LADEN Forte, Atopik Egzama, Alerjik Egzama, Gastrit, Ülser, Reflü

[mert]

Alerjik Egzama Nasıl Tedavi Edilir

[mert]

AİDS Hastalığı Nasıl Tedavi Edilir

[nguven]

Cistus incanus özütünün HIV ve Filovirüslere karşı güçlü in vitro antiviral aktivitesi viral zarf proteinlerini hedefler

Stephanie Rebensburg , ^{1, *} Markus Helfer , ^{1, *} Martha Schneider , ¹ Herwig Koppensteiner , ¹ Josef Eberle , ³ Michael Schindler , ^{1, 2} Lutz Gürtler , ³ ve Ruth Brack-Werner ^{a, 1, 4}
Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk reddi
Bu makale PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır . İlişkili Veriler

Tamamlayıcı Malzemeler
Şuraya gidin: Öz


Virüs enfeksiyonlarının küresel tedavisini iyileştirmek için yeni tedavi seçeneklerine acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Onaylanmış klinik güvenlik özelliklerine sahip bitkisel ürünler, yeni antiviral aktivitelerin tanımlanması için çekici bir başlangıç materyalidir. Burada Cistus incanus (Ci) bitkisel ürünlerinin in vitro olarak insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonlarını engellediğini gösteriyoruz.. Ci özütü, klinik HIV-1 ve HIV-2 izolatlarını ve daha da önemlisi, çok sayıda ilaç direncine sahip bir virüs izolatını inhibe ederek geniş anti-HIV aktivitesini teyit etti. Antiviral aktivite, virüs partikülleri için oldukça seçiciydi, virüsün hücre yüzeyine birincil bağlanmasını ve viral zarf proteinlerinin heparine bağlanmasını önledi. Biyoanaliz kılavuzluğunda fraksiyonlama, Ci ekstraktının çok sayıda antiviral bileşik içerdiğini ve bu nedenle virüs direncini indükleme konusunda olumlu bir şekilde düşük eğilime sahip olduğunu gösterdi. Aslında, Ci özlerinin varlığında virüsün 24 haftalık sürekli çoğalması sırasında hiçbir dirençli virüs ortaya çıkmadı. Son olarak, Ci özleri ayrıca Ebola ve Marburg virüs zarf proteinleri ile psödotiplenmiş virüs partiküllerinin neden olduğu enfeksiyonu da inhibe etti, bu da Ci ekstraktının antiviral aktivitesinin ortaya çıkan viral patojenlere uzandığını gösterir.insanlarda yaşamı tehdit eden hastalıklara neden olan virüslere karşı in vitro antiviral aktivite ve virüs partiküllerini hedefleyen ajanların umut verici kaynaklarıdır.
Virüs enfeksiyonları, küresel ölçekte insan sağlığı için ciddi tehditler oluşturmaktadır. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV), antiretroviral tedavi olmaksızın AIDS'e yol açan kronik, yaşam boyu enfeksiyona neden olur. 35 milyondan fazla kişi HIV / AIDS ile yaşıyor ve pandemi, özellikle düşük gelirli ülkelerde ¹ , on yıldan fazla bir süredir önde gelen 10 küresel ölüm nedeni arasında kaldı . Ebola virüsü (EBOV) gibi yeni ortaya çıkan virüsler, enfeksiyondan 2–21 gün sonra ortaya çıkan semptomlarla ve yüksek ölüm riskiyle (ortalama ölüm oranı ~% 50) akut bir hastalığa neden olabilir (Ebola virüsü hastalığı ile ilgili güncel bilgilerin özeti için bkz. ²). EBOV, Mayıs 2014'te Batı Afrika'da (Gine, Liberya ve Sierra Leone) patlak veren gibi ani salgınlara neden olabilir. Bu salgın, 10.000'den fazla kişinin ölümünün yanı sıra, kaynak yetersizliği, uzun süreli çatışma ve istikrarsızlık nedeniyle zaten zayıflamış olan ülkelere ek ağır bir yük getirdi ve yerel sağlık bakım sistemlerinin çökmesine yol açtı.

Hayatı tehdit eden viral enfeksiyonların tedavisi için yeni antiviral ajanların geliştirilmesine güçlü bir ihtiyaç vardır. HIV / AIDS tedavisi için bir dizi onaylanmış ilaç bulunmasına rağmen (≥25 ³ ), mevcut anti-HIV tedavileri yine de çeşitli iyileştirmelerden yararlanacaktır. Kısıtlamalar arasında dirençli virüslerin ortaya çıkma riskinin yüksek olması, merkezi sinir sistemi gibi virüs koruma alanlarına zayıf penetrasyon, özellikle uzun vadeli terapi bağlamında olumsuz etkiler ve sınırlı kaynak alanlarında uygun fiyatlı tedavilere eksik erişim bulunmaktadır ^{4 , 5 , 6 , 7}. Ayrıca, bu ilaçların çoğu, virüs replikasyon döngüsünün giriş sonrası adımlarını bloke eder ve viral ters transkriptaz, proteaz veya integraz ³ gibi yalnızca birkaç viral hedefe saldırır .

HIV / AIDS'in aksine, EBOV enfeksiyonlarıyla mücadele etmek için şu anda onaylanmış bir ilaç bulunmamaktadır. Hedeflenen antiviral tedavilerin eksikliği, EBOV salgınlarını yönetmenin en korkutucu yönlerinden biridir.

Bitki kökenli doğal ürünler tıbbi tedaviler için önemli bir rol oynar ^{8 , 9} . Bitkisel özler, dünya nüfusunun büyük bir kısmı için sağlık hizmetinin birincil biçimini temsil eder ¹⁰ ve önemli bir tek moleküllü ilaç kurşun kaynağıdır. Öne çıkan bir örnek, 2015 Nobel Fizyoloji ve Tıp Ödülü ¹² sahibi YouYou Tu tarafından keşfedilen Artimisia annua ^11'in anti-sıtma aktivitesidir .

Antiviral aktiviteler çok sayıda şifalı bitki ^{9 , 13} için rapor edilmiştir . Bununla birlikte, bitkisel antiviral ilaçlar olarak uygulanmaları, etkinliklerinin, güvenliğinin, bileşimlerinin ve etki mekanizmalarının derinlemesine araştırılmasını gerektirir ¹⁴ . Klinik güvenlik ve biyolojik aktiviteler için veriler, bazıları Avrupa'da reçetesiz satılan ilaçlar olarak satılan birkaç bitki özü için mevcuttur. Yeni antiviral ajan kaynaklarının tanımlanması için ilk adım olarak, klinik olarak değerlendirilen bu bitkisel ilaçların HIV-1 gibi başlıca insan viral patojenlerine karşı antiviral aktivitelerini araştırmaya çalışıyoruz. Bu yaklaşım, Pelargonium sidoides ^15'in ekstraktlarının anti-HIV-1 aktivitesi ile ilgili son gösterimiz tarafından desteklenmektedir., Umckaloabo® bitkisel ilaç olarak Almanya'da ruhsatlandırılmıştır.

Bu çalışmada, Cistus incanus'un (Pink Rockrose) HIV ve Filovirüslere karşı antiviral aktivitelerini araştırdık. Cistus incanus (Ci), Güney Avrupa ve Kuzey Afrika'nın Akdeniz bölgelerine özgüdür ve Pelargonium sidoides'den (Geraniales) farklı bir taksonomik sıraya (Malvales) aittir . Ci özlerinin, anti-enflamatuar, anti-oksidan, antimikotik ve antibakteriyel aktivitelere sahip olduğu gösterilmiştir ^{16 , 17 , 18 , 19} . Ci polifenol bakımından zengindir ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23}antimikrobiyal / antiviral aktivitelere sahip birçok temsilciyi içeren kimyasal bir bileşik sınıfı ^{24 , 25} . Ayrıca, Ci ekstrelerinin influenza A virüsü ^{21 , 26} tarafından enfeksiyonu inhibe ettiği gösterilmiştir . Farklı Ci hazırlıkları bir CYSTUS052 dahil piyasadan temin edilebilir ^® kaynatma, boğaz pastilleri ve bitki çayı. Üst solunum yolu enfeksiyonu olan hastalarla yapılan klinik çalışmalar, tedavi edilen hastalarda kontrol hastalarına kıyasla azalmış semptomlar ve daha az yan etki ortaya çıkardı, bu da klinik etkililiğe ve CYSTUS052 ^{® 27 , 28'in} olumlu bir güvenlik profiline işaret ediyor .

Ci ekstrelerinin, geleneksel ilaçlara karşı çok sayıda dirençli bir klinik virüs izolatı dahil olmak üzere farklı HIV izolatlarına karşı geniş inhibitör aktivite gösterdiğini gösteriyoruz. Etki modu çalışmaları, Ci'nin viral zarf proteinlerini hedeflediğini ve virüsün ana hücrelere birincil bağlanmasını engellediğini gösterir. Ci özlerinin antiviral aktivitesi ayrıca Ebola virüsü zarf proteinine yönelikti. Ekstrakt dekonvolüsyon çalışmaları, Ci ekstrelerinin HIV ve Ebola virüsüne karşı çok sayıda aktif bileşen içerdiğini ortaya çıkarmıştır. Sonuçlarımız, Ci özütünün HIV ve Ebola virüsüne karşı güçlü antiviral aktiviteye sahip olduğunu gösterir ve Ci özütünün, bu virüslerin replikasyon için konakçı hücrelere girmesini önleyen çok sayıda bileşik içerdiğini gösterir.

Şuraya gidin: Sonuçlar

Cistus incanus ekstrelerinin çok çeşitli HIV izolatlarına karşı antiviral aktivitesi


Cistus incanus'un (Ci) farklı sulu özütleri, oldukça hassas bir HIV haberci hücre çizgisi (LC5-RIC) ve HIV inhibitörlerinin tanımlanması için oluşturulan teknoloji (EASY-HIT ²⁹ ) kullanılarak anti-HIV aktivitesi açısından değerlendirildi . İlk test, ticari bir Ci preparatı (CYSTUS052®), Ci çayından demlenmiş bir özüt ve taze, kendi kendine yetişen Ci bitkilerinden (n = 3) hazırlanan bir özle gerçekleştirildi. Üç Ci özünün tümü, HIV-1 laboratuvarı izolatı HIV-1 _LAI tarafından benzer etkililiklerle LC5-RIC hücrelerinin enfeksiyonunu inhibe etti ( Ek Şekil S1 ). Ci ile muamele edilmiş hücrelerin canlılığı (MTT tahlili ile ölçülmüştür), tüm ekstreler için muamele edilmemiş hücrelerin -% 80'i olmuştur. Anti-HIV aktivitesinin daha fazla analizi için CYSTUS052® kullandık.

Daha sonra geniş bir klinik HIV izolatı yelpazesine karşı Ci ekstresinin antiviral aktivitesini araştırdık. Da gösterildiği gibiŞekil 1, Ci ekstresi hem HIV tip 1 hem de 2 tarafından enfeksiyonu inhibe etti. İki farklı gruptan [Major (HIV-1M _MVP899-87 ) ve _Outlier (HIV-1O _MVP5180-91 )] klinik izolatlar tarafından enfeksiyonun inhibisyonu, LC5-RIC ile gösterilmiştir. raportör hücreler ve birincil insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC). Önemli olarak, Ci özütü ayrıca birden fazla ilaç direnci mutasyonu ile bir HIV-1 M grubu / B sınıfı izolatını (HIV-1 _V13-03413B ) _{inhibe etti} . Bu izolat, virolojik tedavi başarısızlığı olan bir hastadan elde edildi. HIV-1 _{V13-03413B'nin} proteaz ve ters transkriptaz dizilerinin HIV-GRADE aracı ³⁰ ile analizi, HIV-1 _{V13-03413B'nin} yüksek seviyeli direncini _öngördü 4 NNRTI'nin 3'üne (nükleozid olmayan ters transkriptaz inhibitörleri), 8/10 NRTI'ye (nükleozid ters transkriptaz inhibitörleri) ve 14 proteaz inhibitöründen 13'üne karşı ve bu sınıflarda kalan ilaçlara karşı orta düzeyde direnç.

Şekil 1
Cistus incanus özütü, çok çeşitli insan immün yetmezlik virüslerinin (HIV) enfektivitesini inhibe eder.
( A ) Cistus incanus (Ci) özütünün antiviral aktivitesi, HIV tip 1 ve HIV tip 2 izolatlarını inhibe eder . Enfeksiyon inhibisyonu, farklı koreseptör _tropizmli HIV-1 izolatları (HIV-1 _LAI : X4-tropik; HIV- kullanılarak insan HIV raportör hücreleri (HIV-1 _{AD8 (R5)} için LC5-RIC veya LC5-RIC- _R5) ile değerlendirilmiştir . 1 _{AD8 (R5)} : R5-tropik), bir klinik izolat olan M (Major) (HIV-1M _MVP899-87 ) veya O (Aykırı) grubuna (HIV-1O _MVP5180-91 ) ait HIV-1 klinik izolatları HIV tip 2 (HIV-2 _MVP10668-93 ) ve çoklu ilaç direnci olan bir klinik HIV-1 izolatı (HIV-1 _V13-03413B ). ( B )Cistus incanus (Ci) özütü, birincil insan hedef hücrelerinin HIV enfeksiyonunu inhibe eder. İnterlökin-2 ile uyarılan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) , farklı Ci özütü konsantrasyonlarının varlığında HIV-1 _LAI veya HIV-1O _MVP5180-91 virüsüne maruz bırakıldı . PBMC tarafından üretilen enfeksiyöz virüs seviyeleri, PBMC'nin kültür süpernatanlarının LC5-RIC hücreleriyle analiz edilmesiyle belirlendi. Deneyler, 3 donörden alınan PBMC'ler ile gerçekleştirildi. Doz-yanıt eğrileri, her biri 100 μg / ml ile 3.12 μg / ml arasında 6 Ci ekstresi konsantrasyonu ile gerçekleştirilen 3 bağımsız enfeksiyon testi için gösterilmiştir. Semboller ortalama değerleri ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını belirtir. EC ₅₀ , hesaplanan yarı maksimum etkili konsantrasyonu belirtir.

Ci özütünün anti-HIV aktivitesi için polifenollerin önemini açıklığa kavuşturmak için, polifenollerin polivinilpirolidona (PVPP) adsorpsiyonu yoluyla Ci özünden polifenolle zenginleştirilmiş bir fraksiyon (CiPP) ürettik. CiPP, test edilen HIV izolatlarının tüm paneline karşı doza bağlı antiviral aktivite göstermiştir (Şekil 2A). CiPP fraksiyonunun antiviral aktivitesi ~ 0.7 ila 2.0 μg / ml arasında değişiyordu ve tüm Ci ekstraktınınkinden fold5 kat daha güçlüydü (karşılaştırİncir 1A ve ve2A).2A). Bunun tersine, polifenolü tükenmiş fraksiyon , aynı konsantrasyonlarda HIV-1 _LAI ile test edildiğinde hiçbir antiviral aktivite göstermedi , bu da polifenollerin Ci ekstraktının antiviral aktivitesini oluşturduğunu gösterir (Şekil 2B).

