PİNE BARK, ÇAM Kabuğu Ekstresi

[nguven]

Nitrik oksit sentaz aktivitesinin L- arjinin L- sitrüline dönüşümü yöntemi ile ölçülmesi
Prof. Dr. Hakan GÜRDAL
Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Farmakoloji ve Klinik Farmakoloji Ab.D., Ankara

NOS enzimi L-arginin, NADPH varlığında ve oksijen kullanarak NO, NADP+ ve sitrulin oluşumuna neden olur. Başka bir değiş ile NOS L-arginin L-sitrüllin dönüşüm reaksiyununu katalizler. Bu reaksiyon NOS inhibitörlerine duyarlıdır. Bu yöntem oldukça duyarlı bir ölçüm tekniğidir (0.7-50 pmol/dk/g). Bu yöntem ile NO düzeyi ölçülmemekte NOS aktivitesi değerlendirilmektedir. NOS aktivitesinin ölçüleceği örnekler Bu yöntem canlı hücreler veya deney hayvanlarından elde edilmiş taze dokularda gerçekeştirilebileceği gibi dondurulmuş (veya canlı) hücre, dokuların homojenizasyonu sonrası hazırlanan ve NOS proteinlerini içeren örneklerde de yapılabilmektedir.



Çeşitli hücre serilerinde ve damar halkalarında

[ 3 H]L-arginin ile işaretleme

Hücreler 6-12-24 kuyulu hücre kültür plakalarına eşit sayıda dağıtılmalıdır. Hücrelerin kültür ortamında yeterli sayıya ulaşmaları beklenmelidir (%80-95 konfluent, eğer kıyaslama yapılacaksa bu önemlidir, hücre sayısı kullanılan hücreye ve elde edilen yanıta göre ayarlanabilir). Hücreler 20 dk–3 saat 1 µCi/ml [ 3 H]L-arginin bulunduran serumsuz hücre kültür vasatı (DMEM) ile CO2 inkübatöründe (37° C) bekletilebilir. İnkübasyon sonunda iki farklı yöntem ile deneye devam edilebilir.

1. İnkübasyon sonunda kuyular yıkanır (ısıtılmış HEPES tamponu veya DMEM ile 3 kez yıkanmalı) ve (300-1000 µl) HEPES tamponu veya kültür vasatı eklenir.
2. İnkubasyon sonunda yıkama yapılmaksızın deneye geçilir (bunun için ön deneyler yapılmalıdır). Bir sonraki aşamada NOS enzimi aktivasyonunu etkileyecek madde ortama eklenerek 10-60 dk beklenir.

Damar halkalarında
Örneğin tavşan veya sıçan damar halkaları (3-10 mm) klasik kasılma çalışmalarında olduğu gibi bilinen yöntemlerle çıkarıldıktan sonra fizyolojik bir tampon içine alınır. Bu tampon Krebs gibi bilinen veya HEPES içeren bir tampon olabilir. HEPES tamponu (mM): NaCl, 122; KCl, 4.9; MgCl2, 1.2; KH2PO4, 1.2; NaCO3, 3.6; CaCl2, 1.3; glucose, 11; HEPES, 30, (pH 7.4). Damar halkaları 20 dk-3 saat 1-2 µCi/ml [3 H] L-arginin, 37° C'de inkübe edilir. Daha sonra ortama etkisine bakılacak maddeler konulur (eğer antagonistler konulacaksa bu maddeler ile ön inkubasyonlar yapılmalıdır) 10-60 dk beklenir. Eğer deney başka dokularda yapılacaksa beyin, dalak, karaciğer gibi örnekler doku parçalayıcıları ile küçük parçalara ayırılıp yukarıda adı geçen tamponlarla yıkandıktan sonra eşit parçalara ayrılarak deney gerçekleştirilebilir. Bir diğer seçenek ise dokuların standardize edilmiş ıslak ağırlıklarına göre (20-100 mg) parçacıklara ayırılır ve deneyler yukarıda tanımlandığı gibi gerçekleştirilebilir.

Reaksiyonun sonlandırılması

Damar ve hücrelerle yapılan deneylerde inkübasyon tamponu aspire edilir ve yaklaşık 300- 500 µl buz soğukluğunda %15 trikloroasetik asit (TCA) eklenerek reaksiyon durdurulur.Örnekler 15-60 dakika buz üzerinde veya 4° C'de bekletilir. TCA hücre proteinleri ve yağ-ları ile çözünmeyen tuzlar oluşturarak bunla-rın çökmesine neden olur. Bu işlemden sonra hücrelerle yapılan deneylerde kuyulu plaka-larda bulunan örnekler ependorf tüplerine alınmalıdır. Örnekler 1,500Xg, 10 dakika çev-rilir yağ ve proteinlerin tamamen çökmesi sağlanır. Yaklaşık 300-500 µl olan süperna-tan alınır.

Öncelikle alınan örneklerden TCA uzaklaştırılmalı ve ortam pH sının 6-7 dolaylarında olması sağlanmalıdır. Bunun için örneklere 125 µl 100 mM EDTA ve 500 µl (1:1) Freon(1,1,2- tricholorotrifluoroethane)/tri-n octylamine karışımından eklenmeli, örnekler karıştırılmalı ve oda sıcaklığında 15 dakika beklenmelidir. Daha sonra örnekler 12,000xg, 5-10 dakika oda sıcaklığında çevrilir. Ependorf tüplerinde 3 faz oluşur. Üst faz (yaklaşık 300-500 µl) alınır. 500-700 µl 20mM HEPES (pH 6) eklenir. Örnekler [3 H]L-arginin [3 H]L-sitrulin ayrıştırılmasına hazırdır

TCA diethylether ile uzaklaştırılabilir. Reaksiyon durdurulması ve sitozolik kısmın elde edilebilmesi için TCA yerine perklorik asit, kloroform/metanol veya metanol kullanılan protokollerde uygulanabilir.

Katyon-değiştirici kolon kromatografisi ile [ 3 H]L-arginin [3 H]L-sitrulin ayrıştırılması

Kolon materyali (güçlü asit, sülfonik asit, Dowex 50) SO3 - H+ katyonik gurubu içeren çapraz bağlı ‘styrene-divinyl benzene kafes (lattice)’ derivesi bir reçinedir. İyonik H+ ve Na+ formu vardır ve bu formlar birbirine dönüştürülebilir. Na+ formu kullanılmalıdır. H+ formlu reçine 1 M NaOH ile inkube edildikten sonra reçineler pH < 8 olacak şekilde su ile yıkanmalıdır.

nRzSO3 - H+ + Mn+ ↔ (RzSO3)n M+ nH+

Protokol

1 hacim (her bir kolon için 800-1000 µl) Na+ form reçine (Dowex 50x8 200-400 mesh), 1 hacim su ile karıştırılır, kolonlara yüklenir ve reçinenin çökmesi beklenir. Örnekler kolonlara yüklenir. [3 H] L-sitrullin nötral olduğu için kolonlara bağlanmayacaktır.

1. Serbest [3 H] L-sitrullin yaklaşık 4ml su ile toplanır.
2. Kolonlara bağlanan [3 H] L-arginin 2-4ml 0.1 M NaOH ile toplanır. Tüplere sintilasyon solüsyonu konulur ve sayılır. Tüplerden az miktarda örnekler alınıp sayım yapmakta mümkündür.
3. Kolonlar 2-5 ml 1 M NaOH ve bunu takiben 20 ml su ile yıkanarak rejenere edilir. Kolon pH sı kontrol edilmelidir.

Kolonlar ıslak saklanabilir fakat uzun süreli beklemelerde bakteri ve mantar üremesi olabilir.

Hücre ve doku homojenatlarında ölçüm

Dondurulmuş veya taze hücre ve dokular homejanizasyon tamponu (HT) (yaklaşık 5 ml/g doku) içinde parçalanır ve homejenize (soğukta ve hızlı yapılmalıdır) edilir.

HT (pH 7.2): 320 mM sukroz, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 µg/ml leupeptin, 2 µg/ml aprotinin.

Homejanatlar 10.000Xg 30 dk (sitozol + mikrozomal fraksiyonlar) veya 100.000xg 60 dk (sitozol) santrifuj edilir. Supernatan alınır, protein ölçümü yapılır deney için kullanılır. Endojen L-arginin yüksek olduğu düşünülüyorsa veya biliniyorsa L-arginin ortamdan uzaklaştırmak için örnekler yukarıda anlatılan kolondan geçirilir ve toplanır.

Deney tüplerinin içine 100-200 µl deney tamponu (DT) konulur

DT (örnek1): 50 mM KPO4, 1.2 mM MgCl2, 0.25 mM CaCl2, 120 µM NADPH, 1.2 mM citrulline (pH 7.2).

DT (örnek2): 50 mM HEPES, 1.25 mM CaCl2, 1 mM EDTA, 1 mM NADPH, 10 µg calmodulin (pH: 7.4)

1-2 µCi/ml [3 H] L-arginin deney tüplerine eklenir. Tüpler 37° C'de 5 dk bekletilir ve örnekler 20-100 µL veya optimize edilmiş miktarda eklenerek reaksiyon başlatılır. 10-30 dk beklenildikten sonra reaksiyon iki farklı şekilde sonlandırılabilir. Birincisinde reaksiyon yukarıda hazırlanmış olan reçinenin (1-2 ml) tüplere eklenmesi ile sonlandırılır. Daha sonra ortama 5 ml su eklenir tüpler karıştırılır ve 10 dk reçinenin çökmesi beklenilir. Supernatan alınır ve sintilasyon solusyonu eklenerek sayım yapılır. Buradaki sayım [3 H] L-sitrulin düzeyini gösterir. Reçinedeki [3 H] L-arginin tüplere 0.1 M NAOH (2-5 ml) eklenmesi, tüplerin karıştırılması, reçinenin çökmesi ve supernatandaki radyoaktivitenin saptanması ile değerlendirilir. Diğer reaksiyon sonlandırılma tekniğinde deney tüplerine 20 mM HEPES (pH 7.2), 1 mM EDTA, NOS inhibitöru (S-ethylisothiourea veya L-NNA) içeren tamponla sonlandırılır ve örneklerdeki [3 H] L-sitrullin, [3 H] L-arginin yukarıda anlatıldığı gibi kolonlardan geçirilerek ayrıştırılır.

Kaynaklar 1. Methods in Molecular Biology. Vol 100. Nitric oxide protocols. Ed.Michael A. Titherradge Human Press Inc. Totowa NJ. 2. Gürdal, H, et. al. The role of nitric oxide synthase in reduced- vasocontractile responsiveness induced by prolonged αl-adrenergic receptor stimulation in rat thoracic aorta. Br. J. Pharmacol (basımda). 3. Ferro, A., Queen, L.R., Priest, R.M., Xu, B., Ritter, J.M., Poston, L., Ward, J. (1999) Activation of nitric oxide synthase by β2-adrenoceptors in human umbilical vein endothelium in vitro. Br. J. Pharmacol., 126, 1872-1880. 4. Brown, C.A., Patel, W., Wilkinson, G. & Boarder, M.R. (1996) P2 purinoceptor-stimulated conversion of arginine to citrulline in bovine endothelial cells is reduced by inhibition of protein kinase C, Biochem. Pharmacol., 52, 1849-1854.

