LADEN Forte, Atopik Egzama, Alerjik Egzama, Gastrit, Ülser, Reflü

[igokcek]

Cistus incanus’un Bazı Biyoaktif Moleküllerinin SARS CoV-2 ye Karşı Moleküler Doking Analizi

Sakine Kübra ÇELİK1 , Elvan ÜSTÜN2 *

Öz
Koronavirüs hastalığı, halen yaşanmakta olan pandemik süreçle bütün dünyayı etkilemektedir. Hastalık ile mücadele tüm dünyada, aşılama çalışmaları ile devam etmektedir. Koruyuculuk süresi ve aşıya ulaşmadaki zorluklar düşünüldüğünde, hastalık ile mücadelede başarılı olunabilmesi için, virüsün öldürülmesi ya da replikayonunun engellenmesini sağlayan ilaçlara ihtiyaç vardır. İlaç çalışmalarında fitokimyasalların virüs üzerine etkisinin incelenmesinin ardından, daha etkili moleküllerin sentezlenebilmesi için izole moleküllerin modifiye edilmesi yöntemi uygulanır. İzole edilen her bir molekülün anti-viral aktivitesinin in-vitro yöntemlerle analizi mümkün değildir ve bu sorunun üstesinden gelmek için insilico yöntemler yardımcı olabilir. Cistus incanus daha önce pek çok virüsün denemeleri yapılarak anti-viral aktivitesi teyit edilmiş bir bitkidir. Bu çalışmada içerik analizi sonrasında Cistus incanus’da tespit edilen myricetin 3-O-hexoside, myricitrin, quercitrin ve kaempferol 3-O-rutinocide moleküllerinin papain-like protease and main protease ile etkileşimi moleküler doking yöntemleri ile analiz edilmiştir. Analizlerin sonucunda incelenen moleküller ile papain-like protease ve main protease arasında güçlü H-bağları tespit edilmiştir.

Anahtar Kelimeler: COVID-19, Papain-Like Proteaz, Cistus incanus, Moleküler Doking

1. Giriş
Bitkilerdeki biyoaktif bileşikler uzun süredir viral hastalıklara karşı kullanılmaktadır. Bazı bu fitokimyasalların antioksidan, anti-alerjik ve anti-inflamatuar özellikleri vardır (Bhushan etal., 2020) ve ayrıca reseptörlerin ve enzimlerin fonksiyonlarını modüle eder (Carbonell-Capella ve diğerleri, 2015). Bitki özleri, tıbbi amaçlı peptitlerin/proteinlerin hazırlanması için kullanılabilir. (Adhikari ve diğerleri, 2020). Akdeniz halkı Cistus türlerini cilt hastalıklarının tedavisinde kullanır, sindirim sorunları (Papaefthimiou ve diğerleri, 2014) ve ayrıca anti-inflamatuar olarak (Attaguile ve diğerleri, 2000). Cistus incanus sulu çözeltileri rutin, gallik asit gibi önemli biyoaktif bileşikleri içerir. flavonoid (kersetin, kaempferol, glikozit), kateşin, epikateşin, gallokatekin (Dimcheva ve Karşeva, 2017). Cistus incanus ekstraktlarının antibakteriyel ve antifungal aktivite (Simeray ve diğerleri, 1982; Chinou ve diğerleri, 1994; Bouamama ve diğerleri, 1999; Hannig ve diğerleri, 2008; Barrajón-Catalán ve diğerleri, 2010; Barros ve diğerleri, 2013; Wittpahl ve diğerleri, 2015 ve anti-kanser (Chinou ve diğerleri, 1994; Dimas ve diğerleri, 1998; Dimas ve diğerleri, 2006; Hatziantoniou ve diğerleri, 2006; BarrajónCatalán ve diğerleri, 2010; Skoric ve diğerleri, 2012), ayrıca DNA bölünmesine karşı koruyucu etkiler hücre kültüründe (Attaguile ve diğerleri, 2000). Bu nedenle farelerde anti-influenza virüs aktiviteleri (Droebner ve ark., 2007; Ehrhardt ve diğerleri, 2007; Kalusa ve diğerleri, 2009) ve HIV ve Filovirüslere karşı antiviral aktivite (Rebensburg ve ark., 2016) Cistus incanus'un doğrulandı.



Şekil 1. Cistus incanus ve Gori ve ark. tarafından kodlanmış dört aktif biyo-yapı.

(https://covid19.who.int/). Koronavirüs hastalığı Ağır Akut Solunum Sendromuna neden olduğundan (SARS), bu yeni virüs Şiddetli Akut Solunum Sendromu Coronavirüs-2 olarak tanımlandı. (SARS-CoV-2) (Peiris ve diğerleri, 2004; Furukawa ve diğerleri, 2020). Coronavirüse yakalandığı belirlendi iki proteaz, ana proteaz ve papain benzeri proteaz (Gao) tarafından işlenen yapısal olmayan bir proteindir. et al., 2021; Freitas ve diğerleri, 2020). Papain benzeri proteaz (PLP) ve ana proteaz (Mpro) virüsün replikasyonu ve transkripsiyonu ve (Capasso ve diğerleri, 2021; Shin ve diğerleri, 2020). İnsanlığın koronavirüsle mücadelesi aşılama ile devam ediyor. Toplam 6.495.672.032 13 Ekim 2021 tarihi itibariyle aşı dozları uygulanmıştır (https://covid19.who.int/). Yine de,
çalışmalar, herhangi bir gecikme olmaksızın yeni ilaç moleküllerinin saptanmasına odaklanmalıdır. Virüsü kodlayarak elde edilen SARSCoV-2 aşıları, koronavirüs tedavisi için uygun olmayacak aşıların etkinlik süresinin sınırlı olması ve aşı ile ilgili sorunlar nedeniyle gelecekte hastalık virüs mutasyonları (Lipsitch ve Dean, 2020; Chen ve diğerleri, 2021). İlaç çalışmaları, doğal ürünlerin aktivitesinin analiz edilmesiyle başlar (Behl ve ark., 2021). Daha sonra,
izole edilmiş aktif moleküller organik yöntemlerle değiştirilir ve daha etkili moleküller sentezlenir (Adhikari ve diğerleri, 2020). Para, emek ve zaman fırsatları düşünülürse, Her aktif molekülün ve modifiye edilmiş aktif maddenin çeşitli biyoaktivitelerini incelemek mümkün değildir. moleküller. Ek olarak, vücutta daha aktif moleküller hakkında öngörü sahibi olmak çok önemlidir. yaşadığımız pandemi süreci. Moleküler yerleştirme en yaygın kullanılan yöntemdir yapı bazlı ilaçların aktivitesini analiz etmek için (Contreras-Puentes ve Alvíz-Amador, 2020; Wua ve al., 2020; Shawky ve diğerleri, 2020). bağlanma bölgeleri hakkında önemli bilgiler elde edilmesini sağlar. ligandlı hedef moleküller. COVID-19 ile mücadelede, bazı moleküllerin analizi Bilinen faaliyetler öncelikle değerlendirilmiştir. Kandeel ve Al-Nazawi (2020) birçok analiz yaptı. FDA tarafından SARS-CoV-2'de PLP ile onaylanan moleküller. Ayrıca, anti-covid etkinliği
Moleküler yerleştirme çalışmaları ile yeni sentezlenen birçok molekülün (Liang ve diğerleri, 2021). Ayrıca, birçok çalışma fitokimyasalların çeşitli alanlardaki etkilerini incelemiştir. koronavirüse karşı bitkiler (Ali ve Kunugi, 2021; Antonio ve diğerleri, 2021; Alfaro, 2020; Gori, 2016). Glu167, Tyr171, Met208 ve Tyr268 ile H-bağ etkileşimleri moleküler yöntemlerle belirlendi. olea europaea, cichorium intybus ve marrubium vulgare'de yerleştirme yöntemleri en yüksek yerleştirme puanları (Kandeel ve Al-Nazawi, 2020). Ayrıca, cynara scolymus'un H-bağları Asn156, Gly163, Ser170 ile belirlendi (Kandeel ve Al-Nazawi, 2020; Osipiuk ve ark., 2021). Cistus incanus'un fraksiyonel analizi Gori ve ark. (2016) HPLC-DADMS/MS yöntemiyle. Bitkideki en yüksek aktif bileşenler, flavanol türevi mirisetin 3-Oheksoside, mirisitrin, kersitrin ve kaempferol 3-O-rutinosid idi. Myricetin 3-O-heksosit ve mirisitrin, cistus alt cinsinin üyeleridir. Parçalanmada mirisetin 3-O-heksozid m/z 479'da 24.5 dakikada gelirken, m/z 463'te mirisitrin 25.6 dakikada tespit edildi. m/z 447'deki aktif bileşen ve kaempferol 3-O-rutinoside m/z 593'tedir (Gori ve diğerleri, 2016). İlaç araştırmalarında viral proteinlerin protein-ligand bağlama özelliklerinin incelenmesi önemlidir. proteinler. Bu çalışmada, kersitinin papain benzeri proteaz ve ana proteaz inhibisyon aktivitesi, elde edilebilen mirisitrin, mirisetin-3-O-heksozit ve kaempferol-3-O-rutinosid molekülleri Cistus incanus'tan moleküler yerleştirme yöntemi ile araştırıldı. Bizim bildiğimiz kadarıyla, mirisetin-3-O-heksozit molekülünün COVID-19 hastalığına karşı aktivitesi araştırılmamıştır.