şekil 2
Polifenoller, Cistus incanus özütünün anti-HIV aktivitesi için çok önemlidir .
Polifenolle zenginleştirilmiş bir fraksiyon (CiPP ile zenginleştirilmiş fraksiyon), bütün Cistus incanus (Ci) ekstraktının polivinilpirolidona (PVPP) maruz bırakılmasıyla oluşturuldu , ardından PVPP peletinin sulu süpernatanttan santrifüjlenmesi ve adsorbe edilmiş polifenollerin (PP) elüsyonuyla ayrılmasıyla oluşturuldu. PVPP peletinden. (Daha fazla ayrıntı için bkz. Malzemeler ve Yöntemler). ( A ) Polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyon, HIV tip 1 ve HIV tip 2 izolatlarının neden olduğu enfeksiyonu etkili bir şekilde inhibe eder. Polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyonun HIV inhibe edici aktivitesi, LC5-RIC hücreli HIV izolatlarının aynı paneliyle ve tüm Ci ekstraktının test edilmesinde kullanılan aynı koşullar altında test edildi (bkz.Şekil 1). ( B ) Anti-HIV aktivitesi, polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyon tarafından seçici olarak korunur . Polifenolle zenginleştirilmiş ve polifenolü tükenmiş fraksiyonun anti-HIV aktiviteleri, HIV-1 _LAI ve LC5-RIC hücreleri kullanılarak karşılaştırıldı. Polifenolü tükenmiş fraksiyon (= CiPP-tükenmiş fraksiyon), santrifüjlemeden sonra PVPP peletinin sulu süpernatanını temsil eder. Doz-yanıt eğrileri, her biri 25 μg / ml ile 0.78 μg / ml arasında 6 Ci ekstresi konsantrasyonu ile gerçekleştirilen 3 bağımsız enfeksiyon testi için gösterilmiştir. Semboller, ortalama değerleri ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını belirtir. EC ₅₀ , hesaplanan yarı maksimum etkili konsantrasyonu belirtir.

MTT analizi ile hücre canlılığında Ci tedavinin etkisinin test edilmesi CC ortaya ₅₀ bütün ekstraktı (değerlerini ≥250 ug / ml Ek Şek. S2 ). CiPP, ekstraktın tamamından daha düşük sitotoksisite (CC ₅₀  > 1200 μg / ml) gösterdi . Böylece polifenollerin zenginleştirilmesi, ekstraktın sitotoksik bileşenlerini ortadan kaldırır ve antiviral aktiviteyi artırır.

Bu sonuçlar birlikte, çok çeşitli HIV izolatlarına karşı Ci ekstresinin güçlü antiviral aktivitesini gösterir ve polifenollerin anti-HIV aktivitesi için çok önemli olduğunu gösterir. Etki mekanizması: Ci ekstresi, HIV'in konakçı hücreleri istila etmesini önler


EASY-HIT sisteminde Ci özütünün antiviral testi, HIV replikasyon döngüsünün ²⁹ erken aşamasını etkileyen antiviral ajanların özelliği olan testin ilk adımında inhibisyonu ortaya çıkardı . Bu nedenle, eklenme zamanı (TOA) analizleri gerçekleştirdik. TOA deneyi, antiviral bileşiğin eklenmesinin zaman noktasının virüs enfeksiyonunu engelleme kapasitesi ^{29 , 31} üzerindeki etkisini ölçer . Referans bileşikleri olarak, HIV-1 füzyon inhibitörü T20 ve ters transkripsiyon inhibitörü Efavirenz'i kullandık. Elde edilen Ci profili, füzyon inhibitörü T20 için gözlemlenenden bile daha erken zaman noktalarında inhibisyon kaybını gösterir (Şekil 3A), Ci'nin HIV-1 replikasyon döngüsünde çok erken bir adımı inhibe ettiğini gösterir. Bu, Ci ekstresi ve ters transkriptaz inhibitörü Efavirenz (Şekil 3B).

Ayrı bir pencerede aç
Figür 3
Cistus incanus özütü, hücrelerin HIV tarafından istilasını engeller.
( A ) Ci özütünün antiviral aktivitesi, HIV replikasyon döngüsünün çok erken bir aşamasını inhibe eder. Ekleme zamanı (TOA) deneyleri, Cistus incanus (Ci) özütü veya referans inhibitörleri T20 (virüs-hücre füzyonu) ve Efavirenz (ters transkripsiyon) ile gerçekleştirildi. Her bir zaman noktası, üç kopya halinde oyuklarda test edildi ve enfeksiyon seviyeleri, muamele edilmemiş kültürlerinkine (=% 100) normalize edildi. Semboller, ortalama değerleri ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını gösterir. ( B ) Ci özütü, genomik HIV RNA'nın hücre lere verilmesini önler . LC5-CD4 kültürleri HIV-1 _LAI'ye maruz bırakıldıyokluğunda (Ci yokluğunda) veya 100 ug / ml tam Ci özütü (Ci) veya Ci'den türetilmiş bir polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyon (CiPP) varlığında 4 saat süreyle. Efavirenz, hedef hücrelerde HIV ters transkripsiyonunu bloke etmek için dahil edildi. RNA, 4 saatlik virüse maruz kaldıktan sonra kültürlerden izole edildi, cDNA oluşturuldu ve kantitatif PCR analizi için kullanıldı. HIV-1 sekanslarının seviyeleri, RNA polimeraz II referans sekansları ile ilişkiliydi. Veriler, HIV-1'e maruz bırakılan kültürlerde, arka plana normalize edilmiş (yani virüssüz) göreceli HIV-RNA genom seviyeleri olarak ifade edilir. Her çubuk, 3 virüse maruz kalma deneyinin ortalama sonuçlarını temsil eder Hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. ( C , D ) Ci ekstresi virüs partiküllerinin hücrelere bağlanmasını önler. Dönen disk eş odaklı mikroskopi, Ci veya CiPP'nin GFP etiketli HIV-1 virüs partiküllerinin LC5-RIC hücrelerine bağlanması üzerindeki etkisini analiz etmek için kullanıldı. Hücreler, 4 saat süreyle virüse maruz bırakıldı. Füzyon inhibitörü T20, virüsün hedef hücrelere girişini engellemek için dahil edildi. Kontroller, Ci'siz virüse maruz kalan hücrelerden (ek kontrolü) ve maruz kalmayan hücrelerden (arka plan) oluşuyordu. Hücre çekirdekleri DAPI boyama ile görselleştirildi. ( C ) Hücreyle ilişkili GFP noktalarının kantitatif analizi. 4 görüntüden alınan 60 hücre ile ilişkili GFP sinyalleri her numune için analiz edildi. Çubuklar, hücre başına GFP sinyallerinin ortalama değerlerini temsil eder ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. ( D ) Her numune için temsili görüntüler. Ölçek çubukları: 20 μm.

Daha sonra , daha önce ¹⁵ açıklandığı gibi, GFP etiketli HIV-1 partikülleri (HIV-1 NL4-3 Gag-iGFP ³² ) ve dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak, virüs partiküllerinin konak hücrelere bağlanması üzerindeki Ci ekstresinin etkisini değerlendirdik . Virüs bağlanması, virüs-hücre ilişkisini maksimize etmek için T20 varlığında deneye tabi tutuldu. Beklendiği gibi, çok sayıda yeşil flüoresan, hücre ile ilişkili nokta Ci'nin yokluğunda görüldü ve virüs partiküllerinin konakçı hücrelere bağlandığını doğruladıŞekil 3C, DEk kontrolü). Aksine, Ci ekstresi ile muamele, hücre başına GFP sinyallerinin sayısını (Ci ekstresi ve CiPP) büyük ölçüde azaltmıştır, bu da Ci ekstresinin virüs partiküllerinin konakçı hücreler ile birleşmesini engellediğini göstermektedir.

Bu sonuçlar birlikte, Ci özütünün viral partiküllerin hücrelere bağlanmasını bloke ettiğini ve dolayısıyla konakçı hücrelere viral girişi engellediğini gösterir. Ci özütünün antiviral aktivitesi, HIV zarf proteinlerini hedef alır


Antiviral Ci bileşenlerinin virüs partiküllerini mi yoksa konakçı hücreleri mi hedeflediğini doğrulamak için, enfeksiyondan önce hücreleri veya virüs partiküllerini Ci ekstresi ile önceden inkübe ettik. LC5-RIC hücrelerinin Ci ekstresi ile ön inkübasyonunun virüs enfeksiyonu üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır (Şekil 4A). Bunun tersine, virüs partiküllerinin Ci ile ön inkübasyonu, enfeksiyonu güçlü bir şekilde azaltarak, aynı anda Ci ekstresi ve virüsün hücrelere eklenmesiyle elde edilenlerden bile daha düşük enfeksiyon seviyeleri sağladı (yani standart analiz koşulları). Bu sonuçlar, Ci özütünün virüs partiküllerini doğrudan etkilediğini göstermektedir.

Ayrı bir pencerede aç
Şekil 4
Cistus incanus özütünün HIV inhibe edici aktivitesi, viral zarf proteinlerini seçici olarak hedefler.
( A ) Ci özütünün antiviral bileşenleri, virüs partikülleri ile etkileşime girer, ancak hedef hücreler ile etkileşime girmez . Grafik, virüs inokulumunun (HIV-1 _LAI ) veya hedef hücrelerin (LC5-RIC), anti-HIV-1 aktivitesi üzerindeki Ci ekstresi ile ön inkübasyonunun etkilerini göstermektedir . Kontrol olarak antiviral aktivite, virüs aşılaması ve Ci ekstresinin hücrelere aynı anda eklendiği standart koşullar altında test edildi. Semboller, üç kopya halinde analiz edilen her özüt dilüsyonu için ortalama değerleri ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını belirtir. Ci ekstresi ile muamele edilen kültürlerin enfeksiyon değerleri, muamele edilmemiş kültürlere göre ifade edilir (=% 100 enfeksiyon). ( B ) Ci işlemi, virüs partiküllerinin heparine bağlanmasını bloke eder.Virüs yakalama deneyleri, heparin boncukları ve HIV-1 _LAI içeren virüs numuneleri ile gerçekleştirildi , ya (virüs + Ci) ile ya da Ci ekstraktı olmadan (sadece virüs) inkübe edildi. Yakalanan virüs, boncuk fraksiyonunda (sol panel) ve elüatta (sağ panel) Gag-p24 ELISA ile ölçüldü. Ci ile muamele edilmiş virüs numunelerinden yakalanan Gag-p24 antijen seviyeleri, muamele edilmemiş kontrol numunelerinden yakalanan Gag-p24 antijen seviyelerine göre ifade edilir (=% 100). Sonuçlar, farklı miktarlarda virüs ile gerçekleştirilen iki bağımsız yakalama deneyi için gösterilmiştir. Gag-p24 seviyeleri, kontrol numunesi için ölçülen değerlere normalize edildi (yalnızca virüs =% 100). Sütunlar ortalama değerleri ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını belirtir (nd = saptanmadı). ( C )Ci ile muamele edilmiş virüs partikülleri, virüs zarflarında hücre kaynaklı CD44 proteinlerine bağlanan antikorlar tarafından yakalanır . Virüs yakalama tahlilleri, anti-insan CD44 antikorları ile konjuge mikro boncuklar ve Ci özütü ile (virüs + Ci) veya Ci özütü olmadan (sadece virüs) inkübe edilmiş HIV-1 _LAI virüs numuneleri ile gerçekleştirildi. Yakalanan virüs seviyeleri, elüatın Gag-p24 ELISA'sı ile belirlendi (sol grafik). Yakalanan virüsün etkisizliği, LC5-RIC hücreleri (sağ grafik) ile belirlendi. Çubuklar, her numune için 3 tekrarın ortalama sonuçlarını temsil eder ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını temsil eder.

Ci özütünün HIV-1 zarf glikoproteinlerini hedefleyip hedeflemediğini araştırmak için, virüs parçacıklarının Ci özütü ile işlenmesinin HIV-1 parçacıklarının heparin tarafından yakalanmasını etkileyip etkilemediğini analiz ettik. Heparine HIV-1 bağlanmasına, viral zarf proteini gp120 aracılık eder ( ^33'te gözden geçirilmiştir ). Heparin afinite kromatografisi için HIV-1 stokları, heparin boncukları ile inkübe edildi ve yüksek tuz tamponu ile yıkanarak ayrıştırıldı. Virüs yakalama, heparin boncukları ile ilişkili ve elüatta HIV-1 antijeninin (Gag-p24) miktarının belirlenmesi ile belirlendi. Virüs antijeni, Ci ile muamele edilmiş HIV-1 ile gerçekleştirilen virüs yakalama deneylerinin boncuk fraksiyonunda veya eluatında saptanmazken, virüs antijeni, işlenmemiş virüs numuneleri (Şekil 4B). Bu sonuçlar, Ci tedavisinin heparine gpl20 aracılı bağlanmayı engellediğini gösterir.

Daha sonra Ci bileşenlerinin viral zarfta hücre kaynaklı proteinleri de hedefleyip hedeflemediğini araştırdık. CD44 konak proteininin HIV zarflarına dahil edildiği bilinmektedir ( ^34'te gözden geçirilmiştir ) ve anti-CD44 antikorlarına bağlanma, bulaşıcı virüs partiküllerini saflaştırmak için bir yöntem olarak kullanılır. Bu nedenle, CD44-pozitif hücreler (LC5-RIC) tarafından üretilen virüs parçacıkları ve CD44'e karşı antikorlara konjuge edilmiş manyetik mikro boncuklarla virüs yakalama deneyleri gerçekleştirdik. Yakalanan virüs partikülleri, HIV-1 Gag-p24 ELISA ile ölçüldü ve bulaşıcı virüs partiküllerinin seviyeleri, LC5-RIC haberci hücreler ile belirlendi. Da gösterildiği gibiŞekil 4Cvirüs partikülleri, hem Ci ile muamele edilmiş hem de muamele edilmemiş virüs numunelerinden anti-CD44 mikro-boncuklar tarafından yakalandı. Bununla birlikte, Ci ile muamele edilmiş numunelerden yakalanan virüs, muamele edilmemiş numunelerden yakalanan virüse kıyasla, büyük ölçüde azalmış enfektivite gösterdi.