[nguven]

Nitrik oksit miktarlarının kemilüminesans yöntemi ile ölçülmesi
Prof. Dr. A. Tuncay DEMİRYÜREK
Gaziantep Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Farmakoloji Ab.D., Gaziantep

Giriş ve genel bilgiler

Kemiluminesans yöntemi, mevcut olan en duyarlı ve doğru sonuç veren yöntemdir (Michelakis ve Archer, 1998). NO ile O3 arasındaki gaz fazı reaksiyonunun kinetiği 1954 yılında Johnston ve Crosby tarafından çalışılmıştır. İlk defa Fontijn ve ark. (1970) bu reaksiyondan yayılan ışığın şiddetini NO’nun miktarını hesaplamada kullanmışlar ve kemiluminesans yöntemini geliştirmişlerdir. Fakat, NO oksidasyon ürünlerini (NO2 - , NO3 - ) ölçmek için bunların uçucu olmadıkları ve O3 ile reaksiyona girmediklerinden, deney öncesinde NO’ya indirgenmesi gerekmektedir. Oda sıcaklığında birçok indirgeyici ajanla NO2 - , NO’ya indirgenebilir, fakat NO3 - ’ün NO’ya dönüşmesi için kuvvetli indirgeyici ajanlar ve yüksek sıcaklık gereklidir. 1980’de Cox ilk defa potasyum iyodür (KI) ve ferröz amonyum sülfat ve amonyum molibdatı indirgeyici ajan olarak kullanarak sulu solüsyonda NO2 - ve NO3 - ölçümü yapmıştır. Zafiriou ve McFarland (1980) NO-kemiluminesansı sistemini geliştirdiler. Braman ve Hendrix (1989) daha kuvvetli indirgeyici ajan olarak vanadyum (III) kullandı ve solüsyondaki NO2 - ve NO3 - ’den NO ölçümünü gerçekleştirdi. 1987’ de Palmer ve ark. kemiluminesans yöntemini kullanarak EDRF’nin NO olduğunu gösterdiler.

NO bir serbest radikaldir ve düşük konsantrasyonlarda ve oksijen yokluğunda stabil olmasına karşın oksijenin ve serbest oksijen radikallerinin bulunduğu biyolojik ortamda stabil değildir (Michelakis ve Archer, 1998). NO, gaz halindedir ve sudaki çözünürlüğü zayıftır. Hidrofobik özelliği ve ufak yapısı NO’nun fizyolojik fonksiyonları açısından çok önemlidir ve serbestçe hücre membranlarını geçebilmesine izin verir. Gaz fazında NO oksijenle reaksiyona girer ve NO2 - ve dinitrojen trioksit (N2O3) oluşturur (Henry ve ark., 1991).

2NO + O2 → 2NO2 -
NO + NO2 - → N2O3

Oksihemoglobin ve oksimiyoglobin gibi oksihemoproteinlerin yokluğunda sıvı fazda NO’ nun otooksidasyonu %100 oranında NO2 - oluşturur (Ignarro ve ark.,1993).

4NO + O2 + 2H2O → 4HNO2 → 4NO2 - + 4H+

Biyolojik sistemlerde NO, oksihemoproteinlerle NO3 - ’e (Ignarro ve ark., 1993) ve süperoksit anyonu varlığında peroksinitrite (ONOO- ) dönüşür (Beckman ve ark., 1990). İn vivo ortamda dominant olarak NO3 - oluşur ve kanda NO’nun majör metaboliti NO3 - ’dür (Moshage ve ark., 1995). Ayrıca kuvvetli okside edici ajanlar varlığında NO2 - ’den de NO3 - oluşur (Michelakis ve Archer, 1998). NO-kemiluminesansı, NO’nun ozonla olan reaksiyonunda oluşan nitrojen dioksitin (NO2) uyarılmış durumda olmasına dayanır (Clyne ve ark., 1964, Michelakis ve Archer, 1998).

NO + O3 → NO2 * + O2 → NO2 + hv

NO2 * ’nun stabil olmayan elektronları orijinal (ground state) durumuna döndüklerinde enerji yayarlar. Yayılan ışık, örnekteki NO içeriği ile lineer olarak ilişkilidir (Zafiriou ve McFarland, 1980, Archer ve ark., 1995). Işık yayılması sıcaklığa bağlıdır. NO’nun ozonla olan reaksiyonu hızlıdır (oda sıcaklığında hız sabitesi 10-7 L mol-1 s-1), bu durum NO düzeylerinin on-line izlenmesine olanak verir. Çok düşük aktivasyon enerjisi (10.5 KJ) olan NO + ozon reaksiyonunun aksine NO2 gibi diğer nitrojen oksitler yüksek enerjiye sahiptirler ve çok daha yavaş reaksiyona girerler (Johnston ve Crosby, 1954). Dolayısıyla, NO2 mevcut olsa da NO ile ozon arasındaki kemiluminesans reaksiyonunu etkilemez. Aynı durum CO2, C2H4, CO, NH3, SO2 veya H2O gibi diğer maddeler için de doğrudur (Fontijn ve ark., 1970). Bu reaksiyonun yüksek hız ve spesifik oluşu, NO ölçümünde yöntem olarak kullanılmasını cazip hale getirmiştir.

Materyal

NO-kemiluminesans analizörü

NO-kemiluminesans analizörü, bir reaksiyon kabini, yayılan ışığı toplayıp elektrik sinyaline dönüştüren bir ışık dedektörü ve bir kaydediciden oluşur (Şekil 1). Kemiluminesans reaksiyonunun gerçekleştiği reaksiyon kabinine analiz edilecek örnek ve ozon jeneratöründen oluşan ozon gelir. Kabindeki basınç bir vakum pompası ile sabit bir şekilde düşük (1-15 mmHg) tutulur. Reaksiyon kabinine gelen örneğin akış hızı bir iğne valf aracılığıyla kontrol edilir ve hızla yükselen NO piki verecek şekilde ayarlanır. Kabinden çıkan ozon, NO, NO2 gibi gazlar kömür filtreden geçirilerek atılır. NO2 * 600 nm’nin üzerinde (660-900 nm, Zafiriou ve McFarland, 1980) zayıf kızıl ve kızılötesi ışık yayar ve sistemdeki fotomultiplier ışık dedektörü spektrumun kızıl ucunda düşük düzeydeki ışığa duyarlıdır. İnternal soğutucu, fotomultiplier tüpün sıcaklığını yaklaşık -12o C’de tutar ve bu soğutma sinyal/gürültü oranını büyük oranda düşürür. En yaygın olarak kullanılanı: Sievers® Nitric Oxide Analyzer (NOA 280i) (www.ionicsinstruments.com/ionics/). Sensitivitesi (ölçüm sınırı) gaz fazındaki NO için < 1 ppb, sıvı örneklerdeki NO için 1 pikomol olarak verilmektedir (Sievers Manual).

Gaz
Azot veya helyum gazı ve %100 oksijen gazı

Kimyasallar
NO2 - /NO3 - içermeyen deiyonize su
Nitrit için: Glasiyel asetik ait, sodyum veya potasyum iyodür, sodyum veya potasyum nitrit
Nitrat için: 1 M HCl, vanadyum III klorür, sodyum veya potasyum nitrat, 1 M NaOH



Şekil 1. NO-kemiluminesans sisteminin şematik görünümü (Yang ve ark., 1997)

Metod

NO-kemiluminesans reaksiyonu gaz fazında gerçekleşir. Sıvı örnek ölçülecekse, analizöre girmeden önce gaz fazına dönüştürülmelidir. Yöntemin tamamen gaz fazında gerçekleşmesi spesifikliğini artırmaktadır ve ölçülecek madde uçucu olmalı ve ozonla reaksiyonunda ışık oluşturmalıdır.

Gaz örneklerde (solunum havasında) NO ölçümü

Bilinen miktarda NO içeren (100-1000 ppb) NO gazı direkt olarak analizöre uygulanarak kalibrasyon yapılır. Ekspirasyon havası NO ile reaksiyona girmeyen floroetil propilen yapısındaki özel torbalara toplanır ve daha sonra torbalar NO analizörüne bağlanarak ölçüm yapılır. Ağza yerleştirilen bir tüp aracılığı ile direkt solunum havasındaki NO’nun ölçülmesi de mümkündür. Endojen NO’nun ekspirasyon havasında ölçülebileceği ilk defa 1991 yılında yapılan bir çalışma ile tavşan, kobay ve insanda gösterilmiştir (Gustafsson ve ark., 1991). NO inflamasyonda yüksek miktarlarda oluşabileceğinden, akciğer inflamasyonu veya astması olan hastalarda solunum havasındaki NO’yu ölçmek yararlı olabilir. Solunum havasındaki NO’nun pulmoner vasküler enoteliyumdan (Borland ve ark., 1993), terminal ve respiratuar bronşiyol epitelinden (Persson ve ark., 1993), nazofarinksten (Gerlach ve ark., 1994) ve paranazal sinüslerden (Lundberg ve ark., 1994, 1995) kaynaklandığı ileri sürülmüştür. Soluk havasındaki NO düzeylerinin en fazla burunda ölçülmesi, ağızda, trakeada ve distal havayolunda giderek düşen miktarların saptanması ve nazal olarak uygulanan topikal steroid beklometazon ile nazal NO’nun azalması, insanlarda NO’nun muhtemelen iNOS aracılıklı olarak burunda ve paranazal sinüslerde sentez edildiğini düşündürmektedir (Dillon ve ark., 1996).

NO-kemiluminesans yöntemi hızlı ve duyarlıdır (ölçüm eşiği 1 ppb) ve tekrarlanabilir sonuçlar vermektedir. Sağlıklı kişilerde solunum havasındaki NO nazal kaviteden orijin almasına karşın, ciddi akciğer inflamasyonunda bu durum değişmektedir. Örneğin, astmada aşağı havayolundan kaynaklanan NO miktarı anlamlı olarak artmaktadır (Alving ve ark., 1993). Dolayısıyla, bu yöntem astmanın alevlenmesinin klinik olarak belirlenmesinde yardımcı olabilir. Yetişkinlerde ve çocuklarda ekshale edilen aşağı respiratuar NO ve nazal NO’nun ölçümü ile ilgili standart prosedürler yayınlanmakta (Recommendations, 1999) ve güncelleştirilmektedir (ATS/ERS Recommendations, 2005).