2. Malzemeler ve Yöntemler
Cistus incanus bitkisinin içerik analizi Gori ve ark. HPLC-DAD-MS / Ham etanolik yaprak ekstraktından elde edilen bileşenlerin detaylı analizi için MS kullanıldı. bu tepe uzunluğuna göre en yaygın bileşenler 3-O-heksozid, mirisitrin, quercitrin ve kaempferol 3-O-rutinocide (Gori ve diğerleri, 2016). Papain benzeri proteaz inhibisyon kapasitesi Bu aktif moleküllerin sayısı in-siliko olarak belirlenmiştir. Aktif moleküllerin 3 boyutlu yapıları Ulusal Tıp Kütüphanesinden (Ulusal Biyoteknoloji Merkezi) indirilmiştir. Bilgi; https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Papain benzeri proteaların kristal yapısı PDB Kimliği: 6w9c ve PDB Kimliği: 6lu7 olan ana proteaz, Protein Veri Bankasından alınmıştır. (https://www.rcsb.org/ ) (Osipiuk ve diğerleri, 2021; Jin ve diğerleri, 2020; Trott ve Olson, 2010). Suçlu moleküller kristalden çıkarıldı ve sadece polar hidrojenler eklendi. protein hedefi molekül pdbqt olarak kaydedildi ve AutoDockTools'a aktarıldı. Kollman Ücretleri ve Lamarkian Hesaplamalarda Genetik Algoritmalar kullanıldı. BIOVIA Discovery Studio Görselleştiricisi şu amaçlarla kullanıldı:
molekülleri ve bağlanma etkileşimlerini görselleştirin (https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer ) (Holt ve diğerleri, 2008; Li ve diğerleri, 2021).

3. Bulgular ve Tartışma
PLP, konakçı doğuştan gelen bağışıklıkta ve viral replikasyonda etkili olan bir proteolitik enzimdir. bir koronavirüs inhibitörü olarak hedef molekül olarak kullanılabilir (Su ve diğerleri, 2021; Reddy ve diğerleri, 2021; Banerjee et al., 2020). PLP inhibitörü olarak FDA onaylı bir ilaç yoktur. Maiti (2020), PLP'nin
SARS-CoV-2'den kodlanmış olan, kararsız bölge gibi aktif sitelere sahip olan Cys189, Cys192, Cys224 ve Cys226 ve katalitik bölge Cys111, His272 ve Asp286 amino asitlerinden oluşur. ve bu sitelerin viral replikasyonda temel işlevleri vardır (Banerjee ve diğerleri, 2020). Bu bölgeler olabilir aday moleküller için önemli bir bölge olarak kabul edilir. engellendiği şeklinde yorumlanmıştır. kükürt bazlı moleküller tarafından katalitik bölgedeki Cys amino asidi, PLP'nin işlev bozukluğunu sağlayabilir ve viral replikasyonu durdurabilir. 6w9c kodlu PLP kristal yapısı Nisan 2020'de piyasaya sürüldü (Osipiuk et al., 2021). Bu kristal yapı ile yapılan moleküler yerleştirme çalışmalarında bölge ile olan etkileşimler en çok Leu162, Val202, Met206 ve Met208 gibi amino asitlerin oluşturduğu kaydedildi. Ancak Ser170 ve Asn156 gibi polar amino asitlerle etkileşimleri de dikkat çekicidir. (Saakre ve diğerleri, 2021; Banerjee ve diğerleri, 2021).

Tablo 1. SARS CoV-2 papain benzeri proteazın (PDB ID:6w9c) quercitrin ile aktif bölge analizi, mirisitrin, mirisetin-3-O-heksozit ve kaempferol 3-O-rutinosit (kırmızı: H-bağ, yeşil: pi-pi T-şekilli etkileşimler, mavi: Van der Waals etkileşimleri, pembe: pi-alkil, turuncu: pi-katyon))



Bu çalışma için birçok H-bağları tanımlanmıştır. Asp76, Glu167, Thr74, Cys155 ile H-bağları, ve kaempferol 3-O-rutinoside için Tyr171 amino asitleri, aşağıdakilerin bağlanma enerjisiyle kaydedildi -4.83 kcal/mol. Ayrıca birçok Van der Waals etkileşiminin de katkısı beklenmektedir ve Kaempferol 3-Orutinoside için hesaplanan bağlanma enerjisine His175 ile Pi-pi T şeklinde etkileşim. Bildiğimiz kadarıyla, mirisetin-3-O-heksosidin COVID19'a karşı aktivitesi daha önce hiç çalışılmamıştır. Mirisetin-3-O-heksositin bağlanma enerjisi, nispeten düşük, Asp76, Arg82, Ala153, Asn156, Gln174, Tyr171 ve His175 ile H-bağları birçok Van der Waals etkileşiminin yanı sıra dikkate değer. Myrisitrin, yaklaşık olarak -3.46 kcal/mol bağlanma afinitesi ile hedef molekülün aynı bölgesi. mirisitrin H-bağları vardı Asp76, Arg82, Asn156 ve Tyr171 ile kaydedildi. Kuersitrinin neredeyse ile etkileşimleri benzer amino asitler Tablo 1 ve Şekil 2'de incelenebilir. -3,91 kcal/mol olarak hesaplanmıştır.



Şekil 2. Kuersitrin, mirisitrin, mirisetin-3-O-heksosit Etkileşim Kalıntıları ve türleri ve Papain-benzeri Proteaz ile kaempferol 3-O-rutinosit

Küresel pandemi ile mücadelede anahtar enzim olan COVID-19 ana proteazının viral transkripsiyon ve replikasyona aracılık etmede önemli bir rol oynar. için de çekici bir hedef olduğu için SARS CoV-2 araştırmalarında, potansiyel inhibisyon için birçok bitki kaynaklı kimyasal analiz edildi. bu enzime karşı Şerif et al. kurkumin türevlerini değerlendirdi ve iyi etkileşimler kaydetti (Şerif ve diğerleri, 2021). Chebaibi et al. flavonoidlerin ve polifenollerin önleyici etkisini de değerlendirin narenciye limon ve sarımsak ve ellagik asit ve narirutin gibi bazı fitokimyasalları SARS CoV-2 inhibitörü (Chebaibi ve diğerleri, 2021). Diğer birçok fitokimyasal da ana için analiz edildi. Sisakht ve diğerleri tarafından proteaz inhibisyon aktiviteleri (Sisakht ve diğerleri, 2021). Chhetri et al. sentezlenmiş ve yeni azo imidazol türevlerini karakterize etti ve bunların COVID19 ana proteazına karşı inhibitör aktivitelerini araştırdı (Chhetri ve diğerleri, 2021). Co(II), Ni(II) ve Cu(II) deoksikolat kompleksleri ayrıca Refat ve diğerleri tarafından moleküler yerleştirme yöntemleri ile analiz edilmiştir. ve yüksek bağlanma afiniteleri kaydedildi bu, olası anti-viral aktivite için bir sinyal olabilir (Refat ve diğerleri, 2021). Bu araştırmada incelenen tüm aktif moleküller, ana bölgenin neredeyse aynı bölgesiyle etkileşime girdi. proteaz kristali. Göreceli olarak daha yüksek bağlanma afiniteleri, PLP'ninkinden hesaplanmıştır. kersitrin
-5.50 kcal/mol olarak en iyi bağlanma afinitesine sahiptir ve kaempferol 3-O-rutinosid, myricetin-3-O-hexoside, ve mirisitrin sırasıyla -3.95 kcal/mol, -4.79 kcal/mol ve -5.34 kcal/mol bağlanma enerjilerine sahiptir. Quercitrin, Lys5, Trp207, Leu282 ve Glu288 ile dört H bağına sahipken, mirisitrin Gln127 ile etkileşime girer, H-bağları için Lys137, Gly138 ve Asp289. Diğer tüm etkileşim türleri ve detayları Tablo1'de incelenebilir. ve Şekil 3.