Bu sonuçlar, Ci bileşenlerinin, virüs zarfını hedefleyerek ve viral gpl20 zarf proteininin bağlanma aktivitesini inhibe ederek virüs enfektivitesini bloke ettiğini, ancak virüs partikülündeki konakçı hücreden türetilmiş CD44 proteini ile etkileşmediğini gösterir. Ci özütü, anti-HIV aktivitesine sahip birden fazla bileşen içerir


Ci ekstresinde anti-HIV aktivitesi sergileyen bileşiklerin karmaşıklığını ölçmek için Ci ekstresi, biyoanaliz kılavuzluğunda fraksiyonlamaya tabi tutuldu. Ci özütü, kompleks bitki özlerinin ³⁵ ters evrişimi için valide edilmiş çok aşamalı bir prosedürle ayrıldı . İlk olarak, Ci özünden 96 fraksiyon seti hazırlandı. Bu fraksiyonlar, tüm fraksiyonların (5 ug / ml) tek doz testiyle, ardından 45 en aktif fraksiyonun anti-HIV aktivitesinin doza bağımlılığının analizi ile anti-HIV aktivitesi açısından değerlendirildi. Birkaç potansiyel aktivite kümesi belirlendi, bunlardan biri örnek olarak ince fraksiyonlara (fraksiyonlara) tabi tutuldu (Şekil 5A). Anti-HIV aktivitesi pek çok ince parçacıklar EC elde ile bu kümesinden türetilmiş ince parçaların büyük bir çoğunluğu için gösterilmiştir ₅₀ değerleri, aşağıdaki 5 ug / ml (Şekil 5B). Daha fazla saflaştırma için, yüksek antiviral aktiviteye ve yapı aydınlatması için uygun özelliklere dayalı olarak ince fraksiyon F seçilerek, yüksek çözünürlüklü fraksiyonlar Fİ-F9 elde edildi. Bu yüksek çözünürlüklü fraksiyonların antiviral aktivitelerinin test edilmesi (Şekil 5C) yüksek anti-HIV aktivitesi (EC ₅₀  <1,1 μg / ml) olan iki aday (F-3, F-4) ortaya çıkardı . Son olarak, yüksek çözünürlüklü fraksiyon F-4'ün HPLC analizi, tek bir zirve (% 99 saflık) verdi.

Şekil 5
Cistus incanus (Ci) ekstraktının yinelemeli fraksiyonasyonu sırasında anti-HIV aktivitesinin profili, birden fazla aktif bileşiği ortaya çıkarır.
( A ) Ci özütünün ilk ayrılması sırasında elde edilen 45 yüksek aktivite fraksiyonunun anti-HIV aktivite profili . Yüksek aktivite fraksiyonları A4-D12, ilk ayırma adımında oluşturulan 96 fraksiyon setinin tek doz anti-HIV taraması ile tanımlandı. Tarama, LC5-RIC hücreleri ve HIV-1 _{LAI ile yapıldı} . Her yüksek aktiviteye sahip fraksiyonun anti-HIV aktivitesinin kantifikasyonu için, hücreler, 100 μg / ml ila 3.125 μg / ml (2 kat seri seyreltme) ve EC arasında değişen fraksiyonun farklı konsantrasyonlarının varlığında virüse maruz bırakıldı. ₅₀ değer belirlendi. Semboller ortalama EC _50'yi belirtirher fraksiyon için üçlü tahlillerin değerleri ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. Çerçeve, A8-A12 fraksiyonlarından oluşan örnek bir aktivite kümesini gösterir. ( B ) A'da tanımlanan örnek aktivite kümesinden türetilen ince fraksiyonların anti-HIV aktiviteleri (fraksiyonlar A8-A12). Aktivite kümesi, daha sonra anti-HIV aktivitesi için tahlil edilen ince AM fraksiyonları veren ikinci bir fraksiyonlama adımına tabi tutuldu. Çubuklar, her fraksiyon için 3 bağımsız tahlilin ortalama değerlerini ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. #: Ölçülen konsantrasyonlarda antiviral aktivite tespit edilmedi. ( C ) F ince fraksiyonundan türetilen yüksek çözünürlüklü fraksiyonların anti HIV aktiviteleri.İnce fraksiyon F, üçüncü bir fraksiyonasyon adımına tabi tutularak, yüksek çözünürlüklü fraksiyonlar F1 ila F9, yine anti-HIV aktivitesi için deneye tabi tutuldu. Çubuklar, her fraksiyon için 3 bağımsız tahlilin ortalama değerlerini ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. #: En yüksek konsantrasyonda antiviral aktivite tespit edilmedi.

Bu sonuçlar, Ci özütünün kimyasal özüt ters evrişim ile ayrılabilen çok sayıda anti-HIV bileşiği içerdiğini gösterir. Uzun süreli pasaj sırasında Ci'ye dirençli HIV ortaya çıkmaz


Uzun süreli Ci tedavisi sırasında dirençli virüslerin potansiyel ortaya çıkışını araştırmak için, Ci varlığında LC5-RIC hücreleri üzerinde HIV-1 _LAI'yi birçok kez geçirdik ve geçen virüsün Ci'ye duyarlılığını düzenli aralıklarla test ettik. 48 enfeksiyon turu (= 24 hafta) gerçekleştirildi ve her enfeksiyon turu için HIV-1, 24 saat boyunca EC ₅₀ veya EC _90'a karşılık gelen konsantrasyonlarda Ci ile inkübe edildi , ardından virüs için 2-3 gün boyunca Ci'siz inkübasyon yapıldı büyüme. Büyüme virüsünün Ci özütü ile inhibisyona duyarlılığı, enfeksiyonun her ikinci turundan sonra analiz edildi. Bu prosedür, kontrol olarak Ci olmadan da gerçekleştirildi.

Da gösterildiği gibi Şekil 6virüs, tüm gözlem süresi boyunca Ci muamelesine karşı duyarlılığı sabit bir seviyede tuttu. Ci özütü varlığında üretilen virüsün duyarlılığı, Ci işleminin yokluğunda üretilen virüsün duyarlılığı ile karşılaştırılabilirdi. Bu sonuçlar, uzun süreli Ci tedavisinin Ci dirençli virüslerin ortaya çıkmasına yol açmadığını göstermektedir.

Şekil 6
Cistus incanus ekstresi varlığında uzun süreli virüs geçişi sırasında HIV-1 direncinin ortaya çıkmaması .
Virüs, Ci özütü ile veya Ci özütü olmadan 48 geçiş (yani 24 hafta) boyunca pasajlandı ve her hafta Ci özütü ile inhibisyona duyarlılık açısından izlendi. Ci özütü ile her geçiş için, LC5-RIC hedef hücreleri, bir gün boyunca Ci özütü varlığında HIV-1 _LAI virüsüne maruz bırakıldı , ardından kaçış virüsünün Ci özütü olmadan 2-3 gün boyunca genişletilmesi izledi. Uzun süreli virüs pasajlama EC tekabül eden, Cı özü, iki farklı konsantrasyon ile gerçekleştirildi ₅₀ (CIEC ₅₀ çizgi grafiği) ya da EC ₉₀ (CIEC ₉₀ çizgi grafiği) başlangıç virüs aşı karşı inhibe edici konsantrasyon. Daha yüksek Ci özü konsantrasyonu (CiEC ₉₀), daha düşük Ci özü konsantrasyonu ile 6 haftalık geçişten sonra toplanan virüs ile başlatıldı. Virüs, kontrol olarak Ci ekstresi olmadan paralel olarak geçirildi (Yalnızca virüs çizgi grafiği). Her ikinci pasajdan toplanan virüs, farklı Ci ekstrakt konsantrasyonları (100 ug / ml ila 3.125 ug / ml; iki kat seri seyreltme) ile veya ekstrakt olmadan (=% 100 enfeksiyon) enfeksiyon deneylerinde Ci ekstresi ile inhibisyon açısından değerlendirildi. Semboller ortalama AT temsil ₅₀ üç bağımsız deneyde her bir virüs numunesi için belirlenen ve hata, ortalama standart sapma engellemektedir. Ci ekstresi ayrıca Filovirüs zarf proteinlerini hedef alır


Bu çalışma, Ci ekstresinin antiviral aktivitesinin HIV-1 ve HIV-2'ye yönelik olduğunu göstermektedir. Influenza A virüsünün ^{21 , 26} daha önce bildirilen inhibisyonuyla birlikte bu sonuçlar, Ci ekstraktının birden fazla ilgisiz virüse karşı antiviral aktiviteye sahip olduğunu güçlü bir şekilde ortaya koymaktadır. Ci tarafından inhibe edilen virüslerin spektrumunu daha fazla araştırmak için, Ci ekstresinin Ebola virüsü (EBOV) ve Marburg virüsü (MARV) zarf glikoproteinlerini de hedefleyip hedeflemediğini araştırdık. Bu amaçla, zarflarında HIV-1 gp120 yerine Ebola virüsü Zaire alt türü (ZEBOV) veya MARV glikoproteinleri ^{36 , 37} taşıyan sahte HIV-1 viryonları oluşturduk . Da gösterildiği gibiŞekil 7A, tam Ci özütü ve ayrıca Ci'den türetilmiş polifenoller (CiPP), ZEBOV ve MARV psödotipli virüsler (Şekil 7A). Psödotiplenmiş virüs proteinlerine karşı antiviral aktiviteler, doğal HIV-1 gp120'li virionlar için elde edilenlerle karşılaştırılabilirdi (Karşılaştırİncir 7A, A, 11 ve ve 2).2). Bunun aksine, ZEBOV ve MARV virionlar kadar önceden belirlenmiş AT daha yüksek, 100-kat yaklaşık 500 nM, konsantrasyonlarına T20 inhibitörü, HIV-1 füzyon etkilenmemiştir psödo ₅₀ KOLAY HIT sisteminde T20 değeri ²⁹ . GFP etiketli ZEBOV psödotipli virüsleri kullanarak, Ci özütünün hücrelere virüs bağlanmasını engellediğini gösterdik (Şekil 7B). Ayrıca, küme 1 ve küme 2'den üretilen ince fraksiyonların, ZEBOV psödotipli virüs enfeksiyonunu da engellediğini ve doğal gp120 taşıyan HIV-1 partikülleri ile elde edilene benzer bir aktivite profili verdiğini bulduk (Şekil 7C; ile karşılaştırmakŞekil 5B).

Ayrı bir pencerede aç
Şekil 7
Cistus incanus (Ci) ekstresi, yalancı tip lentivirüs partiküllerinde Filovirüs zarf proteinlerini bloke eder.
Filovirüs zarf glikoproteinleri ile psödotiplenmiş lentivirüs partikülleri, env -defective HIV-1 provirüs (pBR-NL43-Gag-iGFP-Δenv) ve Zaire Ebola virüsünden (ZEBOV-) bir zarf glikoproteini kodlayan plazmidler ile birlikte transfekte edilmiş hücreler tarafından üretildi. GP) veya Marburg Virüsü (MARV-GP). ( A ) Ci özütü ve Ci özütünün (CiPP) polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyonu, hücrelerin Ebola virüsünden (sol panel) veya Marburg virüsünden (sağ panel) zarf proteinleri ile psödotiplenmiş virüs partikülleri tarafından enfeksiyonunu inhibe eder.LC5-RIC hücreleri, 50 ug / ml ila 1.56 ug / ml (seri 2 kat seyreltmeler) arasında değişen farklı Ci özütü konsantrasyonlarının yokluğunda veya varlığında psödotiplenmiş lentivirüs partiküllerine maruz bırakıldı. HIV-1 füzyon inhibitörü T20 paralel olarak test edildi (500 nM ila 15.63 nM). Doz yanıt eğrileri gösterilmektedir. EC ₅₀ , Ci ve CiPP için belirtilmiştir. T20 için yıldız işareti (*), test koşulları altında psödotiplenmiş virüs partiküllerine karşı antiviral aktivite olmadığını gösterir. Semboller, üçlülerin ortalama değerlerini belirtir ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını belirtir. ( B ) Ci ve CiPP, psödotiplenmiş virüs partiküllerinin hücrelere birincil bağlanmasını önler.Ebola virüsü Zaire için zarf glikoproteinleri ile psödotiplenmiş GFP etiketli virüs partikülleri ile bağlanma deneyleri gerçekleştirildi. Hücrelerle ilişkili GFP sinyalleri, dönen disk konfokal mikroskopi ve Volocity 6.2.1 görüntüleme yazılımı ile nicelendirildi. Her numune için 4 görüntüde 60 hücre analiz edildi. Çubuklar, hücre başına GFP sinyallerinin ortalama değerlerini temsil eder ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. ( C ) Ci ekstraktının tekrarlayıcı fraksiyonasyonu sırasında üretilen AM ince fraksiyonlar (bkz. Şekil 5B) psödotiplenmiş virüs partiküllerinin neden olduğu enfeksiyonu inhibe eder. Antiviral aktivite, sabit bir Ci ekstresi dozu (10 ug / ml) ile test edildi. Çubuklar, her fraksiyon için üçlü testlerin ortalama değerlerini gösterir ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir.

Bu sonuçlar birlikte, Ci özütünün antiviral aktivitesinin HIV-1 gpl20 ile sınırlı olmadığını, aynı zamanda Ebola virüsü ve Marburg virüsü zarf glikoproteinlerine de uzandığını ve bu viral proteinlerin enfeksiyona aracılık etmesini engellediğini gösterir.

Şuraya gidin: Tartışma


Küresel ölçekte akut ve kronik yaşamı tehdit eden viral enfeksiyonların tedavisini mümkün kılmak için güçlü, ucuz ve güvenli antiviral ajanlara acil ihtiyaç vardır. Çeşitli tıbbi bitkilerin Herpesvirüsler, Dang Virüsleri, Hepatit B ve C virüsleri ve HIV ^{13 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43} gibi başlıca insan viral patojenlerini inhibe ettiği gösterilmiştir . Bu kapsamlı çalışmalara rağmen, bitkisel ürünler, viral enfeksiyonların küresel tedavisi için geniş çapta temin edilebilir, güvenli ve etkili tıbbi ajanlara henüz ilerletilmemiştir ⁴⁴ .

Standart ticari Cı özü Cystus052 ^® geçirmiş klinik test, insan sağlığına yararlı görüntüler çok biyolojik aktiviteleri vardır, ve daha önce hücre kültürü içinde Nezle bir virüs replikasyonunu inhibe ettiği gösterilmiştir ²⁶ ve bir hayvan modelinde ²¹ (aynı zamanda bkz). Burada Ci özütünün HIV ve Filovirüslere karşı güçlü antiviral etkilerini gösteriyoruz ve Ci özütünün viral zarf bileşenlerini hedeflediğini ve virüs parçacıklarının hücrelere bağlanmasını engellediğini gösteriyoruz.

Birden fazla HIV izolatı ile Ci ekstresinin (hem tam özüt hem de polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyon) anti-HIV aktivitesinin incelenmesi, HIV tip 1 ve tip 2 ve HIV-1 grup O dahil olmak üzere farklı majör HIV genotiplerini temsil eden klinik izolatlara karşı karşılaştırılabilir antiviral etkililikler ortaya çıkardı. M grubunun yanı sıra bu bulgu, HIV tipleri 1 ve 2 (% 50'nin üzerinde amino asit çeşitliliği) ve HIV-1 grubu M ve O (% 35'in üzerinde amino asit çeşitliliği) arasındaki yüksek genetik çeşitlilik nedeniyle beklenmedikti ⁴⁵ . Ayrıca, HIV-2 ve HIV-1 grup O, birkaç onaylanmış anti-HIV ilacına HIV-1 grup M'den daha az duyarlıdır. Bu nedenle HIV-2, doğası gereği T20'ye (Efavirenz) ve HIV-1 grup O'ya birkaç integraz ve nükleozid olmayan ters transkriptaz inhibitörleri ^{46 , 47 , 48, 49} . Ek olarak, Ci özütü, Ebola veya Marburg virüs zarf proteinleri içeren virüs partikülleri ile enfeksiyonu önledi, bu da Ci özütünün antiviral aktivitesinin Filovirüslerin zarf bileşenlerini de hedeflediğini gösterdi. Anti-Influenza A aktivitesi ^{21 , 26'nın} önceki raporlarıyla birlikte bu sonuçlar, Ci ekstraktının birden fazla ilgisiz, majör insan viral patojenlerine (yani HIV, Marburg virüsü, Ebola virüsü, Influenza A virüsü) karşı geniş spektrumlu antiviral aktivite gösterdiğini göstermektedir.