Sıvı örneklerde NO ölçümü

NO2 - ölçümü: Taze hazırlanmış ve ışıktan korunmuş nitrit (NaNO2) standartları ile dilüsyonlar hazırlanır. Azot veya helyum gazı ile havalandırılan 3 ml 1 M KI ve 3 ml 1 M HCl içerisine belirli bir hacimde standart enjeksiyonları ile kalibrasyon eğrisi çıkarılır. Sodyum iyodür (NaI) ve krom (III) de NO2 - ’yi NO’ya dönüştürür (Yang ve ark., 1997). Örnekler gaz geçirmeyen enjektörlerde toplanır. Perfüze organ deneyleri gibi in vitro deneylerde NO saptanmasını artırmak için örneklerde O2 ve oksidanların miktarı azaltılması gibi çeşitli stratejiler kullanılabilir. Küçük miktardaki NO’ yu stabilize etmek için, bu stratejiler arasında hipoksi uygulaması ve süperoksit dismutaz (SOD) eklenmesini sayılabilir (Archer ve Cowan, 1991). Fakat, hipoksinin NOS aktivitesini modüle ederek indirekt olarak (McQuillan ve ark., 1994, Tai ve ark., 2004), veya NO’nun partitisyonunu etkileyerek direkt olarak (Archer ve ark., 1995) NO düzeylerini etkileyebileceğini bilmek gerekir. SOD, arter halkalarında oluşan NO’yu saptamada kullanılmıştır (Archer ve Cowan, 1991), fakat bu uygulamada NO’nun NO2 - ’ye oksidasyonunu önlemez. Örnekler, KI ve HCl karışıma enjekte edilir ve oluşan pikler kaydedilir. Örnekler eğer protein içeriyorsa, köpük önleyici ajan katılabilir. Örneklerdeki NO2 - miktarı standart eğri kullanılarak belirlenir. Örnek enjeksiyonu 2-3 kez yapılarak tekrarlanır. Herbiri 100 l olan örnekten yaklaşık 5 enjeksiyondan sonra KI, HCl ve köpük önleyici ajan yenisiyle değiştirilir.

Asit varlığında, NO2 - nitrosonyum iyonuna (NO+ ) dönüşür.
NO2 - + 2H+ → NO+ + H2O
NO+ hızla iyod (NaI veya KI) veya vanadyum (III) gibi nükleofillerle reaksiyona girer ve NO oluşur.
NO+ + I- → ONI 2ONI → 2NO + I 2 veya özetle: NO2 - + 2H+ + e- → NO + H2O

NO3 - ölçümü: Taze hazırlanmış ve ışıktan korunmuş nitrat (NaNO3) standartları ile dilüsyonlar hazırlanır ve nitrit ölçümündeki gibi kalibrasyon eğrisi çıkarılır. Burada vanadyum ve asit ortam 90-95o C’ye ısıtılır. Oda sıcaklığında, vanadyum (III) NO2 - ’yi indirgerken, NO3 - ’ü indirgemez. Sıcaklık 90-95o C’ye çıkarılması ile NO3 - ’de NO’ya dönüşür. Örnekteki NO3 - ’ün NO2 - ’ye dönüştürmede kullanılan diğer protokoller arasında bakırplakalı kadmiyum dolgulu kolonlar (Green ve ark., 1991), hidrazin (Kempers ve Luft, 1988), bakteriyel (Granger ve ark., 1990, Archer ve ark., 1995) ve pürifiye edilen (Aspergillus spp.) nitrat redüktazlar (Moshage ve ark., 1995) bulunur. Ticari olarak bulunan nitrat redüktazlar oldukça pahalıdır. Escherichia coli veya Pseudomonas oleovorans nitratı nitrite metabolize eder sonrasında bakteri santrifüj ile uzaklaştırılır (Hibbs ve ark., 1992). Örnekler protein içeriyorsa, köpük önleyici ajan kullanılabilir. Örneklerdeki NO3 - miktarı standart eğri kullanılarak belirlenir. Oluşan pik, örnekteki total NO2 - + NO3 - içeriğini yansıtır. Örnek enjeksiyonu 2-3 kez yapılarak tekrarlanır. Herbiri 100 µl olan örnekten yaklaşık 5 enjeksiyondan sonra vanadyum, HCl ve köpük önleyici ajan yenisiyle değiştirilir. Bu yöntem NO2 - ölçümü için oda sıcaklığında yapılabilir. Bu değerler, 90-95o C’de ölçülen değerlerden çıkarılarak NO3 - içeriği belirlenebilir. Asidik ortamda kuvvetli indirgeyici ajanlar, vücut sıvılarındaki nitrosotiyolleri ve nitrosoaminleri de NO’ya indirger (Walters ve ark., 1987).

2 NO3 - + 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2 + + 4H+

Doku homejanatlarından da NO ölçümü yapılabilmektedir. Doku makasla ince parçalar haline getirilir ve soğutulmuş 5 hacim fosfat tamponlu salin (pH 7.4) eklenerek buz içinde bir homojenizatör kullanılarak homojenize edilir. Sonra 10 dak 14 000 rpm’de santrifüj edilir ve pelletler atılır. Süpernatant, 1:2 v/v oranında soğutulmuş (0o C) absolu etanol ile deproteinize edilir ve örnekler 30 dak 0o C’de inkübe edildikten sonra 14 000 rpm’de 5 dak santrifüj edilir. Süpernatant NO ölçümü için kullanılır (Tejero-Taldo ve ark., 2002). Doku örnekleri nmol/mg protein olarak hesaplanır. Ölçümlerimizde ve analizde NOAnalysisTM (version 3.21, Sievers, Boulder, CO, A.B.D.) programı kullanılmaktadır.

NO-kemiluminesansı, tamamıyla olmasada yüksek oranda NO için spesifiktir. Sülfidler, aminler, H2S gibi kemiluminesans sinyali verebilen diğer birkaç madde ya uçucu değildir, NO’dan belirgin olarak daha düşük partitisyon katsayısı küçüktür veya biyolojik sistemlerde oluşmaz. Kemiluminesans oluşturabilen bir çok radikal dedektöre girmeden önce yıkılır. Dedektör NO2 için duyarlı değildir. Solvan olarak yaygın bir şekilde kullanılan dimetil sülfoksit yüksek dozlarda kemiluminesans sinyali verebilmektedir (Archer, 1993). Düşük dozlar (10 ml için 0.1 ml’den az) kullanılarak veya fotomultiplier önüne kızıl cut-off filtre yerleştirilerek bu sinyal önlenebilir. NaOH, hidrojen sülfürü uzaklaştırmak için kullanılabilir (Michelakis ve Archer, 1998). Greenberg ve ark. (1995) nitro içeren L-arjinin analogları NG-nitro-L-arjinin metil esteri (L-NAME) ve NG-nitro-L-arjininin (L-NA) kemiluminesans yöntemiyle etkişim gösterdiğini bildirdiler. L-NAME, L-NA ve aminoguanidinin sıçanlara in vivo uygulaması plazma NO düzeylerini anlamlı olarak artırırken, N5 - iminoetil-L-ornitin (L-NIO), 3-amino-1,2,4- triazin (3-AT) ve L-NG-monometilarjinin (LNMMA) ile artma olmamaktadır. İn vitro HEPES tampon solüsyonuna L-NAME, DNAME ve L-NA ilavesi kemiluminesans sinyali oluşturmaktadır (Greenberg ve ark. 1995).

NO-kemiluminesans analizörü kullanılarak Snitrosotiyollerin (Fang ve ark., 1998, Ewing ve Janero, 1998), S-nitrosohemoglobin (Gladwin ve ark., 2000) ve hemoglogine bağlı NO’nun (Rogers ve ark., 2005) ölçülebileceği bildirilmiştir.

Kaynaklar Alving K, Weitzberg E, Lundberg JM. Increased amount of nitric oxide in exhaled air of asthmatics. Eur Respir J. 1993;6(9):1368-70. Archer S. Measurement of nitric oxide in biological models. FASEB J. 1993;7(2):349-60. Archer SL, Cowan NJ. Measurement of endothelial cytosolic calcium concentration and nitric oxide production reveals discrete mechanisms of endothelium-dependent pulmonary vasodilatation. Circ Res. 1991;68(6):1569-81. Archer SL, Shultz PJ, Warren JB, Hampl V, DeMaster EG. Preparation of standards and measurement of nitric oxide, nitroxyl, and related oxidation products. Methods 1995;7:21-34. ATS/ERS Recommendations for Standardized Procedures for the Online and Offline Measurement of Exhaled Lower Respiratory Nitric Oxide and Nasal Nitric Oxide, 2005. Am J Respir Crit Care Med. 2005;171(8):912-930. Beckman JS, Beckman TW, Chen J, Marshall PA, Freeman BA. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci U S A 1990;87(4):1620-4. Borland C, Cox Y, Higenbottam T. Measurement of exhaled nitric oxide in man. Thorax 1993;48(11):1160-2. Braman RS, Hendrix SA. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium (III) reduction with chemiluminescence detection. Anal Chem. 1989;61(24):2715-8. Clyne MAA, Thrush BA, Wayne RP. Kinetics of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. Trans. Faraday Society, 1964; 60:359-370. Cox RD. Determination of nitrate and nitrite at the parts per billion level by chemiluminescence. Anal. Chem. 1980;52:332-5. Dillon WC, Hampl V, Shultz PJ, Rubins JB, Archer SL. Origins of breath nitric oxide in humans. Chest 1996;110(4):930-8. Ewing JF, Janero DR. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozonechemiluminescent detection. Free Radic Biol Med. 1998;25(4-5):621-8. Fang K, Ragsdale NV, Carey RM, MacDonald T, Gaston B. Reductive assays for S-nitrosothiols: implications for measurements in biological systems. Biochem Biophys Res Commun. 1998;252(3):535-40. Fontijn A, Sabadell AJ, Ronco RJ. Homogeneous chemiluminescent measurement of nitric oxide with ozone. Implications for continuous selective monitoring of gaseous air pollutants. Anal. Chem. 1970;42:575-9. Gerlach H, Rossaint R, Pappert D, Knorr M, Falke KJ. Autoinhalation of nitric oxide after endogenous synthesis in nasopharynx. Lancet 1994;343(8896):518-9. Gladwin MT, Shelhamer JH, Schechter AN, PeaseFye ME, Waclawiw MA, Panza JA, Ognibene FP, Cannon RO 3rd. Role of circulating nitrite and S-nitrosohemoglobin in the regulation of regional blood flow in humans. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97(21):11482-7. Granger DL, Hibbs JB Jr, Perfect JR, Durack DT. Metabolic fate of L-arginine in relation to microbiostatic capability of murine macrophages. J Clin Invest. 1990;85(1):264-73. Green LC, Ruiz de Luzuriaga K, Wagner DA, Rand W, Istfan N, Young VR, Tannenbaum SR. Nitrate biosynthesis in man. Proc Natl Acad Sci U S A 1981;78(12):7764-8. Greenberg SS, Xie J, Spitzer JJ, Wang JF, Lancaster J, Grisham MB, Powers DR, Giles TD. Nitro containing L-arginine analogs interfere with assays for nitrate and nitrite. Life Sci. 1995;57(21):1949-61. Gustafsson LE, Leone AM, Persson MG, Wiklund NP, Moncada S. Endogenous nitric oxide is present in the exhaled air of rabbits, guinea pigs and humans. Biochem Biophys Res Commun. 1991;181(2):852-7. Henry Y, Ducrocq C, Drapier JC, Servent D, Pellat C, Guissani A. Nitric oxide, a biological effector. Electron paramagnetic resonance detection of nitrosyl-iron-protein complexes in whole cells. Eur Biophys J. 1991;20(1):1-15 Hibbs JB Jr, Westenfelder C, Taintor R, Vavrin Z, Kablitz C, Baranowski RL, Ward JH, Menlove RL, McMurry MP, Kushner JP, Samlowski WE. Evidence for cytokine-inducible nitric oxide synthesis from L-arginine in patients receiving interleukin-2 therapy. J Clin Invest. 1992;89(3): 867-77. Ignarro LJ, Fukuto JM, Griscavage JM, Rogers NE, Byrns RE. Oxidation of nitric oxide in aqueous solution to nitrite but not nitrate: comparison with enzymatically formed nitric oxide from Larginine. Proc Natl Acad Sci U S A 1993;90(17):8103-7. Johnston HS, Crosby HJ. Kinetics of the fast gas phase reaction between ozone and nitric oxide. J. Chem. Phys. 1954;22:689-92. Kempers AJ, Luft AG. Re-examination of the determination of environmental nitrate as nitrite by reduction with hydrazine. Analyst. 1988;113(7):1117-20. Lundberg JO, Farkas-Szallasi T, Weitzberg E, Rinder J, Lidholm J, Anggaard A, Hokfelt T, Lundberg JM, Alving K. High nitric oxide production in human paranasal sinuses. Nat Med. 1995;1(4):370-3. Lundberg JO, Rinder J, Weitzberg E, Lundberg JM, Alving K. Nasally exhaled nitric oxide in humans originates mainly in the paranasal sinuses. Acta Physiol Scand. 1994;152(4):431-2. McQuillan LP, Leung GK, Marsden PA, Kostyk SK, Kourembanas S. Hypoxia inhibits expression of eNOS via transcriptional and posttranscriptional mechanisms. Am J Physiol. 1994;267(5 Pt 2):H1921-7. Michelakis ED, Archer SL. The measurement of NO in biological systems using chemiluminescence. In: Methods in Molecular Biology, Nitric Oxide Protocols, Ed. M.A. Titheradge, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, 1998, pp.111-127. Moshage H, Kok B, Huizenga JR, Jansen PL. Nitrite and nitrate determinations in plasma: a critical evaluation. Clin Chem. 1995;41(6 Pt 1):892-6. Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 1987;327(6122):524-6. Persson MG, Wiklund NP, Gustafsson LE. Endogenous nitric oxide in single exhalations and the change during exercise. Am Rev Respir Dis. 1993;148(5):1210-4. Recommendations for standardized procedures for the on-line and off-line measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide in adults and children-1999. This official statement of the American Thoracic Society was adopted by the ATS Board of Directors, July 1999. Am J Respir Crit Care Med. 1999;160(6):2104-17. Rogers SC, Khalatbari A, Gapper PW, Frenneaux MP, James PE. Detection of human haemoglobin-bound nitric oxide. J Biol Chem. 2005 (in press). Tai SC, Robb GB, Marsden PA.Endothelial nitric oxide synthase: a new paradigm for gene regulation in the injured blood vessel. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24(3):405- 12. Tejero-Taldo MI, Gursoy E, Zhao TC, Kukreja RC. -adrenergic receptor stimulation produces late preconditioning through inducible nitric oxide synthase in mouse heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 2002;34:185-95. Walters CL, Gillatt PN, Palmer RC, Smith PL. A rapid method for the determination of nitrate and nitrite by chemiluminescence. Food Addit Contam. 1987;4(2):133-40. Yang F, Troncy E, Francoeur M, Vinet B, Vinay P, Czaika G, Blaise G. Effects of reducing reagents and temperature on conversion of nitrite and nitrate to nitric oxide and detection of NO by chemiluminescence. Clin Chem. 1997;43(4): 657-62. Zafiriou OC, McFarland M. Determination of trace levels of nitric oxide in aqueous solution Anal. Chem. 1980;52:1662-7.