Şekil 3. Kuersitrin, mirisitrin, mirisetin-3-O-heksositin Etkileşim Kalıntıları ve türleri ve Ana Proteaz ile kaempferol 3-O-rutinosit

4. Sonuçlar ve Öneriler
Fitokimyasallar çeşitli hastalıkların tedavisinde sıklıkla kullanılmaktadır. Eczacılığa ait şirketler genellikle fitokimyasalların aktivite analizinden elde edilen sonuçları ticari Ürünler. Aktiviteleri sıklıkla doğrulanan fitokimyasallar, daha fazlasına dönüştürülür. Sentetik yöntemlerle aktif formlar. Birçok aktivitesi araştırılan bitkilerden biri Cistus incanus. Bu bitkinin hem çiçeğinin hem de yapraklarının antibakteriyel ve anti-viral aktivitesi birkaç çalışma ile doğrulanmıştır. Farklı aktif formların antiviral aktivitesi Bu bitkinin yaprağından elde edilen fitokimyasallar iyi bilinmektedir. Bu çalışmada, aktivite mirisitin 3-O-heksozit, mirisitrin, kuersitrin ve kaempferol 3-O-rutinosit molekülleri, Cistus incanus'ta en sık etken olarak belirlenen, SARS CoV-2'ye karşı araştırıldı. İçin
Bu amaçla, moleküllerin papain benzeri proteaz ve ana proteaza karşı inhibisyon aktiviteleri moleküler docking yöntemiyle analiz edildi. Her ne kadar molekülerin bağlanma afinitesi sonuçları yerleştirme kabul edilebilir, tespit edilen H-bağları umut verici. Gelecekteki çalışmalar için tavsiyede bulunabilir
Bu yapıların farklı formlarının analizi.