Ci özütünün antiviral aktivitesinin modunu araştırmak için tasarlanmış farklı deneysel deneyler, Ci özütünün virüs parçacıklarının konakçı hücreler ile etkileşime girmesini önlediğini ortaya koydu. Ci ekstresi ile muamele, viral RNA'nın hücrelere verilmesini bloke ederek Ci'nin giriş seviyesinde hareket ettiğini gösterdi. Ekleme zamanı tahlilleri, Ci tedavisinin, viral ve hücresel membranların füzyonundan önce çok erken bir aşamada virüsün girişini engellediğini gösterdi. Ayrıca, Ci tedavisi, GFP etiketli virüs partiküllerinin (HIV-1 ve Ebola virüsü psödotipli) hücrelere bağlanmasını inhibe etti. Bu sonuçlar birlikte, Ci işleminin, virüs partiküllerinin hücrelere birincil bağlanmasını önlediğini teyit eder; bu, konakçı hücrelerin virüs saldırısına karşı maksimum korumasını sağlayan bir etki mekanizmasıdır. Tersine,^{50 , 51 , 52} . Mevcut klinik olarak onaylanmış anti HIV ilaçlarının toplanması sadece iki giriş inhibitörü ³ , yani füzyon inhibitörü T20 ve CCR5 ko-reseptör bloke edici Maraviroc içerir. Onaylanmış ilaçların çoğu, HIV enzimlerini, yani proteaz, ters transkriptaz ve birkaç integraz inhibitörünü hedefler. Ci özütü HIV'i farklı bir etki tarzı ile engellediğinden, yaygın olarak kullanılan ilaçlara dirençli virüsleri engelleyebilmelidir. Aslında, Ci özütünün, tüm onaylanmış proteaz ve ters transkriptaz inhibe edici ilaçlara direnç kazandıran mutasyonlarlaçok dirençli bir HIV-1 izolatının (HIV-1 _V13-03413 ) in vitro replikasyonunuetkin bir şekilde bloke ettiğini gösterdik.

Bu çalışma ayrıca, Ci ekstraktının antiviral bileşenlerinin viral zarf proteinlerini hedeflediğine ve hücresel bileşenlere göre viral seçicilik gösterdiğine dair kanıt sağlar. Ön inkübasyon deneyleri, Ci özütünün antiviral bileşenlerinin spesifik olarak virüs partiküllerini hedeflediğini, ancak konakçı hücreler tarafından tutulmadığını doğruladı. Ci özütünün antiviral aktivitesinin virüs seçiciliği için daha fazla destek, bu çalışmada gerçekleştirilen HIV-1 virüs yakalama deneylerinden gelir; bu, Ci özütünün virüs partiküllerinin heparine gp120 aracılı bağlanmasını inhibe ettiğini, ancak konağın bağlanmasını engellemediğini gösterir. - antikor ligandı ile hücre türevi CD44 proteini. Virüs partiküllerinde gp120'nin seçici olarak bloke edilmesi, ancak CD44 proteininin bloke edilmemesi, Ci ekstraktının bileşenlerinin spesifik olmayan bir şekilde tüm virüs partiküllerini sarmak yerine özellikle viral zarflar üzerindeki gp120'yi maskelediğini gösterir.

Sadece HIV-1 ³³ değil, aynı zamanda birçok ilgisiz virüs, hücrelere birincil bağlanma için proteoglikanların heparin ve heparan sülfat kısımlarını kullanır. Filovirüslere ek olarak, bunlar Herpes virüslerini ve Hepatit B ve C virüslerini ^{53 , 54 , 55 , 56 içerir} . Ci özütünün, viral bileşenlerin bağlanma için çok sayıda virüs tarafından kullanılan hücre gruplarına bağlanmasını bloke ettiğine ilişkin bulgumuz, farklı virüslere karşı Ci özütünün geniş aktivitesi için daha fazla destek sağlar. Son zamanlarda, yeşil çaydan elde edilen tek moleküllü doğal bir ürünün de farklı viryonların heparan sülfat glikanlara birincil bağlanmasını inhibe ettiği bildirildi ⁵⁷, virüslerin hücrelere bağlanmasını engelleyen geniş spektrumlu doğal ürünlerin oluşumuna dair kanıt sağlar. HIV ile ilgili olarak, gp120'nin hedeflenmesi, Ci ekstresinin, hücreleri, HIV girişinin ötesine geçen gp120-hücre etkileşimlerinin zararlı sonuçlarından da koruyabileceğini göstermektedir. Bunlar arasında anormal sinyal olaylarının uyarılması ^{58 , 59} , T-hücrelerinin apoptozu ⁶⁰ ve nöronal hasar ^{61 , 62 bulunur} .

Ci özütünün virüs direncini indükleme eğilimini araştırmak için tasarlanan hücre kültürü deneyleri, Ci özütü varlığında HIV-1 geçişinin 24 hafta (= 168 gün) sırasında Ci-dirençli virüsün büyümesini göstermedi. Bunun aksine, virüs direnci riskinin, tek bileşikli bağlanma inhibitörü Fostemsavir (BMS-663068) ⁶³ için çok daha yüksek olduğu bildirilmiştir . Bu nedenle, hücre kültürü içinde seçim 14 gün, HIV-1 Fostemsavir dayanıklı oluşturmak için yeterli olan _LAI virüsü ve HIV-1 'de tek bir amino asit ikamesi _LAIEnv direniş için yeterliydi. Biyoanaliz kılavuzluğunda fraksiyonasyon çalışmaları, Ci ekstraktında çok sayıda antiviral bileşiğin varlığını gösterir. Aktif moleküllerin bu kombinasyonu, tek bileşikli antiretroviral ilaçlarla tedaviye kıyasla, muhtemelen Ci tedavisi sırasında dirençli virüslerin ortaya çıkma riskinin düşük olmasından sorumludur.

Bu çalışma, hücre kültürü koşulları altında Ci ekstresinin güçlü ve geniş antiviral aktivitesini gösterir. Ayrıca, klinik çalışmalar, in vivo ^{27 , 28} Ci ekstresi için olumlu bir güvenlik profili göstermiştir . Bu gözlemler Ci ekstraktının antiviral aktivitelerinin daha fazla araştırılmasını desteklese de, bu çalışmada sunulan sonuçlara dayanarak Ci ekstresinin ilaç olarak kullanılmasını savunmadığımızı belirtmek önemlidir. In vivo için Ci ekstresinin potansiyelinin değerlendirilmesiantiviral terapötik uygulamalar, ileride kapsamlı araştırmalar gerektirir. Bu yöndeki önemli bir adım, Ci ekstresinden tek tek antiviral ajanların belirlenmesi ve farmakokinetik özelliklerinin analizi olacaktır. Ci özütünün in vivo uygulamasının araştırılması için bir başka yol , HIV bulaşmasının ⁶⁴ cinsel yolla bulaşmasını önlemek için topikal mikrobisitler olarak potansiyel kullanımıdır . Bu çalışmada bulunan antiviral aktivitenin düşük pH ve yüksek sıcaklıklara direnci, Ci ekstresinin topikal uygulamalar için keşfini destekleyen özelliklerini daha da cesaretlendirmektedir.

Son olarak, Ci özütü ayrıca yeni antiviral ajanların madenciliği için bir kaynak sağlayabilir. Onlar sınırlı kimyasal çeşitliliği dahil sentetik kütüphanelerin çeşitli kısıtlamalar, üstesinden çünkü Böylece, doğal ürünler ilaç keşfi için popülerlik kazanmak olan ⁶⁵ . Ayrıca, 1981'den 2010'a kadar FDA tarafından onaylanan ilaçların% 34'ü doğal ürünlere dayalı veya bunlardan türetilmişken, doğal ürünlerin geçmişte ilaç geliştirme için çok başarılı ipuçları olduğu kanıtlanmıştır ⁶⁶. Antiviral aktivitenin, polifenolik bileşiklerin zenginleştirilmesiyle Ci özünden izole edilebileceğini ve çok sayıda ardışık fraksiyonlama adımında korunduğunu gösteriyoruz. Bu, azaltılmış karmaşıklığa sahip aktif ajanların Ci özünden üretilebileceğini gösterir. Kompleks veya basitleştirilmiş Ci özünden tek aktif bileşiklerin tanımlanması, yeni antiviral ajanlara yol açabilir ve ayrıca klinik çalışmalarda Ci'den türetilmiş antiviral ajanların farmakolojik özelliklerinin izlenmesi için imza molekülleri sağlayabilir.

Şuraya gidin: Sonuç


Ci özütü, geniş antiviral aktiviteyi düşük virüs direnci riski ile birleştirir. Etki mekanizması, viral zarf glikoproteinlerinin seçici hedeflenmesiyle hücrelere birincil virüs bağlanmasının bloke edilmesini içerir. Buna karşılık, geniş spektrumlu antiviral aktiviteye sahip diğer birçok doğal ürün, konak hücre bileşenleri ⁶⁷ hedefler . Sonuçlarımız, Ci ekstresi içindeki çok sayıda antiviral bileşenin, konakçı hücreye virüs bağlanmasını engellediğini gösterir. Hepsi birlikte, bu çalışmada gösterilen Ci ekstresinin geniş ve güçlü in vitro antiviral etkileri, yeni antiviral yaklaşımlar için Ci ekstresinin ve bileşenlerinin daha fazla araştırılmasını desteklemektedir.

Şuraya gidin: Malzemeler ve yöntemler

Virüsler ve virüs üretimi


HIV-1 stoklarının üretimi ve miktar tayini, ^{15 , 29'da} açıklandığı gibi gerçekleştirildi . Kısaca, HIV-1 laboratuvar izolatlarının stokları, HEK 293 T hücrelerinin, NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH: pLAI.2 (Dr. Keith Peden ⁶⁸ ), pNL (AD8) (Dr. Eric O. Freed ^69'dan ). GFP etiketli virüsler, pBR-NL43-Gag-iGFP ³² ile transfeksiyon yoluyla üretildi . Zarfta CD44 bulunan virionlar, LC5-RIC hücrelerinin (yüzey CD44 için pozitif) HIV-1 _LAI ile enfekte edilmesiyle oluşturulmuştur.virüs. Virüs içeren hücre kültürü süpernatantları, transfeksiyon / enfeksiyondan 72 saat sonra hasat edildi ve -80 ° C'de saklandı. Virüs stoklarındaki virüs seviyeleri, Gag-p24 antijen enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) (Advanced Bioscience Laboratories, Maryland) ile ve ^29'da açıklandığı gibi LC5-RIC hücreleri üzerinde titrasyonla ölçüldü .

Birincil Klinik HIV-1 M HIV izole _MVP899-87 HIV-1O _MVP5180-91 HİV-2 _MVP10668-93 ve HIV-1 _V13-03413B de tarif edildiği gibi elde edilmiştir ⁷⁰ . Çok dirençli izolat HIV-1 _V13-03413Bvirolojik tedavi başarısızlığı olan bir hastadan elde edildi ve dizi analizi ile ters transkriptaz (RT) ve proteazı (PR) kodlayan bölgelerde çoklu ilaç direnci mutasyonları içerdiği gösterildi. RT: T69I, V75I, L100I, K103N, Y115F, V118I, Q151M, V179L, M184V, L210F, K219E, H221Y; PR: L10I, V11I, K20R, V32I, L33F, E35D, M46I, I54L, Q58E, A71V, G73T, V82A, I84V, L90M. Klinik izolatların üretimi için, hücre kültürü süpernatanı içeren virüs içinde HIV ile enfekte olmuş H9 hücrelerinin donmuş stokları çözülmüş ve 6 hücre geçişi için kültürlenmiştir. Her üç ila dört günde bir, enfekte olmuş hücre popülasyonunun yaklaşık yarısı, enfekte olmamış H9 hücreleri ile değiştirildi ve enfekte olmuş hücre popülasyonunun kültür süpernatantının yaklaşık% 60-70'i taze ortam ile değiştirildi.²⁹ . HIV inhibisyon deneyleri, inhibitörlerin yokluğunda LC5-RIC raportör kültürlerinin nispi floresan sinyal yoğunluklarında en az 100 kat artış sağlayan virüs aşılama hacimleri ile gerçekleştirildi.

Ebola veya Marburg virüsü glikoproteini psödotiplenmiş virüs üretimi için HEK293T hücreleri, HIV omurga plazmiti pBR-NL43-Gag-iGFP-Δenv ⁷¹ ve glikoprotein ekspresyon plazmitleri pCAGGS-ZEBOV-V5 ³⁶ veya pCAGGS-Marv ile birlikte transfekte edildi. V5 ³⁷ ve psödotiplenmiş virüs partikülleri, transfeksiyondan 72 saat sonra hasat edildi ve -80 ° C'de saklandı. Hücreler ve hücre kültürü


Yapışarak büyüyen hücre hatları (HEK293T, LC5-türevleri),% 10 FCS ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti (Gibco® Life Technologies, ABD) ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle's Medium'da (DMEM; Gibco® Life Technologies, ABD) kültürlendi. H9 hücreleri,% 10 FCS ve% 1 antibiyotik-antimikotik solüsyon (Gibco® Life Technologies, ABD). Tüm hücreler, standart şartlar altında muhafaza edilmiştir (37 ° C,% 5 COz ₂ ).

İnsan embriyonal böbrek hücre hattı HEK293T (ATCC®-Numarası CRL-11268) ve insan T-lenfoma hücre hattı H9 (ATCC®-Numarası HTB-176), ATCC aracılığıyla elde edilmiştir. LC5 hücre çizgisi, HeLa hücrelerinden türetilir. LC5-CD4, LC5-RIC ve LC5-RIC-R5'in üretimi, özellikleri ve kültürü ayrıntılı olarak ^{15 , 29 , 72'de açıklanmaktadır.}. Kısaca, LC5-CD4 hücreleri, insan CD4 ve neomisin direncinin ekspresyonu için stabil şekilde entegre diziler içerir. LC5-RIC hücreleri, HIV-1 Tat ve Rev kontrolü altında bir DsRed-raportör geninin ve higromisin B direnci sekanslarının stabil entegrasyonu yoluyla LC5-CD4 hücrelerinden türetildi. LC5-RIC-R5 hücreleri, bir insan CCR5 kodlayan cDNA ve puromisin direnci dizilerinin kararlı entegrasyonu ile LC5-RIC hücrelerinden türetilmiştir. LC5'ten türetilen hücre çizgileri, düzenli aralıklarla uygun antibiyotiklerle kültürlendi.

Periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), buffy-coats'tan Ficoll (Biochrom AG, Almanya) gradyan santrifüjü ile daha önce Fuss et al. ⁷³ . Hücreler daha sonra yıkandı ve kalıntı trombositleri ve eritrositleri uzaklaştırmak için amonyum klorür potasyum (ACK) tamponuyla (Gibco® Life teknolojileri, ABD) işlemden geçirildi. Hücreler hemen, gece boyunca% 10 FCS ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti (Gibco® Life teknolojileri, ABD) ve 20 U / ml hIL-2 (Roche, Almanya) ile desteklenen VLE-RPMI 1640 ortamında (Biochrom AG, Almanya) yetiştirildi. ) ve 1 ug / ml fitohemaglutinin (PHA) (Biochrom AG, Almanya) uyarılmak üzere hücrelere eklenmiştir. Hücreler, enfeksiyon için kullanılmadan önce üç gün süreyle uyarıldı. Cistus incanus özleri ve fraksiyonları


Antiviral test için kullanılan Ci ekstresinin ana kaynağı tıbbi ürün CYSTUS052® idi (Dr. Pandalis Urheimische Medizin GmbH und Co. KG, Almanya). Ayrıca, kurutulmuş Cistus incanus bitkilerinden (Cistus incanus Bio Tee, Dr. Pandalis Urheimische Medizin GmbH und Co. KG, Almanya) ve taze bitkilerden (Cystus®, Cistus incanus ssp. Tauricus;Rühlemann'ın Kräuter und Duftpflanzen, Horstedt, Almanya) bitki materyalini 1 saat suda kaynatarak. Tüm Ci ekstraktları steril filtrelendi (0,45 μm şırınga-filtre Millex®-HV, Merck Millipore, Darmstadt, Almanya), bir Eppendorf Vakum Konsantratörü içinde kurutuldu, kuru kütlenin ağırlığı belirlendi ve kuru kütle −20 ° C'de saklandı kullanıma kadar. Test için kuru kütle, tipik olarak ml başına 10 mg kuru kütle içeren stok çözeltilerle hücre kültürü ortamında çözündürüldü.

Polifenoller, Helfer ve ark. ¹⁵ . Kısaca, polifenoller, polivinilpirolidona (PVPP, Sigma Aldrich) adsorbe edildi ve 0.5 N NaOH ile ayrıştırıldı. Elüatlar, HCl ile pH 6'ya dengelendi ve bir C18 SPE kolonu (Bond Elut C18, Agilent Technologies, California, ABD) ile katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile saflaştırıldı.

Ekstre ters evrişim için Ci özütünün ayrılması, bitki özlerinin ters evrişimi için tescilli teknoloji kullanılarak Bicoll GmbH tarafından gerçekleştirildi. Antiviral aktivitelerin değerlendirilmesi için hücre bazlı testler


Enfeksiyon Tahlillerinin Engellenmesi


Virüs enfeksiyonunun antiviral maddeler tarafından engellenmesini test etmek için standart tahlil formatı Kremb ve diğ. ^{15 , 29} . Kısaca, LC5-RIC raportör hücreleri 1 x 10 bir yoğunlukta 96 oyuklu plakalara tohumlandı ⁴ 100 ul kültür ortamında oyuk başına hücre. 24 saat sonra, test bileşikleri ve kültür başına 10 pg Gag-p24 / hücre veya -100 nispi floresan yoğunluğu artırıcı birim ile sonuçlanan uygun hacimde virüs aşılama hücrelere eklenmiştir. Plakalar 48 saat inkübe edildi ve kültürlerin floresan sinyalleri 552/596 nm eksitasyon / emisyon dalga boylarında bir Tecan Infinite M200 plaka okuyucu (Tecan, Crailsheim, Almanya) ile ölçüldü. Test bileşikleri, 2 kat seri seyreltmelerle oluşturulan en az 6 konsantrasyonda test edildi. Kontroller, test bileşiği (=% 100 enfeksiyon) olmadan virüse maruz bırakılan kültürlerden ve virüs ve bileşik içermeyen kültürlerden (= arka plan) oluşuyordu. Her bir bileşik konsantrasyonu, altı oyukta en az üçlü oyuklarda ve kontrollerde test edildi. Floresan sinyaller, tedavi edilmemiş, virüse maruz kalan kültürlerinkilere (=% 100 enfeksiyon) normalize edilmiş bileşikle muamele edilmiş kültürlerin arka plan sinyalleri ve floresan sinyalleri için düzeltildi. Test bileşiğinin antiviral potensi, maksimum etkin konsantrasyonun yarısı olarak ifade edildi (EC₅₀ ),% 50 enfeksiyon inhibisyonu sağlamak için hesaplanan konsantrasyonu belirtir.

Primer insan hedef hücrelerin enfeksiyonunun engellenmesi, 96 gözlü levhalar (1 x 10 tohumlandı uyarılmış PBMC ile test edilmiştir ⁵  hIL-2 ve PHA (yukarı bakınız) ve 24 saat boyunca kültürlenir ihtiva eden kültür ortamı içinde oyuk başına hücre). Kültürlere virüs aşısı (10 pg Gag-p24 / hücre) ve test bileşikleri eklenmiştir (120 ul toplam kültür hacmi). Test bileşikleri, her konsantrasyon için en az 3 replikat oyukta farklı konsantrasyonlarda (yukarıya bakın) ve 6 replike oyukta kontrollerde test edildi. 48 saat sonra, her oyuktan 20 ul kültür süpernatanı, LC5-RIC raportör hücrelere aktarıldı ve haberci kültürlerin floresan sinyalleri 72 saat sonra ölçüldü.

Ekleme zamanı (TOA) testleri


TOA tahlilleri, 96 oyuklu plakalarda LC5-RIC hücreleri ile gerçekleştirildi. Tahlil formatı, birkaç değişiklikle pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere inhibitör potenslerini belirlemek için kullanılana benzerdi (yukarıya bakınız). İnhibitörler kuyucuklara ya HIV-1 _LAI virüsü aşılamasıyla (zaman noktası 0 olarak tanımlanmıştır) eş zamanlı olarak ya da daha sonraki çeşitli zaman noktalarında eklenmiş ve kültürlerin floresan sinyalleri virüs ilavesinden 48 saat sonra belirlenmiştir. Ci ekstresine ek olarak, T20 ve Efavirenz referans inhibitörleri olarak kullanılmıştır (her ikisi de NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH aracılığıyla elde edilmiştir). Tamamen engellenmesini sağlamak için, tedavi için kullanılan önleyici konsantrasyonu aşıldığında 5 x AT ₅₀ , örneğin, 100 ug / ml Ci özü, 100 nM Efavirenz ve 500 nM T20.

Ön kuluçka tahlilleri , 100 ug / ml ila 3.12 ug / ml (2 kat seri seyreltme) arasında değişen farklı Ci ekstresi konsantrasyonları kullanılarak standart bir enfeksiyon tahlil formatında (yukarıya bakınız) gerçekleştirilmiştir. Hücrelerin Ci ekstresi ile ön inkübasyonu için, LC5-RIC kültürleri 3 saat boyunca Ci ekstresi ile inkübe edildi, hücreler bir kez PBS ile yıkandı ve enfeksiyon için hücrelere taze ortamda virüs (HIV-1 _LAI ) eklendi. Virüs inokulumunun Ci ekstresi ile ön inkübasyonu için, virüs inokülumu, uygun Ci ekstresi seyreltileri ile üç saat süreyle ön inkübe edildi ve virüs-Ci karışımı, enfeksiyon için LC5-RIC hücrelerine aktarıldı. Paralel bir plakada, hücreler, enfeksiyon tahlilinin standart inhibisyonunda kullanılan koşullara karşılık gelen, eş zamanlı olarak Ci ekstresi ve virüs aşılamasına maruz bırakıldı.

Virüs bağlanma deneyleri , Helfer ve ark. ¹⁵. Kısaca, LC5-RIC hücreleri, 12 oyuklu plakalarda cam kapak fişleri (24x24 mm) üzerine tohumlandı ve GFP etiketli HIV-1 viryonları veya psödotiplenmiş virüs partikülleri (HIV-1 veya psödotipli virüsün 1 ml kültür süpernatanı) ile inkübe edildi. 100 ug / ml tam Ci ekstresi (Ci) veya Ci polifenol fraksiyonu (CiPP) varlığında kuyucuk başına hücre üretme). Virüs bağlanması için pozitif kontrol olarak hücreler, Ci ekstresi olmadan virüse maruz bırakıldı. Arka plan kontrolü, virüs ve Ci özütü olmadan kültürlenen hücrelerden oluşuyordu. HIV-1 viryonlarının bağlanması, virüsün hücrelere girişini engellemek için 50 nM T20 füzyon inhibitörü varlığında test edildi. 4 saat inkübasyondan sonra hücreler, PBS ile yıkandı, 30 dakika boyunca% 2 paraformaldehit ile sabitlendi, tekrar 3 kez yıkandı ve hücre içi DNA'yı boyamak için 15 dakika süreyle DAPI boyama solüsyonunda (1:10 000) inkübe edildi. Lameller cam slaytlar üzerine sabitlendi ve numuneler, Perkin Elmer UltraView Vox sistemi (pozlama süreleri GFP: 100 mS, DAPI: çeşitli; Brightfield: çeşitli) ile donatılmış bir Nikon TiE kullanılarak dönen disk konfokal mikroskopi ile analiz edildi. Hacim 6.2.1. yazılım, virüs parçacıklarını ölçmek için kullanıldı (= GFP noktaları; en parlak noktanın etrafında 1 μm'lik bir yarıçap içindeki tüm pikseller, yoğunluk eşiği 755 olarak tanımlanır). DAPI-pozitif hücreler manuel olarak sayıldı. Virüs yakalama deneyleri


Viral zarflarda konakçıdan türetilen CD44'ün hareketsizleştirilmiş liganda bağlanmasına dayanan virüs yakalama deneyleri, anti-insan CD44 antikorları (μMACS VitalVirus HIV İzolasyon Kiti, Miltenyi Biotec, Almanya) ve LC5 tarafından üretilen HIV-1 _LAI ile konjuge manyetik mikro boncuklarla gerçekleştirildi- Üreticinin talimatlarına göre RIC hücreleri (CD44 pozitif). HIV-1 _{LAI ile} enfekte olmuş LC5-RIC hücrelerinin kültür süpernatantları , 3.000 g'de santrifüjlenmiştir. hücre enkazını gidermek için. Eşdeğer miktarlarda HIV-1 Gag-p24 (59 ng / μl) ve 200 μg / ml Ci ekstresi veya DMEM içeren numuneler (1 ml), standart hücre kültürü koşulları altında inkübe edildi. 2 saat sonra, numunelere anti-CD44 mikro boncuklar (250 ul) ilave edildi ve inkübasyon 30 dakika devam etti. Virüs / mikro boncuk karışımı, bir manyetik alan içinde bir μMACS kolonuna yüklendi ve daha sonra kolonlar 3 kez yıkandı. Virüs elüsyonu için manyetik alandan kolonlar çıkarıldı ve virüs partikülleri 300 ul DMEM ile elute edildi. Elüat içindeki virüs seviyeleri, akış ve yıkama fraksiyonları Gag-p24 antijen ELISA ile ve LC5-RIC hücreleri ile standart bir enfeksiyon testinde 2 kat seri seyreltmede 20-2.5 ul titrasyonuyla belirlendi.

Viral gp120 zarf proteininin heparin boncuklarına bağlanmasına dayanan virüs yakalama deneyleri, Salvador ve ark. ⁵⁴ . Virüs örneklerinin hazırlanması için, 10 ml HIV-1 _LAI kültür süpernatanıüreten hücreler, Amicon® Ultra -15 100 k Santrifüj Filtre Üniteleri (Merck Millipore, Darmstadt, Almanya) ile ultrasantrifüjleme yoluyla konsantre edildi ve retentat, 10 ml bağlama tamponu (PBS içinde 10 mM sodyum fosfat) içine alındı. 1 ml virüs çözeltisi, 3 saat boyunca 150 ug / ml Ci veya ilgili miktarda PBS ile inkübe edildi. Heparin boncukları, 1 ml kolonlardan (GE Healthcare; Almanya) HiTrap ™ Heparin HP'den ekstrakte edildi, iki kez PBS ile yıkandı ve 5 ml bağlama tamponu içinde yeniden süspanse edildi. 600 µl virüs solüsyonuna (+ veya −Ci) 200 µl boncuk solüsyonu eklenmiş ve virüs-boncuk karışımları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilmiştir. Boncuklar daha sonra 900 g'de 3 dakika peletlendi, süpernatan atıldı ve boncuk peleti iki kez 1 ml PBS ile yıkandı. Boncuklara virüs bağlanmasının değerlendirilmesi için boncuk peletinin bir numunesi (100 ul) çıkarıldı. Kalan boncuk peleti, elüsyon tamponunda (PBS içinde 10 mM sodyum fosfat; 2 M NaCl) yeniden süspanse edildi, boncuklar santrifüj yoluyla çıkarıldı ve süpernatan (= elüat) toplandı. Boncuk peletleri ve elütler -20 ° C'de saklandı ve Gag-p24 antijen ELISA ile HIV-1 varlığı açısından değerlendirildi. QRT-PCR ile hücrelere HIV genomik RNA iletiminin değerlendirilmesi


Her deney, virüse maruz kalan kültürlerin 3 örneğinden ve virüse maruz kalmayan kültürlerin bir arka plan örneğinden oluşuyordu. Tüm numuneler iki kez test edildi. Virüse maruz kalma, tam Ci özütü (Ci) veya Ci polifenol fraksiyonu (CiPP) varlığında veya maksimum virüs RNA iletimini değerlendirmek için Ci özü olmadan gerçekleştirildi. LC5-CD4 hücreleri, 6 oyuklu plakalar (4 x 10 tohumlandı ⁵ 24 saat süreyle inkübe edildi ve hücreler, göz başına), HIV-1 _LAI (10 ug Gag-p24 / hücre) ya da birlikte ilave edildi (100 ug / ml) veya Ci özü olmadan. Tüm kültürler ayrıca, iletilen viral RNA'nın ters transkripsiyonunu önlemek için 50 nM Efavirenz (NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH aracılığıyla elde edilmiştir) içermiştir.

Virüs ilavesinden dört saat sonra, hücreler yoğun bir şekilde yıkandı, hasat edildi ve RNA, üreticinin talimatlarına göre RNeasy-kit (Quiagen, Hollanda) kullanılarak izole edildi. HIV-1 RNA seviyeleri, qPCR ile RNA polimeraz II (RPII) temizlik geninin transkript seviyelerine göre ölçüldü. Bu amaçla, cDNA, üreticinin protokolüne göre Superscript®III First-Strand Sentez Sistemi (Life Technologies, ABD) kullanılarak rastgele heksamerlerle ters transkripsiyon yoluyla RNA'dan üretildi. qPCR, FastStart DNA Master SYBR Green I-Kit, Roche Light Cycler 1.5 cihazı ve LightCycler 480 Yazılımı, Sürüm 1.5 (standart LightCycler protokolü) ile gerçekleştirilmiştir. Aşağıdaki primerler, HIV-1 dizilerinin amplifikasyonu için kullanıldı: HIV-ileri primer 5′-CCA GTC ACA CCT CAG GTA CCT TTA AGA CC-3 ′ ve HIV-ters primer 5′-GTG TGT GGT AGA TCC ACA GAT CAA GG-3 ′. RPII sekansları, aşağıdaki primerler RPII'ler 5′-GCA CCA CGT CCA ATG ACA-3 ve RPIIas 5′-GTG CGG CTG CTT CCA TAA-3 ile amplifiye edildi. Veriler ikinci türev maksimum yöntemi ile analiz edilmiş ve göreceli ifade oranları 2 ile hesaplanmıştır.^–ΔΔCT yöntemi ⁷⁴ , ΔCT [CT (HIV hedefi) - CT (RPII referansı] 'nı temsil eder. ΔΔCT, ΔCT virüsüne maruz kalan örnekleri eksi arka plan örneklerinin ΔCT'sini gösterir (virüs yok). Direnç Deneyi


HIV-1 _LAI , 6 çukurlu plakalarda Ci özü ile veya olmadan LC5-RIC hücrelerinde 48 kez (24 hafta) geçirildi. Her geçiş için hücreler, enfeksiyonun 24 saati boyunca Ci ekstresi varlığında virüse maruz bırakıldı. Ortam daha sonra taze ortam ile değiştirildi ve kültürler, virüs üretimi için 48 ila 72 saat süreyle inkübe edildi. Kültür süpernatantları toplandı ve sonraki virüs geçişi için inokülum olarak 500 ul kullanıldı. Cı ekstresi ile tedavi EC tekabül eden, 8.06 ug / ml veya 15.5 ug / ml Ci ekstresi ile gerçekleştirilmiştir ₅₀ ve EC ₉₀ (sırasıyla ilk, HIV-1 aşı ile belirlenmektedir). Geçiş, kontrol olarak Ci ekstresinin yokluğunda paralel olarak gerçekleştirildi.