[nguven]

Nitrik oksit miktarlarının amperometrik (elektrokimyasal) yöntem ile ölçülmesi
Doç Dr. Kansu BÜYÜKAFŞAR
Mersin Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Farmakoloji Ab.D., Mersin

NO tayini ile ilgili bir çok yöntem olmasına karşın bu yöntemlerin bir kısmı gelişmiş ve pahalı cihazlara (EPR spektroskopisi ve kemilüminesans) ihtiyaç gösterirken bir kısmı ise gerekli hassasiyetin dışında (UV/VIS spektroskopisi) olabilmektedir. Ancak son birkaç yıldır oldukça hassas ölçüm limiti (nM düzeylerinde) olan elektrokimyasal metodlar geliştirilmiştir. Bugün dünyada ticari olarak mevcut ve kolay elde edilebilir olmasından dolayı en çok kullanılan elektrokimyasal sensörlerden biri, Clark tipi elektrodlardır. Bu sensorün ölçüm esası, NO’nun gaz geçirgen bir membrandan ve ince bir elektrolit tabakasından diffüzyonu ve bunu takiben ölçüm elektrodlarını okside etmesine dayalıdır.



Şekil 1. Amperometrik esasa göre ölçüm yapan bir NO probu (WPI). Probun gaz geçirgen membranından geçen NO gazı, elektrolidle dolu elektrodun içinde kendi konsantrasyonu ile orantısal bir akım yaratır. Bu akımın şiddeti WPI NO-metrede amplifiye edilerek veri kaydedici ortama aktarılır

Bu oksidasyon, membranın dışındaki NO’nun konsantrasyonu ile orantısal bir akım yaratır. Üretici firmaya göre, bu elektrodlar (sensorlar, problar) O2, N2, NO2 ve CO’e duyarsız iken CO2’ye duyarlı olabilmektedir. CO2 esasında prob ile elektrokimyasal etkileşmeye girmez, fakat sensor içindeki elektrolitin pH’sını düşürür ve böylece etkileşme gösterir. Kimi kaynaklara göre elektrodların tayin limitleri yaklaşık 20 nM’den 10 mM’ya kadar uzanır. Bu değerler kemilüminesans ve EPR’dan yaklaşık 10 kez daha daha yüksek hassasiyete işaret etmektedir. Elektrokimyasal yönteme dayalı Clark probları porfirinik esaslı NO sensorlarından daha az duyarlıdır ancak bu son problar ticari olarak mevcut değildir. Diğer bir NO tayin yöntemi ise oksihemoglobinin NO tarafından methemoglobine dönüşümünü içeren yöntemdir ve 401 veya 577 nm’de fotometrik olarak yapılır. Bu yöntemin duyarlılığı Clark ile mukayese edilebilir düzeydedir, fakat gerekli selektiviteden yoksun olabilmektedir. Çünkü HbO2’nin Met-Hb’e dönüşümü aynı zamanda süperoksid anyonları ile de gerçekleşir ve NO’nun yaptığı spektral değişim, aynı zamanda ONOO- tarafından da oluşturulur. Bu tür etkileşmeler elektrokimyasal NO tayini ile görülmez (Schmidt ve diğ. 1998; World Presicion Instruments (WPI) NOmetre kullanım kitapçığı ve kataloğu). Diğer taraftan Clark elektrodları ile NO tayininde bir çok avantaj bulunmasına karşın bu probların kullanımı onların oldukça uzun reaksiyon zamanı (yaklaşık 2-3 sn) ile kısıtlanır. Ancak porfirinik esaslı NO problarında bu latent süre 10 ms civarındadır. NO’nun oksihemoglobin ile olan reaksiyonu da oldukça hızlıdır. Bu durum NO’nun akım sistemlerinde geçici değişikliklerin ölçüldüğü veya NO’nun diğer moleküllerle oluşturduğu hızlı reaksiyona girdiği deney sistemlerinde özellikle önemlidir. Bu kısıtlamalara rağmen Clark tip NO probları bir çok deneysel durumda kullanılan önemli araçlardır. NO-metre veri kaydedici bir sisteme (Duo-18 veya basit bir program ya da Biopac veya Powerlab-MacLab) ve oradan da bir bilgisayara bağlanır. NO’nun ölçüleceği kabın dibine manyetik karıştırıcı konur ve sürekli karıştırılır. NO tayini yapılırken karıştırma yapmanın karıştırma yapmamaya göre anlamlı olarak daha fazla NO sinyali ürettiği tespit edilmiştir. Gerekirse NO’nun ölçüleceği kabın ağzı kauçuk bir tıpa ile kapatılır fakat uygulama yapmaya uygun iğneler yerleştirilir, ya da WPI firmasının geliştirdiği gaz geçirmez haznelerde deneyler yapılır. Prob NO’nun ölçüleceği sıvıya daldırılır ve akımın stabil olmasına dek beklenir. Stabil olduktan sonra cihaz üzerindeki bir düğme ile akım değeri sıfırlanır ve deneye başlanır. Akım sistemlerinde de NO ölçümü yapılabilir. Bunun için, Tadaptör kitlerine ihtiyaç vardır. Eğer bazal akım sabitse, akımın hızı 14 ml/dk’ya çıkmasına rağmen NO-metre üzerindeki sinyal değişmez.

Probların bakımı
Kullanılan problar 5 dk boyunca distile su içinde tutularak temizlenir. Protein içeren solüsyonlarda kullanılan problar, proteaz içeren solüsyonlarda birkaç dk tutularak yapışmış proteinler temizlenebilir ve sonra distile su içinde 15-20 dk bekletilir. Bu arada manyetik karıştırıcı sürekli ortamı karıştırırsa, daha iyi temizleme sağlanmış olur. Sensor deneylerde kullanılmayan zamanlarda da yine distile su içinde bekletilmelidir. Kullanılmayan yeni problar serin, kuru ve güneş ışığı almayan ortamlarda saklanmalıdır.

Kalibrasyon
Kalibrasyon için, nitrit standart solüsyonu kullanılır (0.1 veya 1 mM KNO2). Her gün taze hazırlanır. H2SO4+KI karışımı ile değişik konsantrasyonlarda standartlarla konsantrasyon/piko-amper değerleri alınır.

2KNO2 + 2KI + 2H2SO4 → 2NO + I2 + 2H2O + 2K2SO4

1. Kalibrasyon solüsyonu (0.1 M H2SO4 içinde 0.1 M KI solüsyonu (25 o C) 1 dk boyunca helyum ya da argon ile gazlandırılır ve ölçüm kabına 1.8 ml olacak şekilde ilave edilir.
2. Kabın ağzı kauçuk tıpa ile kapatılır ve NO probu kabın içine daldırılır.
3. NO-metredeki akım göstergesi stabil oluncaya kadar beklenir.
4. 7.2 ml 0.1mM KNO2 solüsyonu viyale injekte edilir. 0.4 µM’luk bir NO konsantrasyonu elde edilir.
5. Kalibrasyon eğrisi çizilir ve kalibrasyon faktörü (= duyarlılık) hesaplanır.

Başka bir kalibrasyon yöntemi ise NO-metrenin “slope” fonksiyonu ile yapılır. Buradaki prosedür ise aşağıdaki gibidir.