Referanslar

Adhikari, B., Marasini, B. P., Rayamajhee, B., Bhattarai, B. J., Lamichhane, G., Khadayat, K., Adhikari, A., Khanal, S., and Parajuli,N. (2020). Potential roles of medicinal plants for the treatment of viral diseases focusing on COVID-19: A review. Phytotherapy Research, 35, 1298–1312. Alfaro, M., Alfaro, I., & Angel, C. (2020). Identification of potential inhibitors of SARS-CoV-2 papain-like proteasefrom tropane alkaloids from Schizanthus porrigens: A moleculardocking study. Chemical Physics Letters, 761, 138068.Tallei, T. E., Tumilaar, S. G., Niode, N. J., Fatimawali, Kepel, B. J., Idroes, R., Effendi, Y., Sakib, S. A., Emran, T. B. (2020). Potential of plant bioactive compounds as SARSCoV-2 main protease (Mpro) and spike (S) glycoprotein inhibitors: A molecular docking study". Scientifica, Article ID 6307457. Ali, A. M., and Kunugi, H. (2021). Propolis, bee honey, and their components protect against coronavirus disease 2019 (COVID-19): A Review of in silico, in vitro, and clinical studies”, Molecules, 26, 1232. Antonio, A. S., Wiedemann, L. S. M., and Veiga-Junior, V. F. (2020). Natural products' role against COVID19. RSC Advances, 10, 23379. Attaguile, G., Russo, A., Campisi, A., Savoca, F., Acquaviva, R., Ragusa, N, and Vanella, A. (2000). Antioxidant activity and protective effect on DNA cleavage of extracts from Cistus incanus L. and Cistus monspeliensis L. Cell Biology and Toxicology, 16, 83 - 90. Banerjee, A., Santra, D., & Maiti,S. (2020). Energetics and IC50 based epitope screening in SARS CoV-2 (COVID 19) spike protein by immune informatic analysis implicating for a suitable vaccine development. Journal of Translational Medicine, 18, 281. Banerjee, R., Perera, L., and Tillekeratne, L. M. V. (2021). Potential SARS-CoV-2 main protease inhibitors. Drug Discovery Today, 26(3). Barrajón-Catalán, E., Fernández-Arroyo, S., Saura, D., Guillén, E., Fernández- Gutiérrez, A., SeguraCarretero, A. (2010). Cistaceae aqueous extracts containing ellagitannins show antioxidant and antimicrobial capacity, and cyto- toxic activity against human cancer cells. Food Chemistry and Toxicology, 48. 2273–2282. doi: 10.1016/j.fct.2010.05.060. Barros, L., Dueñas, M., Alves, C. T., Silva, S., Henriques, M., Santos-Buelga, C. (2013). Antifungal activity and detailed chemical characterization of Cistus ladanifer phenolic extracts. Industrial Crops and Products, 41. 41–45. doi: 10.1016/j.indcrop.2012.03.038. Behl, T., Rocchetti, G., Chadha, S., Zengin, G., Bungau, S., Kumar, A., Mehta, V., Uddin, S., Khullar, G., Setia, D., Arora, S., Sinan, K. I., Ak, G., Putnik, P., Gallo,M., and Montesano, D. (2021). Phytochemicals from plant foods as potential source ofantiviral agents: an overview. Pharmaceuticals, 14, 381. Bhushan, I., Sharmaa, M., Mehtaa, M., Badyala, S., Sharmab, V., Sharmab, I., Singha, S., Sistlac, H. (2020). Bioactive compounds and probiotics-a ray of hope in COVID-19 management. Food Science and Human Wellness, 10, 131-140. Bouamama, H., Villard, J., Benharref, A., and Jana, M. (1999). Antibacterial and antifungal activities of Cistusincanus and C. monspeliensis leaf extracts. Thérapie 54, 731–733. Capasso, C., Nocentini, A., & Supuran, C. T. (2021) Protease inhibitors targeting the main protease and papainlike protease of coronaviruses. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 31(4), 309-324 Carbonell-Capella, J. M., Buniowska, M., Esteve, M.J. (2015). Effect of Stevia rebaudiana addition on bioaccessibility of bioactive compounds and antioxidant activity of beverages based on exotic fruits mixed with oat following simulated human digestion. Food Chemistry, 184, 122-130. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.03.095. Chebaibi, M., Bousta, D., Gonçalves, R. F. B., Hoummani, H., & Achour, S. (2021). Medicinal Plants Against Coronavirus (SARS-COV-2) in Morocco Via Computational Virtual Screening Approach, Research Square, DOI: https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-679827/v1 Chen, j., Gao, K., Wang, R., and Wei, G. W. (2021). Prediction and mitigation of mutation threats to COVID19 vaccines and antibody therapies. Chemical Science, DOI: 10.1039/D1SC01203G (Edge Article) Chhetri, A., Chettri, S., Rai, P., Mishra, D. K., Sinha, B., & Brahman, D. (2021). Synthesis, characterization and computational study on potential inhibitory action of novel azo imidazole derivatives against COVID-19 main protease (Mpro: 6LU7). Journal of molecular structure, 1225, 129230. Chinou, F., Demefzos, C., Harvala, C., Roussakis, C., and Verbist, J. F. (1994). Cytotoxic and antibacterial labdane-type diterpenes from the aerial parts of Cistus incanus subsp. Creticus. Planta Medica, 60 (1), 34–36. Contreras-Puentes, N., and Alvíz-Amador, A. (2020). Virtual screening of natural metabolites and antiviral drugswith potential inhibitory activity against 3CL-PRO and PL-PRO. Biomedical and Pharmacology Journal, 13(2), 933-941. Dimas, K., Demetzos, C., Marsellos, M., Sotiriadou, R., Malamas, M., and Kokkinopoulos, D. (1998). Cytotoxic activity of labdane type diterpenes against human leukemic cell lines in vitro. Planta Medica, 64. 208–211. doi:10.1055/s- 2006-957410 Dimas, K., Papadaki, M., Tsimplouli, C., Hatziantoniou, S., Alevizopoulos, K., Pantazis, P. (2006). Labd-14- ene-8,13-diol (sclareol) induces cell cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells and enhances the activity of anti-cancer drugs. Biomedicine & Pharmacotherapy,60. 127–133. doi: 10.1016/j.biopha.2006.01.003 Dimcheva, V., and Karsheva, M. (2017). Antioxidant activity and polyphenolic content of the bulgarian wild herb Cistus incanus L. stored under different conditions. Journal of Chemical Technology and Metallurgy, 52 (5). 781-790. Droebner, K., Ehrhardt, C., Poetter, A., Ludwig, S., and Planz, O. (2007). CYSTUS052, a polyphenol-rich plant extract, exerts anti-influenza virus activity in mice. Antiviral Research, 76. 1–10. doi:10.1016/j.antiviral.2007.04.001 Ehrhardt, C., Hrincius, E. R., Korte, V., Mazur, I., Droebner, K., Poetter, A. (2007). A polyphenol rich plant extract, CYSTUS052, exerts anti influenza virus activity in cell culture without toxic side effects or the tendency to induce viral resistance. Antiviral Research, 76. 38–47. doi:10.1016/j.antiviral.2007.05.002 Freitas, B. T., Durie, I. A., Murray, J., Longo, J. E., Miller, H. C., Crich, D., Hogan,R. J., Tripp, R. A., and Pegan, S. D. (2020). Characterization and noncovalent inhibition of the deubiquitinase and deisgylase activity of sars-cov-2 papain-like protease. ACS Infectious Diseases, 6(8), 2099–2109. Furukawa, N. W., Brooks, J. T., and Sobel, J. (2020). Evidence supporting transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 while presymptomatic or asymptomatic. Emerging Infectious Diseases Journal, 26(7), e201595. Gao, X., Qin, B., Chen, P., Zhu, K., Hou, P., Wojdyla, J. A., Wang, M., and Cui, S. (2021). Crystal structure of SARS-CoV-2 papain-like protease. Acta Pharmaceutica Sinica B, 11(1), 237-245. Gori, A., Ferrini, F., Marzano, M. C., Tattini, M., Centritto, M., Baratto, M. C., Pogni R., and Brunetti, C. (2016). Characterisation and antioxidant activity of crude extract and polyphenolic rich fractions from C. incanus leaves. International Journal of Moleculer Science, 17, 1344. Hannig, C., Spitzmüller, B., Al-Ahmand, A., Hannig, M. (2008). Effects of Cistus-tea on bacterial colonization and enzyme activities of the in-situ pellicle. Journal of Dentistry, 36. 540–545. Hatziantoniou, S., Dimas, K., Georgopoulos, A., Sotiriadou, N., and Demetzos, C. (2006). Cytotoxic and antitumor activity of liposome-incorporated sclareol against cancer cell lines and human colon cancer xenografts. Pharmacoogical Research, 53. 80–87. doi:10.1016/j.phrs.2005.09.008 Holt, P. A., Chaire, J. B., and Trent, J. O. (2008). Molecular docking of intercalators and groove-binders to nucleic acids using autodock and surflex. Journal of Chemical Information and Modeling, 48(8), 1602– 1615. Jin, Z., Du, X., Xu, Y., Deng, Y., Liu, M., Zhao, Y., Zhang, B., Li, X., Zhang, L., Peng, C., Duan, Y., Yu, J., Wang, L., Yang, K., Liu, F., Jiang, R., yang, X., You, T., Liu, X., Yang, X., Bai, F., Liu, H., Liu, X., Guddat, L. W., Xu, W., Xiao, G., Qin, C., Shi, Z., Jiang, H., Rao, Z., Yang, H. & Yang, H. (2020). Structure of M pro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature, 582(7811), 289-293. Kalusa,U., Grigorova, A., Kadeckib, O., Jansenc, J. P., Kiesewettera, H., Radtkea, H. (2009). Cistus incanus (CYSTUS052) for treating patients with infection of the upper respiratory tract a prospective, randomized, placebo-controlled clinical study. Antiviral Research, 84. 267–271. Kandeel, M., and Al-Nazawi, M. (2020). Virtual screening and repurposing of FDA approved drugs against COVID-19 main protease. Life Sciences Volume, 251, 117627. Li, D., Luan, J., and Zhang, L. (2021). Molecular docking of potential SARS-CoV-2 papain-like proteaseinhibitors. Biochemical and Biophysical Research Communications, 538, 72-79. Liang, C., Hui, N., Liu,Y., Qiao, G., Li, J., Tian, L., Ju, X., Jia, M., Liu, H., Cao, W., Yu, P., Li, H., & Ren, X. (2021). Insights into forsythia honeysuckle (Lianhuaqingwen) capsules: A Chinese herbal medicine repurposed for COVID-19 pandemic. Phytomedicine Plus, 1, 100027. Lipsitch, M., and Dean, N. E. (2020). Understanding COVID-19 vaccine efficacy. Science, 370, 6518, 763- 765. Maiti, B. K. (2020). Can papain-like protease inhibitors halt SARS-CoV-2 replication?. ACS Pharmacology & Translational Science, 3(5), 1017-1019. Osipiuk, J., Jedrzejczak, R., Tesar, C., Endres, M., Stols, L., Babnigg, G., Kim, Y., Michalska, K., Joachimiak, A. The crystal structure of papain-like protease of SARS CoV-2. Center for Structural Genomics of Infectious Diseases (CSGID), To be published. Papaefthimiou, D., Papanikolaou, A., Falara, V., Givanoudi, S., Kostas, S., and Kanellis, A. K. (2014) . Genus Cistus: a model for exploring labdane type diterpenes’ biosynthesis and a natural source of high value products with biological, aromatic, and pharmacological properties. Frontiers in Chemistry, 2(35). doi: 10.3389/fchem.2014.00035 Peiris, J. S. M., Guan, Y., and Yuen, K. Y. (2004). Severe acute respiratory syndrome. Nature Medicine, 10, 88–97. Rebensburg, S., Helfer, M., Schneider, M., Koppensteiner, H., Eberle, J., Schindler, M., ... & Brack-Werner, R. (2016). Potent in vitro antiviral activity of Cistus incanus extract against HIV and Filoviruses targets viral envelope proteins. Scientific Reports, 6(1), 1-15. Reddy. M. P., Makhal, P., and Rao, K. V. (2021). Potential herbal drugs and phytochemicals to minimize the risk of COVID-19: A review. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 10(1), 670-675. Refat, M. S., Bakare, S. B., Altalhi, T. A., Alam, K., & Al-Hazmi, G. H. (2021). Synthesis and spectroscopic interpretations of Co (II), Ni (II) and Cu (II) decxycholate complexes with molecular docking of COVId19 protease. Polish Journal of Chemical Technology, 23(2), 54-59. Saakre, M., Mathew D., and Ravisankar, V. (2021). Perspectives on plant flavonoid quercetin-based drugs for novel SARS-CoV-2. Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences. Shawky, E., Nada, A. A., and Ibrahim, R. S. (2020). Potential role of medicinal plants and their constituents in the mitigation of SARS-CoV-2: identifying related therapeutic targets using network pharmacology and molecular docking analyses. RSC Advances, 10, 27961. Sherif, Y. E., Sayed, A. H., & Lotfy, M. (2021). Antiviral Effect of Curcuminoids and Curcumin Derivatives Against Coronavirus (Sars-Cov-2) Predicted Using Molecular Docking Approach. Egyptian Academic Journal of Biological Sciences. C, Physiology and Molecular Biology, 13(2), 47-62. Shin, D., Mukherjee, R., Grewe, D., Bojkova, D., Baek, K., Bhattacharya,A., Schulz, L., Widera, M., Mehdipour, A. R., Tascher, G., Geurink, P. P., Wilhelm, A., Noort, G. J. H., Ovaa, H., Müller, S., Knobeloch, K. P., Rajalingam, K., Schulman,B. A., Cinatl, J., Hummer, G., Ciesek, S. & Dikic, I. (2020). Papain-like protease regulates SARS-CoV-2 viral spread and innate immunity, Nature volume, 587, 657–662. Simeray, J., Chaumont, J. P., Bevalot, F. & Vaquette, I. (1982). Les propietes antifongiques des Cistae¨es et plus particulie¨rement de Cistus Laurifolius L.: role des tanins non hydrolysables. Fitoterapia, 53(43). 8. Sisakht, M., Mahmoodzadeh, A., & Darabian, M. (2021). Plant‐derived chemicals as potential inhibitors of SARS‐CoV‐2 main protease (6LU7), a virtual screening study. Phytotherapy Research, 35(6), 3262- 3274. Skori´c, M., Todorovi´c, S., Gligorijevi´c, N., Jankovi´c, R., Živkovi´c, S., Risti´c, M. (2012). Cytotoxic activity of ethanol extracts of in vitro grown Cistus creticus subsp. creticus L. on human cancer cell lines. Industrial and Crops Products. 38. 153–159. doi: 10.1016/j.indcrop.2012.01.017 Su, W., Chen, P., Yang, Z., Zhong, N., Ma, Q., Zeng, X., Zhang, J., Wang, Y., & Li, P. (2021). Network pharmacology integrated molecular docking reveals the potential of hypericum japonicum thunb. ex murray against COVID-19. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 35(1), 453–461.Trott, O., and Olson, A. J. (2010). AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. Journal of Computational Chemistry, 31(2), 455-461. Wittpahl, G., Kölling-Speer, I., Basche, S., Herrmann, E., Hannig, M., Speer, K., & Hannig, C. (2015). The polyphenolic composition of Cistus incanus herbal tea and its antibacterial and anti-adherent activity against Streptococcus mutans. Planta Medica, 81(18), 1727-1735. Wua, C., Liu, Y., Yang, Y., Zhang, P., Zhong, W., Wang, Y., Wang, Q., Xu,Y., Li,Xingzhou Li, M., Zheng, M., Chen, L., & Li, H. (2020). Analysis of therapeutic targets for SARS-CoV-2 and discovery of potential drugs by computational methods. Acta Pharmaceutica Sinica B, 10(5), 766-788.