Cı özütü ile inhibisyona virüs her ikinci geçit, duyarlılık kültür üstte kalan fazları ve ug / ml AB belirlemek için, 100 ila 3,125 arasında değişen Ci özü konsantrasyonları 5 ul kullanılarak, standart bir enfeksiyon deneyleri ile belirlenmiştir ₅₀ değerleri. Hücre canlılığı deneyi


Hücre canlılığı üzerindeki bileşik etkileri, mitokondriyal enzimler ⁷⁵ tarafından sarı MTT'nin mor formazana indirgenmesini ölçen MTT (3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolyum bromür) deneyi ile izlendi . MTT deneyi, Kremb ve ark. ²⁹ . istatistiksel analiz


AT ₅₀ / CC ₅₀ değerleri alt için en için 100 ve 0 olarak ayarlanır değişken eğimli ve kısıtlamaları ile sigmoid doz-yanıt için denklem kullanılarak, GraphPad Prism v5 ile hesaplanmıştır.

Şuraya gidin: Ek Bilgiler


Bu makaleden nasıl alıntı yapılır : Rebensburg, S. et al. Cistus incanus özütünün HIV ve Filovirüslere karşı güçlü in vitro antiviral aktivitesi, viral zarf proteinlerini hedef alır. Sci. Rep. 6 , 20394; doi: 10.1038 / srep20394 (2016).


Şuraya gidin: Ek materyal

Ek bilgi:
Görmek için buraya tıklayın. ^{(694K, belge)}
Şuraya gidin: Teşekkürler


PCAGGS-ZEBOV-V5 ve pCAGGS-MARV-V5 plazmitlerini sağlayan Göttingen Alman Primat Merkezi'nden Stefan Pöhlmann'a, Phillips-Universität Marburg Viroloji Enstitüsü'nden Stephan Becker'ın izniyle teşekkür ederiz. Sürekli destek ve teşvik için Münih Teknik Üniversitesi'nden Ulrike Protzer'e ve Viroloji Enstitüsü'nden Helmholtz Zentrum München'e minnettarız. Helmholtz Zentrum München, Viroloji Enstitüsü'nden Ingrid Hülsmeyer ve Johanna Götz'e uzman teknik yardımları için teşekkür ederiz.

Şuraya gidin: Dipnotlar




Yazar Katkıları SR, MH, RBW, HK, M. Schneider ve M. Schindler deneyleri tasarladı ve tasarladı. SR ve MH deneyleri gerçekleştirdi. SR, MH, M. Schneider ve HK deneysel verileri değerlendirdi. LG ve JE, klinik HIV-1 izolatlarının birincil izolasyonundan ve karakterizasyonundan sorumluydu. SR makalenin ilk taslağını yazdı ve RBW, M. Schneider, M. Schindler ve LG büyük revizyonlar yaptı. Yazının sonuçlandırılmasından RBW sorumluydu. Tüm yazarlar makaleyi gözden geçirdi.



Şuraya gidin: Referanslar

• DSÖ. 2000 ve 2012'de dünyada ilk 10 önde gelen ölüm nedeni . Şu adresten ulaşılabilir: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (Erişim: 21 Ekim 2015).
• NEJM. Ebola Virüs Hastalığı: Güncel Bilgiler . Şu adresten ulaşılabilir: http://www.nejm.org/action/showMedia...10741_attach_1 (Erişim Tarihi: 21 Ekim 2015).
• AIDSinfo. FDA Onaylı HIV İlaçları . Şu adresten ulaşılabilir: https://aidsinfo.nih.gov/education-m...-hiv-medicines (Erişim Tarihi: 21 Ekim 2015).
• Taiwo B., Hicks C. & Eron J. HIV-1 için kombinasyon antiretroviral tedavinin yeni çağında karşılanmamış terapötik ihtiyaçlar . Antimikrobiyal Kemoterapi Dergisi (2010). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Vella S., Schwartländer B., Sow SP, Eholie SP ve Murphy RL Antiretroviral tedavinin tarihi ve dünyanın sınırlı kaynak bölgelerinde uygulanmasının tarihi . Aids 26 , 1231–1241 (2012). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Tan IL & McArthur JC HIV-İlişkili nörolojik bozukluklar . CNS ilaçları 26 , 123–134 (2012). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Tang MW & Shafer RW HIV-1 Antiretroviral Direnç . İlaçlar 72 , e1 – e25 (2012). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Cragg GM & Newman DJ Natural ürünleri: sürekli yeni ilaç liderleri kaynağı . Biochimica et Biophysica Açta (BBA) - Genel Konular 1830 , 3670–3695 (2013). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Cowan MM Plant ürünleri antimikrobiyal ajanlar olarak . Klinik mikrobiyoloji incelemeleri 12 , 564–582 (1999). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Farnsworth NR, Akerele O., Bingel AS, Soejarto DD & Guo Z. Tedavide şifalı bitkiler . Dünya sağlık örgütü bülteni 63 , 965 (1985). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Miller LH & Su X. Artemisinin: Çin bitki bahçesinden keşif . Cell 146 , 855–858 (2011). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Nobel Ödülü. 2015 Nobel Tıp Ödülü Sahipleri için Basın Duyurusu . Şu adresten ulaşılabilir: http://www.nobelprize.org/nobel_priz...015/press.html (Erişim Tarihi: 21 Ekim 2015).
• Mukhtar M. vd. Tıbbi bitkilerin antiviral potansiyelleri . Virüs araştırması 131 , 111–120 (2008). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Cordell GA & Colvard MD Doğal ürünler ve geleneksel tıp: bir paradigma açmak . Doğal ürünler dergisi 75 , 514–525 (2012). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Helfer M. vd. Tıbbi bitki Pelargonium sidoides'in kök ekstresi, güçlü bir HIV-1 bağlanma inhibitörüdür . PLoS ONE 9 (1) , e87487 (2014). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Chinou I., Demetzos C., Harvala C., Roussakis C. & Verbist J. Cistus incanus subsp. creticus . Planta medica 60 , 34–36 (1994). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Bouamama H., Villard J., Benharref A. & Jana M. Cistus incanus ve C. monspeliensis yaprak ekstraktlarının antibakteriyel ve antifungal aktiviteleri . Therapie 54 , 731–733 (1998). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Riehle P., Vollmer M. & Rohn S. Cistus incanus bitkisel infüzyonlarındaki fenolik bileşikler - demleme işlemi sırasında antioksidan kapasitesi ve termal stabilite . Food Research International 53 , 891–899 (2013). [ Google Scholar ]
• Wittpahl G. vd. Cistus incanus bitki çayının polifenolik bileşimi ve Streptococcus mutans'a karşı antibakteriyel ve anti-yapışma aktivitesi . Planta medica (2015). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Petereit F., Kolodziej H. ve Nahrstedt A. Flavan-3-ols ve Cistus incanus kaynaklı proantosiyanidinler . Phytochemistry 30 , 981–985 (1991). [ Google Scholar ]
• Polifenol açısından zengin bir bitki özütü olan Droebner K., Ehrhardt C., Poetter A., Ludwig S. & Planz O. CYSTUS052, farelerde anti-influenza virüsü aktivitesi sergiler . Antiviral araştırma 76 , 1–10 (2007). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Riehle P., Rusche N., Saake B. & Rohn S. Yaprak içeriğinin ve bitkisel partikül boyutunun, Cistus incanus bitki çaylarındaki kantitatif fenolik bileşiklerin varlığı ve ekstrakte edilebilirliği üzerindeki etkisi . Tarım ve gıda kimyası dergisi 62 , 10978–10988 (2014). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Barrajón ‐ Catalán E. ve diğerleri. Çeşitli Cistus cinsi türlerinden türetilen sulu ekstrelerin polifenolik bileşiminin sistematik bir çalışması: evrimsel ilişki . Fitokimyasal Analiz 22 , 303–312 (2011). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Daglia M. Antimikrobiyal ajanlar olarak polifenoller . Biyoteknolojide güncel görüş 23 , 174–181 (2012). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Andrae-Marobela K., Ghislain FW, Okatch H. & Majinda RR Polifenoller: çok hedefli anti-HIV-1 ajanlarının çeşitli bir sınıfı . Mevcut ilaç metabolizması 14 , 392–413 (2013). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Ehrhardt C. vd. Polifenol bakımından zengin bir bitki özütü olan CYSTUS052, toksik yan etkiler veya viral direnci indükleme eğilimi olmaksızın hücre kültüründe anti influenza virüsü aktivitesi gösterir . Antiviral araştırma 76 , 38–47 (2007). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Kalus U., Kiesewetter H. & Radtke H. CYSTUS052® ve yeşil çayın, üst solunum yolu enfeksiyonu olan hastalarda sübjektif semptomlar üzerindeki etkisi . Fitoterapi araştırması 24 , 96–100 (2010). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Kalus U. vd. Üst solunum yolu enfeksiyonu olan hastaların tedavisi için Cistus incanus (CYSTUS052): prospektif, randomize, plasebo kontrollü bir klinik çalışma . Antiviral araştırma 84 , 267–271 (2009). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Kremb S. vd. EASY-HIT: Çok sayıda HIV inhibitörü sınıfının geniş keşfi için HIV tam replikasyon teknolojisi . Antimikrobiyal ajanlar ve kemoterapi 54 , 5257–5268 (2010). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• HIV-SINIFI. Araştırma için HIV Sekans analizi . Mevcut: http://www.hiv-grade.de/grade/deploy...program=hivalg (Erişim: 21 Ekim 2015).
• Daelemans D., Pauwels R., De Clercq E. & Pannecouque C. Antiviral bileşiklerin hedef tanımlanmasına yönelik ilaç zamanı ekleme yaklaşımı . Doğa protokolleri 6 , 925–933 (2011). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Koppensteiner H., Banning C., Schneider C., Hohenberg H. & Schindler M. Makrofaj dahili HIV-1, nötralize edici antikorlardan korunur . Journal of virology 86 , 2826–2836 (2012). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Connell BJ & Lortat-Jacob H. İnsan immün yetmezlik virüsü ve heparan sülfat: bağlanmadan giriş inhibisyonuna . İmmünolojide Sınırlar 4 (385), 2 (2013). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Ott DE HIV virionlarında hücresel proteinler . Tıbbi viroloji incelemeleri 7 , 167–180 (1997). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Helleboid S. vd. Doğal olarak oluşan neoruscogenin'in nükleer reseptör RORa'nın (NR1F1) biyolojik olarak kullanılabilir, güçlü ve yüksek afiniteli bir agonisti olarak tanımlanması . Journal of biomolecular scaning 19 (3), 399-406 (2013). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Kühl A. vd. Ebola virüsü glikoproteini ve HIV-1 Vpu, antiviral faktör tetherine karşı koymak için farklı stratejiler kullanır . Enfeksiyon Hastalıkları Dergisi 204 , 850–860 (2011). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Gnirß K. vd. Tetherin antagonizması için gerekli filovirüs glikoproteinlerinde belirleyicilerin analizi . Virüsler 6 , 1654–1671 (2014). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Chattopadhyay D. & Khan MTH Etnomedikinler ve herpes virüslerine karşı etnomedikinal fitoforlar . Biyoteknoloji yıllık incelemesi 14 , 297–348 (2008). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Kadir SLA, Yaakob H. & Zulkifli RM Potansiyel dang humması önleyici şifalı bitkiler: bir inceleme . Doğal ilaçlar dergisi 67 , 677–689 (2013). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Chen Y. & Zhu J. Bireysel geleneksel Çin bitkisel tıbbının in vitro ve in vivo anti-HBV etkisi : analitik bir inceleme . Journal of viral hepatitis 20 , 445–452 (2013). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Ashfaq UA & Idrees S. Hepatit C virüsüne karşı şifalı bitkiler . Dünya gastroenteroloji dergisi: WJG 20 , 2941–2947 (2014). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Chingwaru W., Vidmar J. & Kapewangolo PT İnsan immün yetmezlik virüsü enfeksiyonlarının yönetiminde Sahra altı Afrika bitkilerinin potansiyeli: Bir inceleme . Fitoterapi Araştırması 29 , 1452–1487 (2015). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Dvorkin-Camiel L. & Whelan JS Bulaşıcı hastalıkların tedavisinde tropikal amerikan bitkileri . Diyet takviyeleri dergisi 5 , 349–372 (2008). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Cordell GA Sürdürülebilir ilaçlar ve küresel sağlık hizmetleri . Planta medica 77 , 1129–1138 (2011). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Li G. vd. Nüfus perspektifinden HIV genomu genom varyasyonunun entegre bir haritası . Retroviroloji 12 (2015). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Peterson K., Jallow S., Rowland-Jones SL ve de Silva HIV-2 enfeksiyonu için TI Antiretroviral tedavi: kaynakların düşük olduğu ortamlarda yönetim için öneriler . AIDS araştırması ve tedavisi 2011 (2011). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Bush S. & Tebit D. HIV-1 O grubu kökeni, gelişimi, patogenezi ve tedavisi: 25 yıl sonra bir aykırı değerin karmaşıklığının çözülmesi . AIDS incelemeleri 17 , 147–158 (2014). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Megens S. & Laethem KV HIV-1 genetik varyasyon ve ilaç direnci gelişimi . Anti-Enfektif Terapinin Uzman İncelemesi 11 (2013). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Depatureaux A. vd. İntegraz inhibitörlerine karşı HIV-1 grup O direnci . Edinilmiş immün yetmezlik sendromları dergisi 70 , 9–15 (2015). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Wolf MC vd. Zarflı virüslerin girişini hedefleyen geniş spektrumlu bir antiviral . Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri 107 , 3157–3162 (2010). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Haqqani AA & Tilton JC Entry inhibitörleri ve HIV-1 enfeksiyonunun tedavisinde kullanımları . Antiviral araştırma 98 , 158–170 (2013). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Nyakatura EK, Frei JC & Lai JR Ebola Virüsü giriş inhibitörlerinin kimyasal ve yapısal yönleri . ACS bulaşıcı hastalıklar 1 , 42–52 (2014). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Spillmann D. Heparan sülfat: Viral saldırganlar için çapa? Biochimie 83 , 811–817 (2001). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Salvador B. vd. Filovirüsler, hedef hücrelere bağlanmaları için glikozaminoglikanlar kullanır . Journal of virology 87 , 3295–3304 (2013). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Schulze A., Gripon P. & Urban S. Hepatit B virüsü enfeksiyonu, heparan sülfat proteoglikanlara geniş yüzeyli protein bağımlı bağlanma ile başlar . Hepatology 46 , 1759-1768 (2007). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Barth H. vd. Hepatit C virüsü zarf glikoproteini E2'nin hücresel bağlanması, hücre yüzeyi heparan sülfat gerektirir . Biyolojik Kimya Dergisi 278 , 41003–41012 (2003). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Colpitts CC & Schang LM Küçük bir molekül, heparan sülfat veya siyalik asit içeren glikanlara viryon bağlanmasını engeller . Journal of virology 88 , 7806–7817 (2014). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Wilen CB, Tilton JC & Doms RW Viral Moleküler Makinelerde 223–242 HIV girişinin moleküler mekanizmaları (Springer, 2012). [ Google Scholar ]
• Yuan S. vd. HIV-1 gp120 ile indüklenen ağrının patogenezinde bir Wnt5a sinyal yolu . Pain 156 , 1311–1319 (2015). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Alexander L. vd. İnsan immün yetmezlik virüsü bağlanma inhibitörleri tarafından zarf aracılı CD4 + -T hücresi tükenmesinin inhibisyonu . Antimikrobiyal ajanlar ve kemoterapi 53 , 4726–4732 (2009). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Kaul M. & Lipton SA HIV-1 enfeksiyonu ve AIDS ile ilişkili nöroimmünite ve nörodejenerasyon mekanizmaları . Journal of Neuroimmune Pharmacology 1 , 138-151 (2006). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Mocchetti I., Bachis A. & Avdoshina V. İnsan immün yetmezlik virüsünün nörotoksisitesi-1: viral proteinler ve aksonal taşıma . Nörotoksisite araştırması 21 , 79–89 (2012). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Zhou N. vd. Ön ilaç BMS-663068'in aktif maddesi olan HIV-1 bağlanma inhibitörü BMS-626529'a duyarlılığın genotipik korelasyonları . Antimikrobiyal Kemoterapi Dergisi 69 , 573-581 (2014). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Baeten J. & Celum C. HIV enfeksiyonunun önlenmesi için sistemik ve topikal ilaçlar: antiretroviral maruziyet öncesi profilaksi . Tıbbın yıllık incelemesi 64 , 219–232 (2013). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Harvey AL, Edrada-Ebel R. & Quinn RJ Genomik çağda ilaç keşfi için doğal ürünlerin yeniden ortaya çıkışı . Nature Reviews Drug Discovery 14 , 111–129 (2015). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Newman DJ & Cragg GM Natural ürünleri, 1981'den 2010'a kadar 30 yıl boyunca yeni ilaçların kaynağı olarak . Doğal ürünler dergisi 75 , 311–335 (2012). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Martinez J., Sasse F., Brönstrup M., Diez J. & Meyerhans A. Antiviral ilaç keşfi: doğadan geniş spektrumlu ilaçlar . Doğal ürün raporları 32 , 29–48 (2015). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Peden K., Emerman M. & Montagnier L. HIV-1 LAI, HIV-1 MAL ve HIV-1 ELI'nin enfeksiyöz moleküler klonlarından türetilen virüslerin doku kültüründe geçiş üzerindeki büyüme özelliklerinde değişiklikler . Virology 185 , 661–672 (1991). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Serbest EO, Englund G. & Martin MA Makrofaj enfeksiyonunda insan immün yetmezlik virüsü tip 1 matrisinin temel alanının rolü . Journal of virology 69 , 3949–3954 (1995). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Gürtler LG vd. Kamerun'dan insan immün yetmezlik virüsü tip 1'in (MVP-5180) yeni bir alt tipi . Journal of virology 68 , 1581–1585 (1994). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Gaudin R. vd. Birincil insan makrofajlarında HIV yaşam döngüsünde kinesin KIF3A'nın kritik rolü . Hücre biyolojisi Dergisi 199 , 467-479 (2012). [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Wachinger M. vd. Antimikrobiyal peptitler melittin ve sekropin, viral gen ekspresyonunu baskılayarak insan immün yetmezlik virüsü 1'in replikasyonunu inhibe eder . Journal of General Virology 79 , 731–740 (1998). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Fuss IJ, Kanof ME, Smith PD & Zola H. Periferik kan ve kordon kanından tam mononükleer hücrelerin izolasyonu . İmmünolojide güncel protokoller . 7.1.1–7.1.8 (2009). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Livak KJ & Schmittgen TD Gerçek zamanlı kantitatif PCR ve 2 − ΔΔCT yöntemi kullanılarak göreceli gen ekspresyon verilerinin analizi . Yöntemler 25 , 402–408 (2001). [ PubMed ] [ Google Akademik ]
• Mosmann T. Hücresel büyüme ve hayatta kalma için hızlı kolorimetrik test: proliferasyon ve sitotoksisite analizlerine uygulama . Journal of immunological methods 65 , 55–63 (1983). [ PubMed ] [ Google Akademik ]