1. Kalibrasyon solüsyonu (0.1 M H2SO4 içinde 0.1 M KI solüsyonu (25 o C) 1 dk boyunca helyum ya da argon ile gazlandırılır ve ölçüm kabına 1.8 ml olacak şekilde ilave edilir.
2. Kabın ağzı kauçuk tıpa ile kapatılır ve NO probu kabın içine daldırılır.
3. NO-metredeki akım göstergesi stabil oluncaya kadar beklenir.
4. 3.6ml 1 mM KNO2 solüsyonu viyale injekte edilir. Bu 2 mM’lük bir NO konsantrasyonu oluşturacaktır. Göstergedeki NO sinyali stabil olur olmaz cihaz üzerindeki slope 2 mM’e ayarlanır.
5. Kalibrasyonu doğrulamak için 3.6 ml’lik bir injeksiyon daha yapılır. Bu durumda göstergede 3.8-4.2 mM’lük bir değer olmalı. Teorik ve hesaplanan NO konsantrasyonları 5%’den daha fazla farklı ise kalibrasyon tekrar edilir. Kalibrasyon için SNAP ile CuSO4 arasındaki reaksiyona dayalı bir yöntem daha vardır. Özellikle hassas probların kalibrasyonu bu şekilde yapılır (Nelli ve diğ., 2000).

Uyarılar
1. NO probları kullandıkça ömürleri azalmaktadır. Belirli bir süre kullanıldıktan sonra değiştirilmelidir.
2. NO metrenin düzeneğinin bağlandığı prizler topraklı olması, maksimum duyarlılık için gereklidir.
3. Ölçüm yaparken homojen dağılım yapabilmek için karıştırma esastır. Manyetik karıştırıcı mutlaka deney boyunca dönmelidir.
4. Elektrodları temizlerken ya da takarken maksimum dikkatle çalışılmalıdır zira membranlar hasar görebilir. Hasarlı problar 1 mM NaCl solüsyonuna daldırılırsa sürekli ve değişen genliği çok fazla olan bir akım verir.
5. Problar günden güne değişen sinyaller verebilir. Bundan dolayı her gün kalibrasyon gerekebilir.
6. Yalancı pozitif sinyallere karşı uyanık olunmalı, mutlaka kontrollü çalışılmalıdır (Schmidt ve diğ. 1998; WPI NO-metre kataloğu ve kullanım klavuzu)

Amperometrik esasa göre NO düzeylerinin ölçüldüğü çalışmalarımız

Yaptığımız tüm çalışmalar hücresiz (cell-free) ortamlarda gerçekleştirildi. Nitroksil anyonunun (NO- ) bazı ajanlar tarafından nitrik oksid radikaline dönüşümü incelendi. Ayrıca UV ışığı ile fotosensitif olduğunu düşünülen bir takım bileşiklerden (NaNO2, SNP, 3-nitrotirozin, NG-nitro-L-arginin) olası NO oluşumunu araştırıldı. Nitroksil vericisi olarak Angeli tuzu kullanıldı (Na2N2O3). Bu madde pH 9’un üstünde HNO olarak bulunur. Bu asidin iyonizasyonu sonucu NO- anyonu açığa çıkmaktadır.

Na2N2O3 → HNO → NO- + H+





Kaynaklar 1. Büyükafşar K, Nelli S, Martin W. K. Büyükafşar, S. Nelli, W. Martin. Formation of nitric oxide from nitroxyl anion: Role for quinone and ferricytochrome c. Br. J. Pharmacol., 132: 165- 172, 2001. 2. Büyükafşar K, Levent A, Ün İ, Ark M, Arıkan O, Özveren E. Mediation of nitric oxide from photosensitive stores in the photorelaxation of the rabbit corpus cavernosum. Eur. J. Pharmacol., 459: 263-267, 2003. 3. Nelli S, Hilen M, Büyükafşar K, Martin W. Oxidation of nitroxyl anion to nitric oxide by copper ions. Br. J. Pharmacol., 131: 356-362, 2000. 4. Schmidt K and Bernd Mayer. Determination of NO with a Clarck-type electrode. Methods in Molecular Biology. Nitric oxide protocols Ed. By Titheradge MA, vol. 100, s. 101-109. Humana Pres Inc. Towoto, NJ, ABD, 1998. 5. World Precision Instruments. Laboratory Equipment for the life sciences kataloğu, International Edition, s. 43-50, 2005.

[nguven]

Nitrik oksit miktarlarının Griess yöntemi ile ölçülmesi
Doç Dr. Bahar TUNÇTAN
Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Ab.D., Mersin

Nitrik oksit (NO) biyolojik sistemlerde NO sentaz NOS adı verilen bir enzim tarafından oluşmaktadır. Bazik bir amino asit olan L-arjininden NO oluşumuna neden olan NOS enziminin nöronal NOS (nNOS, NOS I), endoteliyal NOS (eNOS, NOS III) ve iNOS (NOS II) olmak üzere üç farklı izoformu bulunur. nNOS ve eNOS yapısal enzimlerdir; iNOS ise çeşitli uyarılar ile indüklenebilmektedir. yNOS olarak da bilinen eNOS ve nNOS kalsiyum ve kalmoduline bağımlı, iNOS ise kalsiyum ve kalmodulinden bağımsız izoformlardır. NOS moleküler oksijen, L-arjinin ve nikotinamit dinükleotit fosfat (NADPH) kullanarak NO, sitrülin ve NADP+ oluşumuna neden olur. Bu olaylar sırasında NOS flavin mononükleotit (FMN), flavin adenin dinükleotit (FAD), hem, kalmodulin ve tetrahidrobiyopterin gibi ko-faktörler ile kalsiyum ve hem demiri gibi iki değerli katyonlara gerek duyar1,11,22. NOS enzimleri aracılığı ile oluşan NO biyolojik dokularda bir dizi reaksiyona girer. Bunlardan nitrit ve nitrat oluşumu ile ilgili olan reaksiyonlar;

2NO + O2 → 2NO2
2NO2 ↔ N2O4
N2O4 + 2OH- → NO2 - + NO3 - + H2O
NO2 + NO → N2O3
N2O3 + 2OH- → 2NO2 - + H2O

Yapısal NOS enzimleri submikromolar miktarlarda NO oluşumuna neden olur. Örneğin, damar endotel hücrelerinde bulunan eNOS tarafından oluşturulan NO 2-20 nmol/l kadardır; bu miktarın sirkülasyona yansıyan kısmı ise 1-10 nmol/l kadardır. Tersine, iNOS ile oluşan NO miktarı hücreden hücreye değişmek koşulu ile 10 µM'a kadar ulaşabilir. In vitro olarak, iNOS eksprese eden hücrelerde 24 saat veya daha fazla bir süre içerisinde 5 µM'den fazla NO oluştuğu bildirilmiştir11,12. NO yarılanma ömrü çok kısa olan bir bileşiktir. Kan gibi fizyolojik ortamlarda yarılanma ömrü 6-20 saniye kadardır ve bu durum bazal koşullarda NO ölçümünü güçleştirmektedir4,13,14. NO, her ne kadar elektrokimyasal ve kemilüminesans gibi yöntemler ile direkt olarak ölçülebilse de, hızlı ve basit bir yöntem olarak çoğu örnekte NO metabolizmasının dayanıklı son ürünleri olan nitrit (NO2 - ) ve nitrat (NO3 - ) miktarlarının ölçülmesi de sıklıkla kullanılmaktadır. Griess yöntemi ile duyarlılık limitinin 0.1-1 µM kadar olduğu bildirilmiştir14. NO metabolizmasının incelenmesi için sadece nitrit miktarlarının ölçümü sıklıkla kullanılsa da, bu reaksiyonlar sonucunda nitratın da oluştuğu ve biyolojik sistemlerde nitritin hem demiri içeren proteinler varlığında nitrata okside olduğu da unutulmamalıdır 8 . Fizyolojik koşullarda NO yaklaşık 3:2 oranında nitrit ve nitrata okside olmaktadır. Oksijenlenen çözeltilerde nitritin nitrata dönüşümü oldukça yavaştır. Bütün bunlar ile birlikte, nitrit ve nitratın oluşum oranları değişken ve örneğe de bağlı olduğundan, NO metabolizmasının derecesinin en iyi göstergesi nitrit ve nitratın ikisinin birden (NOx olarak ifade edilir) ölçülmesi ile elde edilen sonuçlardır. Nitrit vücut sıvılarında nitrattan daha az konsantrasyonda bulunduğundan, çoğu durumda NOx nitrat konsantrasyonlarını ifade eder. Bazı çalışmalarda "nitrit ve nitrat" ölçüldüğü halde, sıklıkla yanlış olarak sonuçlar "nitrit" olarak ifade edilmektedir; araştırıcılar bu durumun karışıklığa neden olduğunu belirtmekte ve terminolojiye dikkat edilmesi gerektiğini vurgulamaktadırlar4,5,20. Nitrit ölçümü için 50'den fazla kolorimetrik yöntem kullanılmıştır; bu yöntemlerden çoğu azo boyalarının oluşumu temeline dayanmaktadır 16. Günümüzde, örneklerdeki nitrit ve nitrat miktarları iki aşamalı bir yöntem ile ölçülmektedir. Öncelikle nitrat enzimatik dönüşüm17,30,32 veya metalik kadmiyum3,6 ile nitrite indirgenir. Oluşan toplam nitrit ise hemen hemen her örnekte kullanılabilecek bir yöntem olan Griess yöntemi ile ölçülür. Griess yöntemi nitritin asidik ortamda primer bir aromatik amin ile (sülfanilamit) diazotizasyonu ve N-(1-naftil)etilendiamin hidroklorit (NED) ile mor renkli bir azo ürünü oluşturması esasına dayanır (Griess reaksiyonu) (Şekil 1). Griess reaksiyonu, nitrit iyonlarına duyarlı olduğundan, ortamdaki nitratın nitrite indirgenmesi in vivo olarak oluşan NO’nun gerçeğe yakın miktarlarda ölçümüne olanak tanımaktadır 4,5,18-20. Diğer yandan, Griess yönteminin submikromolar düzeyde NO ölçümü için uygun olmadığı, ancak, nitrit ve birlikte bulunan nitroksitlerin ölçümü için en uygun ölçüm yöntemi olduğu da düşünülmektedir2.



Şekil 1. Griess reaksiyonunda nitrozillenmiş sülfanilamidin NED ile etkileşmesi sonucu azo boyası ürünü oluşumundaki reaksiyonlar.

Griess yöntemi ile nitrit/nitrat düzeylerinin basit, duyarlı ve spesifik bir şekilde ölçülebilmesi yanında bazı noktalara dikkat edilmesi gerekmektedir. Bu yöntemin bir dezavantajı, ortamda KCl, Ca(NO3)2, NH4Cl, MgSO4 ve CuSO4 gibi maddelerin 10-4 M’dan daha düşük konsantrasyonlarda bulunması durumunda ± %0.2 kadar hatalı sonuçlar verebilmesidir10. Ayrıca, sistein, glutatyon, askorbik asit, NADH ve NADPH gibi indirgeyici maddeler3 ve L-arjinin analogları 7,15 ile de etkileşme olduğu bildirilmiştir.

Örneklerin hazırlanması

Örnekler buzlu ortamda toplanmalıdır ve -20° C'de saklanmalıdır; mümkün olduğunca çabuk analiz edilmelidir. Bakteri kontaminasyonu veya benzeri bir sorun olmuşsa, nitratın nitrite olası metabolizmasını önlemek için örnekler filtrasyon yöntemi ile sterilize edilmelidir. Asidik pH nitriti parçaladığından, asit özellikteki koruyuculardan kaçınılmalıdır. Plazma ve idrar örneklerinde nitrit konsantrasyonları, genellikle nitratın küçük bir fraksiyonudur (%5'ten az); bu durum nitrit ve nitratın diyet ile alınan ve bu iyonların biyoreaktivitesini yansıtır 5 .