[igokcek]

Cistus laurifolius L. Yaprak Ekstraktlarının Respiratuvar Sinsityal Virus (RSV)’una Karşı Antiviral Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Özet

Doğal kaynaklardan yeni ve etkili antiviral etkenler bulmak amacıyla yapılan bu çalışmada, Cistus laurifolius L. yapraklarından elde edilen metanol ve su ekstraktlarının antiviral özellikleri Respiratuvar sinsityal virus (RSV)’una karşı kolorimetrik XTT testi ile değerlendirilmiştir. Virusun neden olduğu sitopatik etkilere karşı %50 koruma sağlaması için gerekli konsantrasyon EC50 olarak tanımlanmış, CC50 (%50 Sitotoksik Konsantrasyon)’nin EC50’ye oranından da seçicilik indeksi (SI) belirlenmiştir. Araştırma sonucunda; Cistus laurifolius metanol ekstraktının (EC50 = 0.504 µg/ml; SI = 188.91) RSV’ye karşı pozitif kontrol olarak kullanılan ribavirin (EC50 = 4.19 µg/ml, SI = 27.92)’den daha kuvvetli anti-RSV aktiviteye sahip olduğu, su ekstaktının ise antiviral aktiviteye sahip olmadığı tespit edilmiştir. Bu çalışma, Cistus laurifolius’un anti-RSV aktivitesinin değerlendirilmesine yönelik ilk rapordur.

Anahtar Kelimeler: Cistus laurifolius, methanol ve su ekstraktlarıs, antiviral aktivitr, respiratuvar sinsityal virus

1. Giriş
Respiratuvar sinsityal virus (RSV)’u bebeklerde, küçük çocuklarda ve erişkinlerde alt solunum yolu enfeksiyonlarının en önemli sebebidir (Falsey ve Walsh, 2000). RSV, bir yaşından küçük bebeklerde solunum sisteminin en önemli viral patojenidir (Collins ve Crowe, 2007; Collins ve Graham, 2008). RSV enfeksiyonu ve reenfeksiyonuna yaşamın ilk birkaç yılı sırasında daha sık rastlanmaktadır. Bu nedenle, 24 aya kadar enfekte olan tüm çocukların yarısı iki enfeksiyonu da görüp geçirmiştir. Etkili terapötik yöntemlere son derece ihtiyaç duyulmaktadır. Ancak, RSV’ye bağlı ağır alt solunum yolu enfeksiyonunun üstesinden gelebilmek için sadece destekleyici tedavi uygulanmaktadır (Collins ve Crowe, 2007). Ribavirin (RBV), inosin monofosfat (IMP) dehidrojenazın inhibitörü olan bir guanozin analoğudur. RBV, viral transkripsiyondaki erken olayları interfere etmekte ve ribonükleoprotein sentezini inhibe etmektedir (Wray ve ark., 1985). Deneysel olarak enfekte edilen hayvanlarda etkili olmakla birlikte, RBV’nin RSV tedavisinde az etkili olduğu gösterilmiştir (Collins ve Crowe, 2007; Empey ve ark., 2010; Welliver, 2010). Palivizumab (Synagis) RSV enfeksiyonunun önlenmesinde etkilidir. Bununla birlikte, palivizumab çok pahalıdır ve mevcut enfeksiyonun tedavisinde etkili değildir (Collins ve Crowe, 2007). Bu nedenle, etkili kemoterapötik ajanlara hala ivedilikle ihtiyaç duyulmaktadır. Cistaceae familyası, sekiz cins ve yaklaşık 180 tür ile, başta Batı Akdeniz Bölgesi olmak üzere, Kuzey Yarımküre’nin ılıman ve suptropikal bölgelerinde yayılış göstermektedir (Coode, 1965; Coode, 1988; Muñoz ve Navarro, 1993; Arrington ve Kubitzki, 2003; Agueda ve ark., 2006). Bu familyanın önemli cinslerinden birisi olan Cistus L., The plant list’ e göre Dünya’da 58 türle temsil edilirken, Türkiye’de doğal olarak yetişen beş türle temsil edilmektedir (Coode, 1965; Coode, 1988). Cistus türleri Türkiye’de halk arasında laden, laden otu, pamukla, pamukluk gibi yöresel isimlerle anılmakta ve halk arasında diyare, peptik ülser, yüksek ateş, kısırlık tedavisinde, çeşitli deri rahatsızlıklarında, romatizmal hastalıklarda, idrar yolu enfeksiyonlarında, anti-spazmodik, hemostatik, antidiyabetik ve antienflamatuvar olarak kullanılmaktadır (Yeşilada ve ark., 1997; Baytop, 1999; Polat ve Satıl, 2012; Sargın ve ark., 2013; Sargın ve ark., 2014; Sargın ve ark., 2015). Cistus türleri üzerinde yapılan farmakolojik çalışmalar, bitkinin çeşitli ekstraktlarının içerdikleri madde gruplarına bağlı olarak, antibakteriyel, antifungal, anti-enflamatuvar, antiülser, antiviral, antioksidan, sitotoksik, yara iyileştirici, vazodilatör, antispazmodik, hipotansif aktiviteye, kan dolaşımını düzenleyici ve analjezik etkilere sahip olduğunu göstermiştir (Attaguile ve ark., 2004; Chinou ve ark., 1994; De Andres ve ark., 1999; Demetzos ve ark., 2001; Demetzos ve ark., 1997; Demetzos ve ark., 1994; Demetzos ve ark., 1999; Demetzos ve ark., 1990; Dimas ve ark., 1998; Dimas ve ark., 1999; Güvenç ve ark., 2005; Kalpoutzakis ve ark., 1998; Somoza ve ark., 1996; Yeşilada ve ark., 1997; Yeşilada ve ark., 1999). Cistus türleri diterpenler, diterpen esterleri (De Pascual Teresa ve ark., 1978; De Pascual Teresa ve ark., 1983; De Pascual Teresa ve ark., 1986; Demetzos ve ark., 1994; Demirezer ve ark., 2007; Kalpoutzakis ve ark., 2003), flavan-3-oller (Danne ve ark., 1993; Fernandez-Arroyo ve ark., 2010; Petereit ve ark., 1991), flavonoitler (De Pascual Teresa ve ark., 1974; De Pascual Teresa ve ark., 1979; Vogt ve Gulz, 1988; Vogt ve ark., 1987) ve uçucu yağlar (Angelopoulou ve ark., 2001; Demetzos ve ark., 2002; Ogutveren ve Tetik, 2004; Ramalho ve ark., 1999; Robles ve Garzino, 1998) bakımından zengindir. Ayrıca dammaran tip triterpenleri (De Pascual Teresa ve ark., 1979), lignan glikozitlerini (Sadhu ve ark., 2006) ve floroglusinol glikozitlerini (Danne ve ark., 1994; De Pascual Teresa ve ark., 1986) de içermektedir. Cistus laurifolius’un ise kersetin, kaempferol, apigenin, luteolin ve bunların metil-eterleri (kumarin skopoletin, diterpenoidler, seskiterpenoidler ve şekerler) dahil olmak üzere çeşitli flavonoidler içerdiği bildirilmiştir (Demetzos ve ark., 1989; Vogt ve ark., 1987; Wollenweber ve Mann, 1984). Cistus cinsine ait türler, yukarıdaki literatürlerde de belirtildiği gibi, özellikle flavonoitler ve polifenoller gibi antioksidan özelliklere sahip doğal bileşiklerin zengin bir kaynağıdır (Stępień ve ark., 2018). Ekstraktlarda bulunan antioksidan özelliklere sahip polifenol bileşiklerinin antiviral özelliklere sahip olduğu belirlenmiştir (Chiang ve ark., 2003). Cistus laurifolius’un ise antioksidan özelliklere sahip olduğu karakterize edilmiş ve bu bitkinin yaprak ve küçük dallarından hazırlanan ekstraktlarda 16 biyoaktif belirlenmiştir (Sadhu ve ark., 2006). Cistus incanus spp. tauricus’dan elde edilen ekstraktların hiç bir olumsuz yan etki göstermeksizin bir RNA virusu olan influenza virusuna karşı antiviral aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur (Ehrhardt ve ark., 2007). Dolayısıyla, antioksidan özelliklere sahip bileşikler içeren C. laurifolius’un yine bir RNA virusu olan RSV’ye karşı antiviral aktivite göstermesinin de ihtimal dahilinde olduğu düşünülmüştür. Bu çalışma, RSV’ye karşı yeni ve güvenilir antiviral ajanlar bulmak amacıyla, Türkiye’de doğal olarak yetişen Cistus laurifolius’dan elde edilen kaba ekstraktların RSV’ye karşı antiviral aktivitelerini değerlendirmek amacıyla yapılmıştır.