[maturidi]

Türk Cistusu Üzerinde Antimikrobiyal Araştırmalar . Türler

Ayşegül Güvenç
,
Sulhiye Yıldız
,
Ayşe Mine Özkan
,
Ceyda Sibel Erdurak
,
Maksut Coşkun
,
Gülderen Yılmaz
,Hepsini Göster ↓
Sayfalar 178-183 | Kabul edildi 15 Ekim 2004, Çevrimiçi yayınlandı: 07 Ekim 2008

• https://doi.org/10.1080/13880200590919537

ÖZ

Cistus cinsi . Esas olarak Akdeniz bölgesinde yetişen L., Türkiye'de beş tür ile temsil edilmektedir: C. creticus . L., C. laurifolius . L., C. monspeliensis . L., C. parviflorus . Lam. ve C. salviifolius . L. Bu çalışmada, in vitro . Kurutulmuş ve toz haline getirilmiş yapraklardan ve beş Cistus'un meyvelerinden hazırlanan su, metanol, kloroform, etil asetat ve bütanol özlerinin antimikrobiyal aktivitesi . türleri, aşağıdaki mikroorganizmalara karşı disk difüzyon yöntemiyle araştırılmıştır: Staphylococcus aureus . (ATCC 29213 ve ATCC 25923), Streptococcus faecalis. (ATCC 29212), Bacillus subtilis . (ATCC 6633), Bacillus cereus . (RSKK 1122), Pseudomonas aeruginosa . (ATCC 27853), Escherichia coli . (ATCC 25922) ve Candida albicans . (ATCC 10231). Kloroform, etil asetat, butanol ve metanol özütünün fraksiyonlanmasından elde edilen kalan sulu özütler de test edildi. Tüm ekstraktlar B. subtilis'e karşı bir miktar aktivite gösterdi . ve B. cereus .. Liyofilize ekstreler, Staphylococcus aureus'a karşı en yüksek aktiviteyi göstermiştir . 25923 ve 29213. C. creticus'un yaprak ve meyvelerinin bütanol özleri . en yüksek aktiviteyi göstermiştir. Hepsinin özleriCistus . türleri Pseudomonas aeruginosa'ya karşı herhangi bir aktivite göstermemiştir . ve Candida albicans ..

Anahtar Kelimeler:
Antimikrobiyal etkinlikCistaceaelavanta
Önceki makaleSorunun içindekiler tablosunu görüntüleyinSonraki makale Tanıtım

Cistus cinsi . (Cistaceae), Akdeniz bölgesinde doğal olarak yetişen, dünyada 20 tür (Zohary, 1987 ) ve beş tür ( C. creticus . L., C .. laurifolius .L. , C. monspeliensis .L ) ile temsil edilmektedir . , C. parviflorus . Lam. ve C. salviifolius . L.) Türkiye'de (Davis 1965 1988 )). Bu bitkiler çalılardır ve esas olarak çiçeklerinin rengine göre tanımlanırlar. Çiçeklenme, nadiren soliter olan basit veya bileşik bir şimdir; kaliks, 3-5 sepals, pembe veya beyaz taçyapraklar, çok sayıda ve hepsi verimli organlardan oluşur; 5–10 karpels, ortadan 5-10 valfe ayrılan kapsül, tohum dakikası (Davis, 1965 ).

Cinsin farklı türleri üzerinde yürütülen kimyasal araştırmalar, bileşenlerinin esas olarak terpenoidlerden (genellikle labdan tipi) (Tabacik ve Bard, 1971 ; Calabuig ve diğerleri, 1981 ; Demetzos ve diğerleri, 1990 1994a ), polifenollerden (flavonoidler) oluştuğunu ortaya çıkardı. ve proantosinaninler) (Demetzos ve diğerleri, 1989 ; Petereit, 1991 ; Danne ve diğerleri, 1993a b 1994 ; Vogt ve Gülz, 1994 ; Qa'dan ve diğerleri, 2003 ), uçucu yağlar (% 0.02-0.08) (Guenther , 1952 ; Hegnauer, 1964 ; Guy & Vernin, 1996 ; Demetzos ve diğerleri, 1999 1997; Angelopoulou ve diğerleri, 2002 ), reçine (Demetzos ve diğerleri, 1994b 1999 ), sakız (Mrabet ve diğerleri, 1997 ) ve lipidler (tohumlardan) (Krollmann & Guelz, 1983 ).

Bazı Cistus'lardan elde edilen özler . türlerinin antiülser (Yeşilada ve diğerleri, 1997 , 1999 ), yara iyileştirici, antimikrobiyal (Chinou ve diğerleri, 1994 ; Demetzos ve diğerleri, 1997 1999 ; Kalpoutzakis ve diğerleri, 2001 ), vazodilatatör (Somoza ve diğerleri , diğerleri, 1996 ), antispazmodik ve sitotoksik aktivite (Chinou ve diğerleri, 1994 ; Demetzos ve diğerleri, 1994; Dimas ve diğerleri, 1998 ; Angelopoulou ve diğerleri, 2001) ve ayrıca kan dolaşımının düzenleyicileri olarak tarif edilmiştir. ve merkezi sinir sistemi üzerinde depresan ve analjezik etkileri olduğu bildirilmiştir (de Andres ve ark., 1999 ).). Alkolde çözünen mutlak maddeler parfüm ve kozmetik endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Guenther, 1952 ; Baytop, 1999 ).

Cistus . türleri Türkiye'de geleneksel olarak çeşitli amaçlarla kullanılmaktadır. Örneğin, Artvin'de kadınlarda kısırlığı tedavi etmek için köklerin kaynatılması kullanılmaktadır (Tabata ve diğerleri, 1988 ). C. laurifolius çiçeklerinin ve tomurcuklarının kaynatılması . Afyon ilinde antiülser olarak kullanılmaktadır (Yeşilada ve ark., 1999 ); C.laurifolius . Eğirdir'de (Isparta) romatizma için kullanılır (Erol ve Tuzlacı, 1996 ); aynı türün meyveleri de antidiyabetik olarak kullanılmaktadır (Baytop, 1999 ); C .. salviifolius'un yapraklarından hazırlanan çay . kanser tedavisinde kullanılmaktadır.

Bir literatür araştırması, Cistus'un antimikrobiyal aktivitesi hakkında bazı çalışmaları ortaya koymaktadır . Türler. C. creticus'tan “ladanum” adı verilen bir oleoresin elde edilir . Girit ve Kıbrıs'ta, ancak Türkiye'de değil, C. creticus . yüksek uçucu yağa sahiptir. Başka bir çalışmada, C. incanus . subsp. kretik . (L.) Heywood otu antibakteriyel aktivitesi açısından araştırılmıştır (Chinou ve diğerleri, 1994 ). Daha önceki çalışmalarla karşılaştırma yapmak için Türkiye'de yetişen türlerin yaprak ve meyvelerinin antimikrobiyal aktivitelerini inceledik. Malzemeler ve yöntemler

Bitki materyali

Cistus'un yaprakları . Bu çalışmada kullanılan türler Türkiye'nin Ege, Akdeniz ve İç Anadolu bölgelerinden çiçeklenme dönemlerinde toplanmıştır. Kupon örnekleri Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Herbaryumu'nda (AEF) saklanır. Araştırma materyalinin toplanma yerleri Tablo 1'de listelenmiştir . Tablo 1. İncelenen Cistus'un lokasyonları . Türler.

CSVEkran Tablosu
çıkarma

Bitki materyalleri (yapraklar ve meyveler) oda sıcaklığında kurutuldu ve ardından toz haline getirildi. Toz halindeki malzemeler (20 g), bir cam şişede 250 ml damıtılmış su ile yaklaşık 8 saat (yaklaşık 700 rpm/dk ve 50°C) çalkalanarak ekstre edildi. Ekstraktlar süzüldü ve daha sonra donduruldu ve liyofilize edildi (ekstrakt 1). Toz haline getirilmiş malzemeler (20 g), bir Soxhlet cihazında 8 saat boyunca 250 ml MeOH (Merck 1.06008-ekstra saf) ile özümlendi. Daha sonra, süzülmüş özler, bir döner buharlaştırıcı (ekstrakt 2) kullanılarak 40°C'de kuruyana kadar buharlaştırıldı. Aynı işlem fraksiyonlamadan önce de uygulandı. _{Kalıntılar 200} ml'lik bir H2 karışımı içinde çözüldü.O: MeOH (90:10), daha sonra bir ayırma hunisinde üç kısım kloroform (Merck 1.02431-ekstra saf) (3 x 20 mi) ile özümlendi. Kloroform tabakası toplandı ve 40°C'de buharlaştırıldı (ekstrakt 3). Daha sonra aynı ekstraksiyon prosedürü etil asetat (Merck 1.00864-ekstra saf) (ekstreler 40°C'de buharlaştırıldı) ve n. - butanol (Merck Art. 988) (ekstrakt 60°C'de buharlaştırıldı) kullanılarak H içinde kalan katmana uygulandı. ₂ O: Sırasıyla MeOH karışımı (özetler 4 ve 5). Geri kalan sulu solüsyon liyofilize edildi (ekstrakt 6). Tüm ekstraktlar (ekstreler 1-6) mikrobiyolojik testler için kullanıldı. aktivite çalışmaları

Tüm mikroorganizmalar Türkiye Refik Saydam Ulusal Tip Kültür Koleksiyonundan elde edildi. Numunelerin antimikrobiyal aktiviteleri disk difüzyon tekniği kullanılarak belirlendi (Shadomy & Pfaller, 1991 ; National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1998 ). Bakteriler için Mueller-Hinton agar (Difco, Detroit, MI, ABD) plakaları ve glikoz (%1) ile takviye edilmiş maya nitrojen bazı (YNB) (Difco, Becton, Dickinson and Co., Spaks, MD, ABD) kullanıldı ve Candida albicans için asparajin (%0.15) agar plakları kullanıldı . Disklerin hazırlanması

1/9 w/v konsantrasyonlarda ekstraktların solüsyonu steril distile su ve ekstraksiyon için kullanılan solventler ile hazırlanmış ve bu porsiyonlardan 0.02 ml steril kağıt disklere emdirilmiştir. Faaliyetlerini test etmek için solventler de uygulanır. Daha sonra tüm diskler bir gece kurumaya bırakıldı. Standart olarak sefazolin, siprofloksasin ve flukonazol kullanıldı (bkz. Tablo 8). Mikrobiyolojik çalışmalar için kullanılan mikroorganizmaların taze kültürlerinden seçilen koloniler (4–5) triptik soya suyuna (Oxoid) alındı ve 2-4 saat 35°C'de inkübe edildi. 0,5 McFarland bulanıklığına sahip et suyu kültürleri, steril pamuklu çubuklarla agar plakalarının yüzeyine aşılandı. 10 dakika sonra, tüm diskler aşılanmış agar plakalarının yüzeyine dağıtıldı. Petri kapları bakteriler için 35°C'de 16-18 saat ve C. albicans için 24 saat 35°C'de inkübe edildi . ve inhibisyon bölgeleri ölçüldü. Sonuçlar

Beş Cistus'tan elde edilen farklı ekstraktların antimikrobiyal aktivite sonuçları . türler ve standart antibiyotikler Tablo 2-8'de listelenmiştir . Tablo 2. Cistus'un sulu ekstraktlarının (ekstrakt 1) antimikrobiyal aktivite sonuçları . türler (mm cinsinden inhibisyon bölgeleri).