Bazı araştırıcılar serum, plazma veya idrar örneklerinin ölçümden önce deproteinize edilmelerini önermektedir18. Proteinlerin çöktürülmesi genellikle gerekmez; ancak, proteinlerin çöktürülmesi gerekiyorsa nitrat-redüktaz enzimleri ile etkileşmeyen bir çöktürme yöntemi seçilmelidir20. Deproteinizasyon için kullanılan yöntemler ultrafiltrasyon, çinko sülfat, kadmiyum ve çeşitli asitler gibi maddeler ile örneğin muamelesidir9,6,31. Ancak, sonuçların plazma proteinlerinden anlamlı bir şekilde etkilenmediği de gösterilmiştir21. Diğer yandan, başlangıçta asit ve NED'den sonra sülfanilamit ilavesinin (NED'nin sülfanilik asit için yarışması azalacaktır) ve reaksiyon yürüdüğü sırada 4° C'de çalışılmasının yöntemin duyarlılığını artırdığı da bildirilmiştir18.

İdrar
İdrar örneklerindeki nitrit ve nitrat miktarı 200- 2000 µM arasında değişir. Bundan dolayı örneklerin yaklaşık 10 kat dilüe edilmesi gerekir. Dilüsyon için format nitrat redüktaz yönteminde distile su, NADP'ye bağımlı nitratredüktaz yönteminde ise sodyum fosfat tamponu kullanılmalıdır. Her iki yöntemde de %0.5-10 (h/h) arasındaki dilüsyonlar nitratın nitrite dönüşümünü etkilemez; ancak, NADP' ye bağımlı nitrat redüktaz yönteminde maksimum dönüşümü sağlama için daha uzun süre inkübasyon yapmak gerekebilir20. İdrarda bulunan nitrit ve nitrat mikrobiyal kontaminasyon olmadığı sürece dayanıklıdır. Örneklerin toplanması sırasında idrara antibiyotikler veya izopropanol ilavesinin kontaminasyonu önleyebildiği bildirilmiştir5 .

Hücre kültürü
Çoğu doku kültür ortamları yüksek miktarlarda nitrat içerir. Bundan dolayı, yüksek miktarda nitrat içeren ortam kullanılmasından kaçınılmalı ve düşük miktarda nitrat içeren ortamlar tercih edilmelidir. Bazı ortamlar ise, özellikle serum içeriyorlarsa, renk oluşumu ile etkileşir ve standart eğrininin doğrusallığında sapmalara neden olur. Bu durumda, gerek stok gerekse dilüsyonu yapılan standart nitrit ve nitrat çözeltileri kullanılan ortamda hazırlanmalıdır. NADPH'ye bağımlı nitrat-redüktaz yönteminde, maksimum dönüşümü sağlamak için gerekli inkübasyon süresinin belirlenmesi ve herhangi bir örnekte dönüşüm için gerekli sürenin belirlenmesi gerekir20.

Plazma

İnsan plazmasında bazal nitrit konsantrasyonları "ölçülemeyen", "nM'den fazla (450 nM)" ve "µM'den fazla (26 µM)" gibi ifade edilmektedir4 . Bu kadar çelişkili ifadelerin nedenleri arasında kanların toplanması sırasında kullanılan yöntemler ve/veya ölçüm yöntemleri arasındaki farklılıklar sayılmaktadır. İnsan da dahil olmak üzere dokuz farklı memeli türünde üç farklı yöntem ile ölçülen plazma nitrit konsantrasyonlarının 100-600 nM kadar olduğu gösterilmiştir. Sirküle eden nitrit miktarlarının %70-90 kadarının eNOS aktivitesi sonucunda oluştuğu da bildirilmiştir. Araştırıcılar, bazal plazma nitrit konsantrasyonlarının yNOS aktivitesini yansıttığına ve çeşitli memeli türlerinde NO kullanımının benzer şekilde olduğuna dikkat çekmişlerdir. Diğer yandan, plazma nitrat konsantrasyonlarındaki değişmeler NO oluşumunun bir göstergesi olarak değerlendirildiğinde dikkatli olunması gerektiği vurgulanmaktadır; şöyle ki, plazma nitritinden farklı olarak, nitrat konsantrasyonu akut NOS inhibisyonu sırasında anlamlı olarak değişmemekte ve diyet ve renal fonksiyondan etkilenmektedir4 .

Plazma örneklerindeki nitrit/nitrat miktarları deproteinizasyon işlemi yapılmadan da ölçülebilir; ancak, plazmanın format-nitrat redüktaz yönteminde distile su, NADPH'ye bağımlı nitrat-redüktaz yönteminde ise sodyum fosfat tamponunda %20 kadar dilüe edilmesi önerilmektedir. Plazmada büyük partiküller bulunuyorsa, etkileşmeyi önlemek için ölçümden önce örnekler santrifüj edilebilir veya filtre edilebilir. Dilüe plazma örneklerinin dönüşüm yüzdesini etkilememesine karşın, plazma Griess reaksiyonundaki nitrit miktarı ile etkileşir ve maksimum absorpsiyon yaklaşık %10 azalır. Bu durumda, distile suda hazırlanan standartlar ve dilüe edilmiş serum karşılaştırılabilir. Nitratın nitrite dönüşümü %95'ten daha azsa, dönüşüm enzimi ile daha uzun süre inkübasyon yapılabilir20. Plazma örneklerinde yapılan nitrit ölçümünün nitritin hemoglobin ile hızla etkileşerek hatalı sonuçlar verebileceği ileri sürülmüştür4 . Hemsiz plazmada nitritin nitrata dönüşme oranı 5/1 olarak bildirilmiştir. Heparinin de Griess reajanı ilave edildikten sonra çökmesi nedeni ile, Griess reajanı ilave edilmeden önce örneklere az miktarda protamin sülfat ilave edilerek heparinin ortamdan uzaklaştırılması önerilmektedir19. Kana ilave edilen nitirit miktarının %16'sı kadarı oda sıcaklığında 30 dakika kadar aynı kaldığı, ancak 60 dakikada miktarın %5'ten daha az olduğu bildirilmiştir; 4° C'de ise miktarlar sırası ile %69 ve %55 kadardır. Kandan hemoliz yapılmadan ayrılan plazmada nitrit ve nitratın -20° C'de 1 yıl kadar dayanıklıdır 5 .

Griess yöntemi ile nitrit miktarlarının ölçülmesi20

Materyal

Griess çözeltisi A: 0.1 g NED/100 ml distile su. 0-4° C'de ışıktan korunarak saklanır

Griess çözeltisi B: 1 g sülfanilamit/100 ml ortofosforik asit (5%, h/h). 0-4° C'de ışıktan korunarak saklanır.

Griess reajanı: 1 kısım Griess A çözeltisi + 1 kısım Griess B çözeltisi. Ölçümden hemen önce hazırlanır.

10 mM nitrat standardı: Sodyum nitrat çözeltisi (85 mg sodyum nitrat/100 ml distile su). 0-4° C'de ışıktan korunarak saklanır. 0-100 µM standart çözeltileri hazırlanır.

10 mM nitrit standardı: Sodyum nitrit çözeltisi (69 mg sodyum nitrit/100 ml distile su). 0-4° C'de ışıktan korunarak saklanır. 0-100 µM standart çözeltileri hazırlanır.

Yöntem

1. 100 µl örnek veya nitrit standart çözeltisi 96 çukurlu bir kültür plağında planlanan çukurlara konulur. Örnek hacmi 100 µl'den daha azsa, örnek distile su veya ortam çözeltisi ile toplam hacim 100 µl olacak şekilde dilüe edilir. 2. Çukurların üzerine 100 µl Griess reajanı ilave edilir, renk oluşumu için oda sıcaklığında 15 dakika beklenir. 3. Örnekler ve standartlar için absorbans değerleri 540 nm'de ölçülür. 530-570 nm filtreler de kullanılabilir. 4. Örneklerdeki nitrit konsantrasyonu, standart nitrit kalibrasyon eğrisinden yararlanılarak hesaplanır. Sadece nitrit ölçüldüğünde, standart eğri 250 µM'a kadar doğrusaldır.

Nitratı nitrite indirgeme yöntemleri

1. Enzimatik olmayan

İndirgeme için kullanılan yöntemlerden biri, örneğin bakır ile kaplı kadmiyum kolonlardan geçirilmesi veya belli büyüklükteki kadmiyum tozları ile muamele edilmesidir6 . Ancak Larjinin analoglarının kullanıldığı çalışmalarda Griess reaksiyonu ile nitrit/nitrat düzeyleri ölçüldüğünde, bu maddelerin kadmiyum/bakır ile etkileşip Griess reaksiyonu sonucunda nitrit ile elde edilene benzer bir absorbans verdiği gösterilmiştir15. Bundan dolayı, bu indirgeme yönteminin kullanılmaması önerilmektedir.

2. Enzimatik

NADPH'ye bağımlı nitrat redüktaz20

Nitrat ve nitritin NADPH-nitrat redüktaz (EC 1.6.6.2.) kullanılarak eş zamanlı ölçümü ilk kez Wu ve Brosnan (1992) tarafından tanımlanmıştır. Bu yöntemin esasını nitratın NADPH kullanarak nitrite indirgenmesi ve oluşan toplam nitritin Griess yöntemi ile ölçülmesi oluşturur. Bu yöntemin yüksek miktarlardaki NADP+ 'nin Griess reaksiyonu sırasında renk oluşumu ile etkileşimini önlemek için Verdon ve ark.30 tarafından modifiye edilen şeklinde ise, bir glukoz-6-fosfat (G-6-F)/G-6-F 4 dehidrojenaz NADPH oluşturucu sistem kullanılmaktadır 20.

Nitrat redüktaz
NO3 - + NADPH + H+ → NO2 - + NADP+ + H2O

G-6-F dehidrojenaz
G-6-F + NADP+ + H2O → 6-FG + NADPH + H+

Materyal20

14 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.4: 101 mg Na2HPO4.2H2O + 20.8 mg NaH2PO4. 2H2O/50 ml distile su. 0-4° C'de saklanır.

10 µM NADPH: 1.7 mg NADPH/2 ml distile su. Kullanılırken 100 kat dilüe edilir. Çalışma günü yeni çözelti hazırlanır.

Dönüşüm tamponu: 3.8 mg G-6-F/fosfat tamponu (14 mM) + 2 Ü G-6-F dehidrojenaz (son konsantrasyon 400 Ü/l) + 1 Ü NADPH'ye bağımlı nitrat redüktaz (Aspergillus türlerinden) (son konsantrasyon 200 Ü/l). Çalışma günü kullanılmadan hemen önce hazırlanır.

10 mM nitrat standardı: Sodyum nitrat çözeltisi (85 mg sodyum nitrat/100 ml distile su). 0-4° C'de ışıktan korunarak saklanır. 0-100 µM standart çözeltileri hazırlanır

10 mM nitrit standardı: Sodyum nitrit çözeltisi (69 mg sodyum nitrit/100 ml distile su). 0-4° C'de ışıktan korunarak saklanır. 0-100 µM standart çözeltileri hazırlanır.