1.1 Materyal ve Metot
1.1.1 Materyal

Anti-RSV aktivitesi yönünden araştırılan Cistus laurifolius L. örnekleri, 2018 yılının Mayıs-Haziran aylarında, Ankara, Kurtboğazı baraj gölü dolaylarından toplanmış ve Selçuk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü öğretim üyesi Prof. Dr. Hüseyin DURAL tarafından teşhis edilmişlerdir. Cistus laurifolius’un yaprakları gölgede kurutulmuş, bir değirmen aracılığıyla ince toz halinde öğütülmüş ve steril siyah cam kavanozların içerisinde oda sıcaklığında muhafaza edilmişlerdir. Bitkinin kanıt numuneleri S. Ü. Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü Herbaryumu’nda saklanmaktadır. EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium, ATCC-30-2003), FBS (Fetal Bovine Serum, Biological Industries, Cat. No:04-007-1A, Israel), DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, Biological Industries, SKU: 02-020-1A), Antibiyotik‒antimikotik solüsyonu (100× Sigma-A5955), %0.25 Tripsin-EDTA (1×) solüsyonu (Gibco # 25200-072), Trypan blue boyası (Sigma-T6146), RBV (Ribavirin, R9644-10 mg, Sigma, USA), XTT [2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2HTetrazolium-5-Carboxanilide] kiti (Biological Industries Ltd., Kibbutz Beit Haemek, Israel) ticari olarak elde edilmiştir.

1.1.2 Metot
1.1.2.1 Bitki Materyali ve Stok Ekstrakt ve Ribavirin Solüsyonlarının Hazırlanması

Cistus laurifolius yapraklarından metanol ve su ekstraktlarının hazırlanması için, ilk önce kurutulmuş yaprak örnekleri bir değirmen kullanılarak ince toz halinde öğütülmüştür. Toz halindeki her 20 g numune, ayrı ayrı, 200 ml metanol, etanol ve steril distile suyun içerisine konulmuş ve 25-37ºC sıcaklıkta ultrasonikasyon ile 1 saat ekstraksiyon işlemine tabii tutulmuştur. Protokol sırasında örneklerdeki bileşiklerin sıcaklıktan dolayı bozulmasını önlemek amacıyla sıcaklığın 40ºC’nin altında tutulmasına özen gösterilmiştir. Ekstraktlar Whatman No:1 filtre kâğıdından geçirilerek süzülmüş ve daha sonra kullanılan çözücüler rotary evaporatör (Heidolph Laborota 4000)’de 40ºC’nin altında ve düşük basınçta tamamen uçurulmuştur. Uçurma işleminden sonra bitki ekstraktları, içeriğinde kalan son sıvı kalıntılarından kurtulmak amacıyla liyofilizatörde düşük basınç altında –110ºC’de kurutulup konsantre edilmişlerdir. Liyofilize haldeki metanol, etanol ve su ekstraktının her 1000 mg’ı 20 ml EMEM (serumsuz) içinde çözdürülerek 50 mg/ml konsantrasyonunda stok çözeltiler hazırlanmıştır. Stok çözeltiler 0.22 µm’lik milipor filtreden geçirilerek steril edilmiş ve 2 ml’lik tüplere 1’er ml taksim edilerek, kullanılıncaya kadar +4 °C’de saklanmışlardır (Duman, 2016). Sitotoksisite ve antiviral aktivite testlerinde kullanılacak ekstrakt dilüsyonları bu stoklardan hazırlanmıştır. Ribavirin (RBV) stok solüsyonu ise, aşağıda tarif edildiği şekilde hazırlanmıştır: Steril bir deney tüpünün içerisine toz halindeki ribavirinden 5 mg konulduktan sonra, üzerine 5 ml EMEM (serumsuz) eklenmiştir. Elde edilen 1000 µg/ml konsantrasyonundaki süspansiyon 0.2 µm por çapındaki milipor filtreden geçirilerek 10 ml’lik şişeye süzülmüş ve 1 dk süreyle vorteksle karıştırılmıştır. Stok solüsyon deneylerde kullanılıncaya kadar -80°C’da saklanmıştır (+4°C’da saklandığında, 1 hafta içinde kullanılmıştır).

1.1.2.2 Hücre ve Virusun Çoğaltılması

Araştırmada kullanılan HEp-2 hücresi (insan epidermoid larinks karsinom hücre hattı; ATCC-CCL-23) ve insan respiratuvar sinsityal virüsü (human respiratory syncytial virus, HRSV; ATCC-VR-26) American Type Culture Collection (ATCC)’dan satın alınmış ve S. Ü. Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Viroloji Laboratuvarı’nda çoğaltılmışlardır. Hücreler, 10 mL/L antibiyotik-antimikotik karışımı (Sigma-A5955) ve %10 fetal bovine serum (FBS, Biological Industries, Cat. No:04-007-1A, Israel) ilave edilmiş Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM; ATCC-30-2003)’dan oluşan üretme vasatında kültüre edilmiş ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir ortamda 37ºC’de inkübe edilmiştir. RSV kültürü için, ilk olarak doku kültürü flaskına (75 cm2 ’lik flask) ekildikten sonra %70-85 çoğalma düzeyine (konfluensi) ulaşan Hep-2 hücreleri üzerindeki üretme vasatı boşaltılmıştır. Hücreler, 37°C’deki benmaride önceden ısıtılmış steril 5 mL DPBS ile 2 kez yıkanmıştır. Virus suşunu (ATCC VR-26) içeren ampul 37 °C’deki su banyosunda süratle (2‒5 dk) çözülmüştür. Çoğaltılmak istenen stok ampuldeki virustan 75 cm2 ’lik flaska (%70‒85 konflüent hücre içeren), flask içindeki hacim 2.5 mL olacak şekilde ekim yapılarak 37°C’de %5 CO2 içeren ortamda 1 saat inkübe edilmiştir. Bu süre boyunca doku kültürü flaskı 15 dakikada bir hafifçe çalkanarak virusun homojen dağılması sağlanmış ve hücre tabakasının kuruması önlenmiştir. Virus adsorbsiyonu için 1 saat inkübasyon süresinden sonra, flaska 22.5 mL virus üretme vasatı (%2 FBS’li EMEM) konularak adsorbsiyon sona erdirilmişir. Flask, 37°C’deki %5 CO2 içeren inkübatörde 3 gün inkübe edilmiştir. Hücreler her gün sitopatik etki (CPE) oluşumu açısından kontrol edilmiştir. İnkübasyonun 3. gününde %90 CPE görülen doku kültürü flaskı ‒ 80°C’ye kaldırılmıştır. Dondurulmuş doku kültürü flaskı 37°C’de benmaride ısıtılarak çözülmüştür. Dondurma-çözdürme işlemi 3 kez tekrarlanmıştır. Bu şekilde, hassaslaşmış olan hücrelerin parçalanarak virusların hücre dışına çıkması sağlanmıştır. Bunu takiben flask içeriği santrifüj tüpüne aktarılarak 3500 rpm’de +4°C’de 10 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatant alınarak, üzerinde suş adı ve hazırlanma tarihi yazılı ampullere 1’er ml pipetlenerek ‒80 °C’de depolanmıştır.