CSVEkran Tablosu Tablo 3. Cistus'un metanol ekstraktlarının (ekstrakt 2) antimikrobiyal aktivite sonuçları . türler (mm cinsinden inhibisyon bölgeleri).

CSVEkran Tablosu Tablo 4. Cistus'un kloroform ekstraktlarının (ekstrakt 3) antimikrobiyal aktivitesinin sonuçları . türler (mm cinsinden inhibisyon bölgeleri).

CSVEkran Tablosu Tablo 5 .. Cistus'un etil asetat ekstraktlarının (ekstrakt 4) antimikrobiyal aktivitesinin sonuçları . türler (mm cinsinden inhibisyon bölgeleri).

CSVEkran Tablosu Tablo 6. Cistus'un n. - butanol ekstraktlarının (ekstrakt 5) antimikrobiyal aktivitesinin sonuçları . türler (mm cinsinden inhibisyon bölgeleri).

CSVEkran Tablosu Tablo 7 .. Cistus'un kalan sulu ekstraktlarının (ekstrakt 6) antimikrobiyal aktivitesinin sonuçları . türler (mm cinsinden inhibisyon bölgeleri).

CSVEkran Tablosu Tablo 8 .. Standart antibiyotiklerin inhibisyon bölgeleri (mm olarak inhibisyon bölgeleri).

CSVEkran Tablosu
Tartışma

Bu çalışmada, beş Cistus'un yaprak ve meyvelerinden altı farklı ekstrakt hazırlanmıştır . Türler. Tüm ekstraktlar S. aureus'a karşı aktivite gösterdi . 29213. Sadece bütanol ekstraktları E. coli'ye karşı aktivite gösterdi. Metanol, kloroform, etil asetat ve kalan sulu ekstraktlar S. faecalis'e karşı herhangi bir aktivite göstermese de, C. creticus'un yaprak ve meyvelerinin bütanol ekstraktları , C. laurifolius'un bütanol özleri . ve C .. salviifolius . ve C. creticus'un yapraklarının sulu ekstreleri . bu mikroorganizmaya karşı düşük aktivite göstermiştir. Ekstraktların tümü karşı bir miktar aktivite göstermiştir.B. subtilis . ve B .. cereus .. C. parviflorus'un meyve özleri . B. subtilis'e karşı bütanol ekstraktı dışında bu iki mikroorganizmaya karşı etkili değildi .. Ayrıca, C. salviifolius'un meyve ekstraktları . metanol ekstraktları dışında bu iki mikroorganizmaya karşı etkili olmamıştır. Özellikle tüm türlerin yapraklarının kloroform ve etil asetat ekstraktlarının B. subtilis'e karşı aktif olduğu bulundu . ve B. cereus .. Tüm Cistus özleri . türleri C. albicans'a karşı etkili bulunmamıştır ... Polar çözücülerde (su ve bütanol) çözünen bileşikler, polar olmayan çözücülerden daha etkilidir. Cistus'un çoğunun infüzyonları veya kaynaşmaları . türler Türkiye'de halk hekimliğinde kullanılmaktadır. Ayrıca, bu çalışmanın sonuçları, C. creticus'un yaprak ve meyvelerinin olduğunu göstermiştir . diğer türler arasında en yüksek aktiviteye sahiptir.

Önceki makaleSorunun içindekiler tablosunu görüntüleyinSonraki makale Referanslar

• Angelopoulou D , Demetzos C , Perdetzoglou D ( 2002 ): Cistus monspeliensis'ten uçucu yağ labdanları ve klerodanlarının günlük ve mevsimsel değişimi . L. bırakır . Biochem Syst Ecol 30: 189 – 203 . [CSA] [Google Akademik]
• Baytop T ( 1999 ): Türkiye'de Bitkilerle Tedavi, Geçmişte ve Bugün. İstanbul, Nobel Tip Kitabevleri , s. 284 . [Google Akademik]
• Calabuig MT , Cortes M , Francisco CG , Hernandez R , Suarez E ( 1981 ): Cistus symphytifolius'tan Labdane diterpenler . . Fitokimya 20: 2255 – 2258 . [ÇAPRAZ] [Crossref] , [Web of Science ®], [Google Akademik]
• Chinou I , Demetzos C , Harvala C , Roussakis C , Verbist JF ( 1994 ): Cistus incanus'un hava kısımlarından sitotoksik ve antibakteriyel labdan tipi diterpenler . subsp. kretik . . Planta Med 60: 34 – 36 . [PUBMED] , [BİLGİ] , [CSA] [Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®], [Google Akademik]
• Danne A , Petereit F , Hahrstedt A ( 1993a ): Cistus incanus kaynaklı proantosiyanidinler . . Fitokimya 34: 1129 – 1133 . [ÇAPRAZ] [Google Akademik]
• Danne A , Petereit F , Hahrstedt A ( 1993b ): Cistus incanus kaynaklı prodelphinidinler ve dihidroflavonol glukozitler . . Planta Med 59 (Ek): 606 . [Google Akademik]
• Danne A , Petereit F , Hahrstedt A ( 1994 ): Cistus salvifolius'tan Flavan-3-ols, prodelphinidins ve ileri polifenoller . . Fitokimya 37: 533 – 538 . [PUBMED] , [BİLGİ] , [CROSSREF] , [CSA] [Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®], [Google Akademik]
• Davis PH ( 1965 ): Türkiye ve Doğu Ege Adaları Florası, Cilt. 1. Edinburgh University Press , s. 506 – 508 . [Google Akademik]
• Davis PH ( 1988 ): Flora of Turkey and the East Ege Islands, Cilt. 10. Edinburgh University Press , s. 61 – 62 . [Google Akademik]
• De Andres AI , Gomez-Serranillos MP , Iglesias I , Villar AM ( 1999 ): Cistus populifolius özütünün etkileri . L. merkezi sinir sistemi üzerinde . Phytother Res 13: 575 – 579 . [PUBMED] , [BİLGİ] , [CROSSREF] , [CSA] [Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®], [Google Akademik]
• Demetzos C , Mitaku S , Hotellier F , Harvala A ( 1989 ): Heterosides polyphenoliques des feuilles de Cistus creticus . L. _ Ann Pharm Françaises 47: 314 – 318 . [CSA] [Google Akademik]
• Demetzos C , Harvala C , Philianos SM ( 1990 ): Cistus incanus'un yapraklarından yeni bir labdan tipi diterpen ve diğer bileşikler . subsp. kretik . . J Nat Prod 53: 1365 – 1368 . [Crossref] , [Web of Science ®], [Google Akademik]
• Demetzos C , Mitaku S , Couladis M , Harvala C , Kokkinopoulos D ( 1994a ): ent .-13- epi .-manoil oksitin doğal metabolitleri ve diğer sitotoksik diterpenler Cistus creticus'un "Ladano" reçinesini oluşturur . . Planta Med 60: 590 – 591 . [Google Akademik]
• Demetzos C , Mitaku S , Skaltsounis AL , Harvala M , Libot F ( 1994b ): Malonik asidin diterpen esterleri, Cistus creticus'un “ladano” reçinesini oluşturur . . Fitokimya 354: 979 – 981 . [Google Akademik]
• Demetzos C , Katerinopoulos H , Kouvarakis A , Stratigakis N , Loukis A , Ekonomakis C , Spiliotis V , Tsaknis J ( 1997 ): Cistus creticus'un uçucu yağının bileşimi ve antimikrobiyal aktivitesi . subsp. eriosefali . . Planta Med 63: 477 – 479 . [PUBMED] , [BİLGİ] , [CSA] [Google Akademik]
• Demetzos C , Berthamarie S , Anastassaki T , Gazouli M , Tzouvelekis LS , Rallis M ( 1999 ): Resin Ladano'nun, uçucu yağının ve izole edilmiş bileşiklerin kimyasal analizi ve antimikrobiyal aktivitesi . Planta Med 65: 76 – 78 . [PUBMED] , [BİLGİ] , [CSA] [Crossref] , [PubMed] , [Web of Science ®], [Google Akademik]
• Dimas K , Demetzos C , Marsellos M , Sotiriadou R , Malamas M , Kokkinopoulos D ( 1998 ): Labdan tipi diterpenlerin insan lösemik hücre hatlarına karşı in vitro sitotoksik aktivitesi . . Planta Med 64: 208 – 211 . [PUBMED] , [BİLGİ] , [CSA] [Google Akademik]
• Erol MK , Tuzlacı E ( 1996 ): Eğirdir (Isparta) yöresinde geleneksel halk ilacı olarak kullanılan bitkiler . İçinde: XI. Bitkisel Kaynaklı Ham İlaçlar Sempozyumu Bildiriler Kitabı, Ankra Üniversitesi Bas , Ankara, 22–24 Mayıs, s. 466 – 475 . [Google Akademik]
• Günther E ( 1952 ): The Essential Oils, Cilt. 6. New York: D. van Nostrand Company Inc. , s. 45 – 52 . [Google Akademik]
• Guy I , Vernin G ( 1996 ): Cistus ladaniferus'tan minör bileşikler . Esterelden L. uçucu yağ. 2. Asitler ve fenoller . J Essent Oil Res 8: 455 – 462 . [CSA] [Taylor ve Francis Çevrimiçi], [Google Akademik]
• Hegnauer R ( 1964 ). Kemotaksonomi der pflanzen. Grup 3. Bassel & Stutgart, Birkhauser Verlag, s. 429 – 431 . [Google Akademik]
• Kalpoutzakis E , Aligiannis N , Mitaku S , Chinou I , Charuala C , Skattsounis AL ( 2001 ): Antimikrobiyal aktiviteye sahip yeni yarı sentetik manoil oksit türevleri . Chem Eczacı Boğa 49: 814 – 817 . [PUBMED] , [BİLGİ] , [CROSSREF] , [CSA] [Çapraz referans], [Google Akademik]
• Krollmann P , Guelz PG ( 1983 ): Cistus cinsinin türlerinden tohum lipidlerinin bileşimi . L. (Cistaceae) . Z Pflanzenfizyol 110: 469 – 474 . [CSA] [Google Akademik]
• Mrabet N , Zrira S , Ismaili- Alaoui MM , Lahlou H , Benjilali B ( 1997 ): Faslı Cistus ladaniferus'tan uçucu yağlar ve reçine sakızı . L. _ Riv. İtalyan. Bölüm 8: 621 – 631 . [CSA] [Google Akademik]
• Ulusal Klinik Laboratuvar Standartları Komitesi ( 1998 ): Belge M2-A6. Antimikrobiyal Disk Duyarlılık Testleri için Performans Standartları. 6. baskı. Onaylı Standart. Villanova, PA, Cilt. 18, No. 1. [Google Akademik]
• Petereit F , Kolodziej H , Hahrstedt A ( 1991 ): Cistus incanus kaynaklı Flavan-3-ols ve proantosiyanidinler . . Fitokimya 30: 981 – 985 . [ÇAPRAZ] [Crossref] , [Web of Science ®], [Google Akademik]
• Qa'dan F , Peterit F , Nahrstedt A ( 2003 ): Prodelphinidin trimerleri ve Cistus albidus'tan bir proantosiyanidin oligomerinin karakterizasyonu . . Eczane 58: 416 – 419 . [PUBMED] , [BİLGİ] [Google Akademik]
• Shadomy S , Pfaller MA ( 1991 ). Antifungal ajanlarla laboratuvar çalışmaları: Vücut sıvılarında duyarlılık testleri ve kantitasyon . İçinde: Balows A. , ed. Klinik Mikrobiyoloji El Kitabı, 5. baskı. Washington, DC, Amerikan Mikrobiyoloji Derneği . [Google Akademik]
• Somoza B , Sanchez de Rojas VR , Ortega T , Villar AM ( 1996 ): Cistus populifolius yapraklarının ekstraktının vazodilatör etkileri . sıçan torasik aort üzerinde . Phytother Res 10: 304 – 308 . [ÇAPRAZ] [Google Akademik]
• Tabacik C , Bard M ( 1971 ): Etude chimio-taxonomique dans le tür Cistus . . Fitokimya 10: 3093 – 3109 . [ÇAPRAZ] [Crossref] , [Web of Science ®], [Google Akademik]
• Tabata M , Honda G , Sezik E ( 1988 ): Türkiye'de Geleneksel Tıp ve Tıbbi Bitkiler Üzerine Bir Rapor (1986). Kyoto Üniversitesi, Farmasötik Bilimler Fakültesi, s. 30 . [Google Akademik]
• Tabata M , Honda G , Sezik E , Yeşilada E ( 1993 ): Türkiye'de Geleneksel Tıp ve Tıbbi Bitkiler Üzerine Bir Rapor (1990–1991). Kyoto Üniversitesi, Farmasötik Bilimler Fakültesi, s. 239 . [Google Akademik]
• Vogt T , Gülz PG ( 1994 ): Cistus laurifolius'ta yaprak gelişimi sırasında flavonoidlerin birikmesi . . Fitokimya 36: 591 – 597 . [ÇAPRAZ] [Crossref] , [Web of Science ®], [Google Akademik]
• Yeşilada E , Gürbüz I , Ergun E ( 1997 ): Cistus laurifolius'un etkileri . L. mide ve duodenum lezyonlarında çiçekler . J Ethnopharmacol 55: 201 – 211 . [CROSSREF] , [CSA] [Google Akademik]
• Yeşilada E , Gürbüz I , Shibata H ( 1999 ): Türk anti-ülserojenik halk ilaçlarının anti- Helicobacter pylori için taranması . aktivite . J Ethnopharmacol 66: 289 – 293 . [CROSSREF] , [CSA] [Google Akademik]
• Zohary M ( 1987 ): Flora Palaestina, Cilt. 2. Kudüs, Kudüs Academic Press , s. 336 – 337 . [Google Akademik]

[nguven]

[mert]

[mert]

[mert]