NADPH'ye bağımlı nitrat redüktaz yöntemi ile biyolojik örneklerde toplam nitrit ve nitrat miktarının ölçümü için çeşitli firmalar tarafından geliştirilen ELISA kitleri bulunmaktadır (Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit, Cayman Chemical, Katalog no: 780001; Nitric Oxide Assay Kit, Colorimetric, Calbiochem, Katalog no: 482650). Diğer yandan, NOS aktivitesinin nitrit/nitrat üzerinden ölçüldüğü in vitro koşullarda ortamda bulunan fazla miktardaki NADPH'nin Griess reaksiyonu ile etkileşme sorununu gidermek için, laktat dehidrojenazı kullanan ELISA kitleri de geliştirilmiştir (Nitrate/nitrate Colorimetric Assay Kit [LDH Method], Cayman Chemical, Katalog no: 760871; Nitric Oxide Synthase Assay Kit, Colorimetric, Calbiochem, Katalog no: 482702). ELISA kitleri ile hızlı ve güvenilir sonuçlar elde edilebilmektedir.

Format-nitrat redüktaz20

Nitratın format-nitrat redüktaz kullanarak nitrite dönüşümü Taniguchi ve ark.17 tanımladıkları yönteme dayanmaktadır. Destekleyici elektron taşıyıcısı olarak flavin mononükleotit (FMN) ilave edilir. Oluşan kompleks formatdehidrojenaz aktivitesi (ferrositokrom:nitrat oksidoredüktaz, EC 1.9.6.1) ile FMNH2'ye indirgenir. FMNH2 daha sonra nitrat-redüktaz aktivitesi (frrositokrom:nitrat oksidoredüktaz, EC 1.9.6.1) ile nitratı nitrite indirgemek için kullanılır. Bu reaksiyonlar sonucunda oluşan nitrit miktarları ise Griess yöntemi ile ölçülür. NADPH ve NADP+ 'nin tersine, FMN Griess reaksiyonu ile etkileşmez17.

Format dehidrojenaz
FMN + HCOO- + H2O → FMNH2 + CO2 + OH-

Nitrat redüktaz
FMNH2 + NO3 - → NO2 - + FMN + H2O

Materyal20

0.5 M fosfat tamponu, 0.8 M sodyum format, 0.4 mM FMN tamponu, pH 6.0: 0.61 g N2HPO4.2H2O + 3.36 g NaH2PO4.2H2O + 2.72 g sodyum format + 10 mg FMNNa.2H2O/50 ml distile su. 0-4° C'de ışıktan korunarak saklanır.

Format-nitrat redüktaz (yaklaşık 2-4 kÜ/l): 2 mg protein/ml distile su, 4° C (kullanılmadan hemen önce hazırlanmalı)

10 mM nitrat standardı: Sodyum nitrat çözeltisi (85 mg sodyum nitrat/100 ml distile su). 0-4° C'de ışıktan korunarak saklanır. 0-100 µM standart çözeltileri hazırlanır.

10 mM nitrit standardı: Sodyum nitrit çözeltisi (69 mg sodyum nitrit/100 ml distile su. 0-4° C'de ışıktan korunarak saklanır. 0-100 µM standart çözeltileri hazırlanır.

E. coli'nin nitrat-redüktaz pozitif, nitritredüktaz eksik suşu (suş JCB387 pcnB ∆nrf): Yamagutchi [IFO 12433], B suşu veya diğer E. coli suşları gibi diğer suşlar da anlamlı miktarlarda format-nitrat redüktaz içerirler; ancak, bu suşlar kullanıldığında kanamisin çözeltisi ilave edilmemelidir.

Lennox L Broth ortamı: 10 g LB Broth bazı + 5 g KNO3 + 5 g sodyum format + 0.5 g K2HPO4 + 367 µl gliserol distile su ile 450 5 ml'ye tamamlanır, pH KOH ile 7.2'ye ayarlanır ve son hacim 500 ml'ye tamamlanır. Çözelti 15 psi'de 20 dakika 121° C'de otoklavlanır.

Kanamisin çözeltisi: 50 mg kanamisin/1 ml NaCl (%0.9, a/h)

Format-nitrat redüktazın hazırlanması 20

1. E. coli (JCB387 pcnB ∆nrf suşu) anaerobik olarak 10 g LB ve 5 µl kanamisin stok çözeltisi içeren 5 ml ortamda 8 saat inkübe edilir.
2. Aseptik koşullarda alınan 0.5 ml kültür 500 ml LB ortamına aktarılır ve bir gece inkübe edilir.
3. Kültür ortamı 2000g'de 4° C'de 20 dakika santrifüj edilerek hücreler ayrılır.
4. Hücreler 500 ml distile su içinde yeniden süpansiyon haline getirilir ve ortamdan gelen nitrit veya nitratı uzaklaştırmak için 2000g'de 4° C'de 20 dakika santrifüj edilerek hücreler yıkanır.
5. Yıkama işlemi 2 kez daha tekrarlanır.
6. Format-nitrit redüktaz aktivitesini önlemek için hücre pelleti -20° C'de 2-16 saat dondurulur.
7. Hücre pelleti (yaklaşık 2 g) 10 ml soğuk distile suda yeniden süspande edilir; süspansiyon soğutularak 5 dakika süre ile sonike edilir ve böylece hücreler parçalanır.
8. Zedelenmemiş hücreleri toplamak için sonikat 2000g'de 4° C'de 20 dakika santrifüj edilir.
9. Süpernatan alınır ve membrana bağlı format-nitrat redüktaz içeren membran fraksiyonunu ayırmak için 20000g'de 40 dakika santrifüj edilir. Pellet distile su ile yeniden süspande edilerek ve 20000g'de 4° C'de 40 dakika santrifüj edilerek iki kez yıkanır.
10. 8. aşamada elde edilen hücre pelleti verimi artırmak için distile su ile yeniden 7-9. aşamalardaki gibi süspande, sonike ve santrifüj edilir.
11. En son elde edilen membran fraksiyonu 1 ml distile suda yeniden süspande edilir ve 1 l distile suya karşı 4° C'de bir gece diyalizi yapılır.
12. Diyalizattaki protein içeriği 10 mg/ml'ye ayarlanır. Bu diyalizat doğrudan nitrat-redüktaz yöntemi için kullanılabilir. Diyalizatın küçük hacimlerde liyofilize edilmesi ve -70° C'de saklanması önerilir.

NADPH'ye bağımlı nitrat redüktaz yöntemi kullanılarak toplam nitrit ve nitrat miktarlarının belirlenmesi20

1. 50 µl örnek, nitrit veya nitrat standart çözeltisi 96 çukurlu bir kültür plağında planlanan çukurlara konulur.
2. Çukurların üzerine 40 µl dönüşüm tamponu ilave edilir. Nitritin tek başına ölçümü için, NADPH'ye bağımlı nitrat redüktaz içermeyen dönüşüm tamponu kullanılır.
3. Çukurların üzerine 10 µl NADPH çözeltisi ilave edilir.
4. Plak çalkalanır ve nitratın nitrite dönüşümü için oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir.
5. Toplam nitrit miktarı Griess yöntemi ile ölçülür.
6. Nitrit ve nitrat standart eğrilerinin absorbans değerleri karşılaştırılır. Tipik olarak, 0-100 µM nitrat standart çözeltileri kullanıldığında, nitratın nitrite dönüşümü %95'ten daha fazladır.
7. Standart nitrit eğrilerinden örneklerdeki toplam nitrit konsantrasyonu hesaplanır. Hesaplanan değer ortamda bulunan nitrit ve nitratın nitrite indirgenmesi sonucunda oluşan nitrit konsantrasyonlarını ifade eder.
8. Toplam nitrit miktarından, ortamda enzim olmadan ölçülen nitrit miktarının çıkarılması ile nitrat miktarı belirlenir.

Format-nitrat redüktaz yöntemi kullanılarak toplam nitrit ve nitrat miktarlarının belirlenmesi20
1. 1 kısım fosfat dönüşüm tamponu, 1.8 kısım distile su ile kullanılmadan hemen önce dilüe edilir. Duyarlılık sorunu varsa, dönüşüm çözeltisinin başlangıçtaki dilüsyonu kullanılmaz ve örnek hacmi 75 µl'ye çıkarılır, bu durumda 15 µl dilüe edilmemiş dönüşüm tamponu kullanılır.
2. 50 µl örnek, nitrit veya nitrat standart çözeltisi 96 çukurlu bir kültür plağında planlanan çukurlara konulur.
3. Çukurların üzerine 40 µl dönüşüm tamponu ve 10 µl dilüe format-nitrat redüktaz ilave edilir. Karşılaştırma yapabilmek için, enzim yerine 10 µl distile su kullanılır. Çok sayıda örnek olduğunda, enzim dönüşüm tamponuna kullanılmadan hemen önce ilave edilebilir; bu durumda karışımdan 50 µl çukurlara ilave edilir.
4. Nitratın nitrite dönüşümü için plak 37° C'de 60 dakika inkübe edilir.
5. Toplam nitrit miktarı Griess yöntemi ile ölçülür.
6. Nitrit ve nitrat standart eğrilerinin absorbans değerleri karşılaştırılır. Tipik olarak, 0-100 µM nitrat standart çözeltileri kullanıldığında, nitratın nitrite dönüşümü %95'ten daha fazladır.
7. Standart nitrit eğrilerinden örneklerdeki toplam nitrit konsantrasyonu hesaplanır. Hesaplanan değer ortamda bulunan nitrit ve nitratın nitrite indirgenmesi sonucunda oluşan nitrit konsantrasyonlarını ifade eder.
8. Toplam nitrit miktarından, ortamda enzim olmadan ölçülen nitrit miktarının çıkarılması ile nitrat miktarı belirlenir.

Laboratuvarımızda yapılan çalışmalar

Laboratuvarımızda in vitro veya in vivo olarak yaptığımız çalışmalarımızda, gerek fare ve sıçanlardan izole edilen aorta, mezenterik arter, kalp, böbrek, beyin akciğer homojenatları gerekse serum örneklerinde nitrit konsantrasyonları Griess yöntemi ile ölçülmektedir. Kullandığımız yöntemler aşağıda kısaca verilmiştir.

Doku homojenatlarının hazırlanması

Doku homojenatlarının hazırlanmasında kullandığımız fosfat tamponu çözeltisinin bileşimi şu şekildedir (g/L): NaCl 8.0; KCl 0.2; Na2HPO4 1.4; KH2PO4 0.2. Dondurulan dokular çözündükten sonra üzerine 0.5 veya 1 ml fosfat tamponu ilave edilerek homojenize edilmektedir. Homojenatlar Eppendorf tüplere aktarılarak 12.100 x g’de 20 dakika santrifüj edilmektedir. Elde edilen süpernatantlar Eppendorf tüplere alınarak, ölçüm yapılıncaya kadar -20° C’de saklanmaktadır 23-25.