1.1.2.3 Virus Titrasyonu

Virus infektivitesinin titrasyonu, %50 doku kültürü infeksiyöz doz (DKİD50) metodu ile yapılmıştır. HEp-2 hücreleri kuyucuk başına 2.5 × 104 hücre olacak şekilde 96 kuyucuklu bir pleyte ekilmiş ve 37°C’de %5 CO2 içeren bir inkübatörde 24 saat süresince %10 FBS içeren EMEM (kuyucuk başına 100 µl) ile kültüre edilmişlerdir. Hücreler her kuyucukta neredeyse konfluent olduğunda, vasat aspire edilmiş ve daha sonra idame vasatı (%2 FBS’li EMEM) kullanılarak RSV’nin seri 10 misli dilüsyonları hazırlandıktan sonra her dilüsyondaki virus süspansiyonundan 4’er kuyucuğa 100’er µL konulmuştur. Ayrıca virus kontrol (VK) ve hücre kontrol (HK) için de dörder kuyucuk seçilmiştir. VK için seçilen kuyucuklara 50 μL stok virus, 50 μL %2 FBS’li EMEM, HK için seçilen kuyucuklara da 100 µL hücre idame vasatı konulmuştur. Virüs inokule edilmiş hücre kültürleri ilaveten 3 gün süreyle inkübe edilmiş ve virus CPE’si mikroskop altında her gün gözlenmiştir. DKİD50 değeri, inokule edilmiş kültürlerin %50’sinde sitopatik etki oluşturan virus dozunu yansıtan, Spearmann-Kaerber metodu (Kaerber, 1964) ile hesaplanmıştır.

1.1.2.4 Sitotoksisite Testi

Cistus laurifolius’un yapraklarından elde edilen metanol ve su ekstraktlarının yanısıra RSV için pozitif kontrol olarak kullanılan RBV’nin HEp-2 hücreleri üzerine sitotoksik etkileri, imalatcı firmanın (Biological Industries, Israel) talimatlarına uygun olarak XTT temelli hücre proliferasyon kiti ile ayrı ayrı incelenmiştir. Test, şöyle yapılmıştır: 96 kuyucuklu mikropleytlerin 1. kolonu VK (Vasat Kontrol), 2. kolonu HK olarak kullanılmıştır. VK olarak kullanılan 1. kolondaki 8 adet kuyucuğun her birine 150 µL EMEM (serumsuz) konulmuştur. 3. kolon hariç, geriye kalan 10 kolondaki (yani, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ve 12. kolondaki) kuyucukların her birine 100’er µl EMEM (serumsuz) konulmuştur. Ekstraktların stok solüsyonundan (50 mg/ml) EMEM (serumsuz) kullanarak 750 μg/ml konsantrasyonda 2 ml çalışma solüsyonu hazırlanmıştır. Bunun için, ekstraktların stok solüsyonundan (50 mg/ml) 0.03 ml (=30 μl) alınmış ve üzerlerine 1.97 ml (=1970 μl) EMEM (serumsuz) konulmuştur. 3. kolonda bulunan 8 adet kuyucuğun her birine ekstraktların çalışma solüsyonundan (750 µg/ml) 200 µl konulmuştur. 8 kanallı otomatik bir pipet ile 3. kolondaki kuyucuklardaki çalışma solüsyonundan 100’er µl alınıp 4. kolondaki kuyucuklara 100’er µl taşınmıştır. Daha sonra 4. kolondaki kuyucuklarda yer alan ekstrakt sulandırmalarından 100’er µl alınıp, 5. kolondaki kuyucuklara 100’er µl taşınmıştır. Taşıma işlemleri 12. kolondaki kuyucuklara kadar devam ettirilerek log2 tabanına göre sulandırmalar (750, 375, 187.5, 93.75, 46.875, 23.438, 11.719, 5.859, 2.930, 1.465 µg/ml) hazırlanmıştır.3-12 arasındaki kolonların A, B, C, D, E sıralarındaki kuyucuklara ve HK olarak kullanılan 2. kolondaki 8 kuyucuğa mililitresinde 1 × 105 hücre içeren HEp-2 hücre süspansiyonundan 50’şer µl konulmuştur (kuyucuk başına 5000 hücre). Ekstraktların tetrazolyum tuzlarını canlı hücrelerin yokluğunda da indirgemesinden dolayı, tetrazolium tuzları [XTT, MTT (3-(4,5-dimetiltiyazol- 2-yl)-2,5- difeniltetrazolyum-bromür) gibi] ile yapılan sitotoksisite testlerinin yanlış negatif sonuçlar verdiği, test edilen bileşiklerin (veya ekstraktların) tetrazolyum tuzları ile etkileşime girebileceği belirtilmiştir (Ulukaya ve ark., 2008). Buna ilaveten, serbest tiyol gruplarını içeren farklı antioksidan moleküllerin tetrazolyum tuzlarını indirgeyebildiği bulunmuştur. Ayrıca, polifenoller (resveratrol: şarabın içinde bulunan antioksidan bir madde) ve flavonoidler (kersetin, luteolin, kemferol) gibi bileşikleri içeren çeşitli bitki ekstraktlarının, canlı hücrelerin yokluğunda tetrazolyum tuzlarını (MTT veya XTT’yi) güçlü bir şekilde indirgediği belirtilmiştir (Bruggisser ve ark., 2002; Shoemaker, 2004; Peng ve ark., 2005; Weyermann ve ark., 2005; Talorete ve ark., 2006; Jaszczyszyn ve Gąsiorowski, 2008). Bu nedenlerden dolayı, ekstraktların canlı hücreler üzerine sitotoksik etkilerini değerlendirirken, ekstraktların XTT boyası ile doğrudan kimyasal etkileşimlerinin kontrol edilerek, bu etkileşimlerin ekarte edilmesi gerektiği bildirilmiştir (Jaszczyszyn ve Gąsiorowski 2008). Bildirilen bu uyarıları dikkate alarak, ekstraktların XTT boyası ile etkileşime girip girmediğini değerlendirmek amacıyla, 3- 12 arasındaki kolonların F, G, H sıralarındaki kuyucuklara 50’şer μl EMEM (serumsuz) konulmuştur. Böylece; ekstraktların kuyucuklardaki son konsantrasyonları 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.81, 3.91, 1.95, 0.98 µg/ml olmuştur.

RBV’nin HEp-2 hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin değerlendirilmesinde de, RBV’nin XTT boyası ile etkileşime girip girmediğinin değerlendirilmesi amacıyla pleytlerin bazı kuyucuklarının ayrılmaması dışında, aynı işlemler uygulanmıştır. RBV’nin HEp-2 hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin değerlendirilmesinde özetle aşağıdaki işlemler uygulanmıştır: 96 kuyucuklu mikropleytlerin 1. kolonu VK, 2. kolonu HK olarak kullanılmıştır. VK olarak kullanılan 1. kolondaki 8 adet kuyucuğun her birine 150 µl EMEM (serumsuz) konulmuştur. 3. kolon hariç, geriye kalan 10 kolondaki (yani, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ve 12. kolondaki) kuyucukların her birine 100’er µl EMEM (serumsuz) konulmuştur.RBV’nin stok solüsyonundan (1000 µg/ml) 750 µg/ml konsantrasyonda bir çalışma solüsyonu hazırlanmıştır (toplam 2 ml). Bu amaçla, RBV’nin stok solüsyonundan 1.5 ml alınmış ve üzerine 0.1 ml serumsuz EMEM konulmuştur.Üçüncü kolonda bulunan 8 adet kuyucuğun her birine RBV’nin çalışma solüsyonundan (750 µg/ml) 200 µl konulmuştur. 8 kanallı otomatik bir pipet ile 2. kolondaki kuyucuklardaki stok solüsyonlardan 100’er µl alınıp 3. kolondaki kuyucuklara 100’er µl taşınmıştır. Daha sonra 3. kolondaki kuyucuklarda yer alan RBV sulandırmalarından 100’er µl alınıp, 4. kolondaki kuyucuklara 100’er µl taşınmıştır. Taşıma işlemleri 12. kolondaki kuyucuklara kadar devam ettirilerek log2 tabanına göre sulandırmalar (750.00, 375.00, 187.50, 93.75, 46.88, 23.44, 11.72, 5.86, 2.93, 1.46 µg/ml) hazırlanmıştır. 2-12 arasındaki kolonların kuyucuklarına mililitresinde 1 × 105 hücre içeren HEp-2 hücre süspansiyonundan 50’şer µl konulmuştur (kuyucuk başına 5000 hücre). Böylece, RBV’nin kuyucuklardaki son konsantrasyonları 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.81, 3.91, 1.95, 0.98 µg/ml olmuştur.

