eczacı. 2019; 117 :109166. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    55. Sorescu D., Weiss D., Lassegue B., Clempus RE, Szocs K., Sorescu GP Süperoksit üretimi ve insan aterosklerozunda nox ailesi proteinlerinin ifadesi. dolaşım. 2002; 105 :1429–1435. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    56. Osterud B., Rao LV, Olsen JO Tam kanda doku faktörü ekspresyonunun indüksiyonu - granülositler üzerinde doku faktörü ekspresyonunun varlığına dair kanıt yok. trombüs. Hemostaz. 2000; 83 :861-867. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    57. Levi M., van der Poll T., on Cate H., van Deventer SJ Sepsis ve endotoksemide pıhtılaşma ve pıhtılaşma önleyici mekanizmalar arasındaki sitokin aracılı dengesizlik. Avro. J. Clin. Yatırım. 1997; 27 :3–9. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    58. Franco RF, de Jonge E., Dekkers PE, Timmerman JJ, Spek CA, van Deventer SJ İnsan endotoksemisi sırasında doku faktörü haberci RNA ifadesinin in vivo kinetiği: pıhtılaşma aktivasyonu ile ilişki. Kan. 2000; 96 :554–559. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    59. Medcalf RL Fibrinoliz, inflamasyon ve plazminojen aktive edici sistemin düzenlenmesi. J. Tromb. Hemostaz. 2007:132–142. boş. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    60. Ren W., Wang Z., Hua F., Zhu L. Plazminojen aktivatör inhibitörü-1, alveolar makrofajlarda LPS ile indüklenen TLR4/MD-2 yol aktivasyonunu ve inflamasyonu düzenler. Enflamasyon. 2015; 38 :384-393. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    61. Hua F., Ren W., Zhu L. Plazminojen aktivatör inhibitörü tip-1 eksikliği, Toll benzeri reseptör 4 sinyal yolunu güçlendirerek LPS kaynaklı akut akciğer hasarını abartıyor. Kan Pıhtısı. Fibrinoliz. 2011; 22 :480–486. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    62. Hou B., Eren M., Painter CA, Covington JW, Dixon JD, Schoenhard JA Tümör nekroz faktörü alfa, insan plazminojen aktivatör inhibitörü-1 genini bir uzak nükleer faktör kappaB bölgesi yoluyla aktive eder. J. Biol. Kimya 2004; 279 :18127–18136. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    63. Schafer K., Muller K., Hecke A., Mounier E., Goebel J., Loskutoff DJ Ateroskleroza eğilimli farelerde arttırılmış tromboz, plazminojen aktivatör inhibitörü-1'in artmış arteriyel ekspresyonu ile ilişkilidir. Arterioskler. trombüs. Vask. Biol. 2003; 23 :2097–2103. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
    64. Mittal M., Siddiqui MR, Tran K., Reddy SP, Malik AB Enflamasyon ve doku yaralanmasında reaktif oksijen türleri. Antioksidanlar Redoks Sinyali. 2013; 20 (7) [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]

    Yorum yap

    Hazırlanıyor...
    X