Bazı çalışmalarımızda doku homojenatlarının hazırlanmasında kullandığımız HEPES tampon çözeltisinin bileşimi ise şu şekildedir (mM): HEPES 20 (pH 7.5); β-gliserofosfat 20; sodium pirofosfat 20; sodium ortovanadat 0.2; EDTA 2; sodyum florit 20; benzamidin 10; ditiyotreyitol 1; 20 mM löpeptin; 10 mM aprotinin. Dondurulan dokular çözündükten sonra üzerine 1 ml HEPES tamponu ilave edilerek homojenize edilmektedir. Homojenatlar Eppendorf tüplere aktarılarak 18.000 rpm’de 4° C'de 10 dakika santrifüj edilmektedir. Elde edilen süpernatantlar Eppendorf tüplere alınarak, üzerlerine 50 µl soğuk Tris (50 mM, pH 8.0) ve KCl (0.5 M) ilave edilerek 15 saniye sonike edilir; ardından 18.000 rpm'de 4° C'de 15 dakika santrifüj edilmektedir. Elde edilen süpernatantlar Eppendorf tüplere alınarak ölçüm yapılıncaya kadar -20° C’de saklanmaktadır 27-29.

Nitrit ölçümü

Nitrit ölçümü için sodyum nitrit, orto-fosforik asit, NED ve sülfanilamit kullanılmaktadır. Sodyum nitrit, distile su içinde çözülmektedir. Fosforik asidin %85’lik çözeltisinden distile su ile %2.5’lik çözeltisi hazırlanmakta ve +4° C’de saklanmaktadır. Sülfanilamit (%1) ve NED (%0.1), %2.5’lik fosforik asit içinde çözülerek hazırlanmaktadır. Çözeltiler ölçümden hemen önce ayrı ayrı hazırlanmakta, ölçüm sırasında NED ile sülfanilamit çözeltileri karıştırılıp (Griess reajanı) hemen kullanılmaktadır.

Serum veya doku homojenatları distile su ile 1:5 veya 1:10 oranında distile su ile dilüe edilmektedir.

Standart olarak kullanılacak sodyum nitritin 2 mM şeklinde distile suda hazırlanan stok çözeltisinden, distile su ile 1 ml hacimde seri dilüsyonları (0.25-100 µM) hazırlanmaktadır. Bu çözeltilerden, serum örneklerinden ya da doku homojenatlardan alınan 50 µl örnek 50 µl Griess reajanı ile kültür plağında karıştırılmaktadır. Oda sıcaklığında 10 dakika bekleyen örneklerin verdikleri absorbanslar, kültür plağı okuyucuda 540 nm’de okunmaktadır. Sodyum nitrit konsantrasyonlarına karşı elde edilen absorbanslardan yararlanılarak, doğrusal regresyon yöntemi ile, sodyum nitritin kalibrasyon doğru denklemleri belirlenmektedir. Bu denklemlerden yararlanılarak, örneklerde okunan absorbans değerlerinden nitrit miktarları bulunmaktadır 23-29.

Serum nitrit miktarlarından hesaplanan sistemik nitrit oluşumu µM olarak ifade edilmektedir. Doku nitrit oluşumu ise, her bir örnekten elde edilen doku için ölçülen nitrit konsantrasyonlarının, aynı madde uygulanan dokulara ait protein değerine oranlanarak hesaplanmaktadır. Sonuçlar µmol/mg protein olarak ifade edilmektedir.

Kaynaklar

1. Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem. J. 357, 593-615, 2001. 7 2. Archer S. Measurement of nitric oxide in biological models. FASEB J. 7, 349-360, 1993. 3. Davidson W, Woof C. Comparison of different forms of cadmium as reducing agents for the batch determination of nitrate. Analyst 1003, 403-406, 1978. 4. Dejam A, Hunter C, Schechter AN, Gladwin MT. Emerging role of nitrie in human biology. Blood Cells, Molecules, and Diseases 32, 423-429, 2004. 5. Ellis G, Adatia I, Yazdanpanah M, Makela SK. Nitrite and nitrate analyses: A clinical Biochemistry perspective. Clin. Biochem. 31, 195-220, 1998. 6. Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnok JS, Tannenbaum SR. Analysis of nitrate, nitrite, and [ 15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem., 126, 131-138, 1982. 7. Greenberg SS, Xie J, Spitzer JJ ve ark. Nitro containing L-arginine analogs interfere with assays for nitrate and nitrite. Life Sci. 57, 1949-1961, 1995. 8. Gross SS, Wolin MS. Nitric oxide: Pathophysiological mechanisms. Ann. Rev. Physiol. 57, 737-769, 1995. 9. Hibbs JB, JR, Westenfelder C, Taintor R, Vavrin Z, Kablitz C, Baranowski RL, Ward JH, Menlove RL, McMurry MP, Kuschner JP, Samlowski WE. Evidence for cytokine-inducible nitric oxide synthesis from L-arginine in patients receiving interleukin-2 therapy. J. Clin. Invest. 89, 867-877, 1992. 10. Karayannis MI, Piperaki EA, Maniadaki MM. Kinetic determination of nitrite based on the Griess reaction and stopped flow technique, Anal. Lett., 19(1&2), 13-23, 1968. 11. Kroncke K-D, Suschek CV, Kolb-Bachofen V. Implications of inducible nitric oxide synthase expression and enzyme activity. Antioxid. Red. Sign. 2, 585, 2000. 12. Lefer AM, Scalia R. Nitric oxide in inflammation. In: Physiology of Inflammation, Ley K (ed.), Oxford University Press, New York, p. 447-472, 2001. 13. Miranda KM, Espey MG, Jourd’heuil D, Grisham MB, Fukuto JM, Feelisch M, Wink DA. Te chemical Biology of nitric oxide. In: Nitric Oxide: Biology and Pathobiology, Ignarro LJ (ed.), Academic Press, California, p. 41-55, 2000. 14. Nagano T. Practical ethods for detection of nitric oxide. Luminescence 14, 283-290, 1999. 15. Nithipatikom K, Pratt PF, Campbell WB. Nitro-Larginine interferes with the cadmium reduction of nitrate/Griess reaction method of measuring nitric oxide production. Eur. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 133-137, 1996. 16. Sawicki E, Stanley TW, Pfaff J, D'Amico A. Comparison of fifty-two spectrophotometric methods for the determination of nitrite. Tantala 10, 641-655, 1963. 17. Taniguchi S, Takahashi K, Noji S. Nitrate. In: Methods of Enymatic Analysis, Bergmeyer J, Graβ1 M (eds.), Vol. 7, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weiheim, Germany, p. 578-585, 1985. 18. Tarpey MM, Fridovich I. Methods of detection of vascular reactive species. Nitric oxide, superoxide, hydrogen peroxide, and peroxynitrite. Circ. Res. 89, 224-236, 2001. 19. Tarpey MM, Wink DA, Grisham MB. Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: In vitro and in vivo considerations. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 286, R431- R444, 2004. 20. Titheradge MA. The enzymatic measurement of nitrate and nitrite. In: Methods in Molecular Biology: Nitric Oxide Protocols, Titheradge MA (ed.), Vol. 100, Humana Press Inc., p. 83-91, 1998. 21. Tracey WR, Tse J, Carter G. Lippolysaccharideinduced changes in plasma nitrite and nitrate concentrations in rats and mice: pharmacological evaluation of nitric oxide syntheses inhibitors. J. Exp. Ther. 272, 1011-1015, 1995. 22. Tunçtan B, Altuğ S. The use of nitric oxide synthase inhibitors in inflammatory diseases: a novel class of anti-inflammatory agents. Cur. Med. Chem.: AntiInflam. & Anti-Allergy Agents 3, 271-301, 2004. 23. Tunçtan B, Altuğ S, Uludağ O, Demirkay B, Abacıoğlu N. Effects of cyclooxygenase inhibitors on nitric oxide production and survival in a mice model of sepsis. Pharmacol. Res. 48, 37-48, 2003. 24. Tunçtan B, Korkmaz B, Ozveren E, Buharalıoğlu CK. Mitogen-activated protein kinase signalling cascade contributes to endotoxin-induced hyporeactivity via nitric oxide and prostaglandin production in rat thoracic aorta. Experimental Biology 2005, San Diego, CA, March 31 - April 5, Abstract No: 4326, 2005. The FASEB Journal 19(5), A1551, Abstract No: 877.5, 2005. 25. Tunçtan B, Ozveren E, Korkmaz B, Buharalıoğlu CK. Calcium/calmodulin dependent protein kinase II contributes to endotoxin-induced hyporeactivity via prostaglandin production in rat mesenteric artery. Experimental Biology 2005, San Diego, CA, March 31 - April 5, Abstract No: 4214, 2005. The FASEB Journal 19(5), A1551, Abstract No: 877.6, 2005. 26. Tunçtan B, Uludağ O, Altuğ S, Abacıoğlu N. Effects of nitric oxide synthase inhibition in lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Pharmacol. Res. 38, 405-411, 1998. 27. Tunçtan B, Yaghini FA, Estes A, Malik KU. Inhibition by nitric oxide of cytochrome P450 4A activity contributes to endotoxin-induced hypotension in rats. Experimental Biology 2004, Washington DC, April 17-21, 2004. The FASEB Journal 18(5), A1037-A1038, Abstract No: 680.20, 2004. 28. Tunçtan B, Yaghini FA, Estes A, Malik KU. Inhibition by nitric oxide of cytochrome P450 4A expression and activity contributes to endotoxin-induced hypotension in rats. 17th National Congress of Pharmacology, 1st Clinical Pharmacology Symposium & Joint Meeting of the Turkish & Dutch Pharmacological Societies, Antalya, Turkey, October 17-21, Abstract Book, P69, 2003. 29. Tunçtan B, Yaghini FA, Estes A, Malik KU. Prostaglandins inhibit cytochrome P450 4A activity and contribute to endotoxin-induced hypotension in rats via nitric oxide production. Experimental Biology 2004, Washington DC, April 17-21, 2004. The FASEB Journal 18(5), A1034-A1035, Abstract No: 680.5, 2004. 30. Verdon CP, Burton BA, Prior RL. Sample pretreatment with nitrate reductase and glucose-6- phosphate dehydrogenase quantitatively reduces nitrate while avoiding interference by NADP+ when the Griess reaction is used to assay nitrite. Anal. Biochem. 224, 502-508, 1995. 31. Wong HR, Carcillo JA, Burckart G, Kaplan SS. Nitric oxide production in critically ill patients, Arc Dis Child, 74: 182-189, 1996. 32. Wu GY, Brosnan JT. Macrophages can convert citrulline into arginine. Biochem. J. 281, 45-48, 1992.

[mert]

Kılcal Damar ve Kan Dolaşımı Zafiyeti Pine Bark'ın Faydaları Doğal Kan Sulandırıcı

Çam Kabuğu Ekstraktı Faydaları Nelerdir, Pine Bark Hangi Rahatsızlıklar İçin Kullanılır

PİNE BARK ile LONG COVİD; Dermansızlık, yorgunluk, nefes darlığı ve Venöz Yetmezliğine çözüm

Çam Kabuğu Ekstraktı Faydaları Nelerdir, Pine Bark Hangi Rahatsızlıklar İçin Kullanılır?

Pine Bark Nedir? Pine Bark Faydaları Nelerdir?

[ahmetkirmizi]

Kalp Damar Rahatsızlıkları için Doğal Çözüm Alıç. PİNE BARK En Doğal Kan Sulandırıcı