Bitki ekstraktlarını ve RBV’yi içeren mikropleytler 3 gün süreyle %5 CO2’li nemli bir inkübatörde 37C’de inkübe edildikten sonra, ticari olarak elde edilen XTT ayıracının 5 ml’si ile yine ticari olarak elde edilen PMS (Fenazin Metosülfat/Elektron Bağlama Ayıracı) içeren aktivasyon solüsyonunun 0.1 ml’sinin karıştırılmasıyla hazırlanan karışımdan her kuyucuğa 50’şer µl konulmuştur. Mikropleytler, boyanın kuyucuklara homojen bir şekilde dağılması için hafifçe çalkalanmıştır. Mikropleytler, XTT formazan ürününün oluşması için 3 saat daha inkübe edilmiştir. OD (Optik Dansisite)’ler, 490 nm bir test dalga boyu ve 630 nm bir referans dalga boyunda bir ELISA okuyucusunda (Multiskan EX, Labsystems) okutularak kuyucuklardan elde edilen OD ortalamaları kaydedilmiştir. Ekstraktların XTT ile doğrudan kimyasal etkileşimlerinin ekarte edilmesi amacıyla, hücre içeren kuyucuklardaki farklı ekstrakt konsantrasyonlarının ortalama OD değerlerinden, hücre içermeyen aynı konsantrasyondaki ekstraktların ortalama OD değerleri çıkarılmıştır. Testler üç kopya olarak yapılmış ve sonuçlar hücre kontrole göre ortalama sitotoksisite % oranı olarak gösterilmiştir. Sitotoksisite % oranını hesaplamak için, A’nın hücre kontrolün OD’sini, B’nin ekstrakt (veya RBV) ile muamele edilmiş hücrelerin OD’sini temsil ettiği aşağıdaki formül kullanılmıştır (Andrighetti-Fröhner ve ark., 2003): Sitotoksisite (%) = (A-B)/(A) ×100

Hesaplanan sitotoksik etki yüzdeleri test edilen ekstraktların (veya RBV’nin) ilgili konsantrasyonlarına karşı grafiğe dönüştürülmüştür. HK’ler ile karşılaştırıldığında ekstraktlar (veya RBV) ile muamele edilmiş hücrelerin OD’sini %50’ye kadar azaltan konsantrasyon olarak tanımlanan CC50 (%50 Sitotoksik Konsantrasyon) değerleri, elde edilen verilerin ışığında GraphPad Prism Version 5.03 istatistik programı yardımıyla non-linear regresyon analizi uygulanarak belirlenmiştir (Ho, 2008). HK’lerin OD’leri ile karşılaştırılarak ekstraktların (veya RBV’nin) MNTK (maksimum non-toksik konsantrasyon)’leri belirlenmiştir. Belirlenen bu MNTK’ler ekstraktların ve RBV’nin antiviral aktivitesinin saptanmasında kullanılmıştır.

1.1.2.5 Antiviral Test

Ekstraktların ve RBV’nin HEp-2 hücrelerine karşı belirlenen MNTK’lerinden başlangıç alan 2 misli sulandırmaları anti-RSV aktiviteleri yönünden Ho ve ark.’nın (2010) bildirdikleri “Cytopathic Effect (CPE) Reduction” testinin kolorimetrik XTT metoduna uyarlanması ile, 100 misli %50 doku kültürü infektif doz (DKID50) içeren RSV süspansiyonuna karşı kontrol edilmiştir.

1.1.2.5.1 RBV’nin Anti-RSV Aktivitesinin Belirlenmesi

RBV’nin HEp‒2 hücrelerine karşı belirlenen MNTK’sinden (0.98 µg/ml) başlangıç alan 2 misli sulandırmaları anti-RSV aktiviteleri yönünden Ho ve ark.’nın (2010) bildirdikleri “Cytopathic Effect (CPE) Reduction” testinin kolorimetrik XTT metoduna uyarlanması ile, 100 misli %50 doku kültürü infektif doz (DKID50) içeren RSV süspansiyonuna karşı kontrol edilmiştir. Test, şöyle yapılmıştır: Tripsin ile muamele edilen HEp-2 hücrelerinin üretme vasatı kullanılarak 2.5 × 105 hücre/ml konsantrasyonda süspansiyonu hazırlanmıştır. Hazırlanan bu hücre süspansiyonundan 96 kuyucuklu kültür pleytinin kuyucuklarına (VK olarak kullanılan pleytin 1. kolonundaki 8 kuyucuk hariç) kuyucuk başına 100 µl hacimde (2.5 × 104 hücre/kuyucuk) ekim yapılmış ve 24 saat süreyle inkübe edilmiştir. Hücreler konfluent olduğunda, kuyucuklardaki üretme vasatı çekilerek boşaltılmıştır. RSV stoğu, %2 FBS içeren EMEM (idame vasatı) kullanılarak 100 DKİD50 oranında sulandırılmıştır. RBV’nin stok solüsyonundan (1000 mg/ml) daha önce belirlenen MNTK’sinden (0.98 µg/ml) konsantrasyonu 2 misli fazla olan, yani konsantrasyonu 1.96 µg/ml olan bir sulandırma (%2 FBS içerecek şekilde) hazırlanmıştır (toplam 2’şer ml). RBV’nin 2 × MNTK’de sulandırması hazırlandıktan sonra, bu sulandırmadan idame vasatı kullanılarak 2 misli sulandırmalar hazırlanmıştır (Toplam 1’er ml). Yani, RBV’nin 1.96, 0.98, 0.49, 0.245, 0.123, 0.061, 0.031, 0.015, 0.08 µg/ml konsantrasyonda sulandırmaları hazırlanmıştır. 96 kuyucuklu pleytin 1. kolonundaki 8 kuyucuk VK (vasat kontrol), 2. kolonundaki 8 kuyucuk HK (hücre kontrol) , 3. kolonundaki 8 kuyucuk ise virus kontrol (VrK) olarak kullanılmıştır. VK ve HK kuyucuklarına 200’er µl idame besiyeri konulmuştur. Pleytlin virus kontrol (VrK) olarak kullanılan 3. kolonundaki 8 adet kuyucuğun her birine 100 DKİD50 oranında sulandırılan RSV süspansiyonundan 100’er µl ve idame besiyerinden 100’er µl eş zamanlı olarak konulmuştur. Pleytin geriye kalan kolonlarındaki (yani, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ve 12. kolonlarındaki) 9 kuyucuğun her birine 100 DKİD50 oranında sulandırılan RSV süspansiyonundan 100’er µl konulduktan sonra üzerlerine eş zamanlı olarak RBV’nin 2 × MNTK’sinden başlangıç alan sulandırmalarından 100’er µl konulmuştur. Pleytin kapağı kapatılmış ve 37ºC’de %5 CO2’li ortamda 3 gün süreyle (daha doğrusu, VrK kuyucuklarında maksimum sinsityum oluşumu gözleninceye kadar) inkübe edilmiştir. VrK kuyucuklarında maksimum sinsityum oluşumu gözlendikten sonra, kuyucuklardaki süpernatant boşaltılmış ve kuyucuklara 150’şer µl serumsuz EMEM konulmuştur. Daha sonra, ticari olarak elde edilen XTT (2,3-bis[2 methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide) ayıracının 5 ml’si ile yine ticari olarak elde edilen PMS (fenazin metosülfat: elektron bağlama ayıracı)’nin 0.1 ml’sinin karıştırılmasıyla hazırlanan karışımdan her kuyucuğa 50’şer µl konulmuştur. Boyanın kuyucuklara homojen bir şekilde dağılması için pleyt hafifçe çalkalanmıştır. XTT formazan ürününün oluşması için pleyt 3 saat daha inkübe edilmiştir. Optik dansisite (OD)’ler, 570 nm dalga boyunda bir ELISA okuyucusunda (Multiskan EX, Labsystems) okutularak 8 kuyucuktan elde edilen OD ortalamaları kaydedilmiştir. Farklı RBV konsantrasyonlarının virusa karşı koruma yüzde oranları, A’nın 8 kuyucuktaki her bir RBV konsantrasyonu için ortalama OD’yi, B’nin VrK ortalama OD’sini, C’nin HK ortalama OD’sini temsil ettiği aşağıdaki formülden hesaplanmıştır (Andrighetti-Fröhner ve ark., 2003):
Koruma %’si = [ (A−B) / (C−B) x 100 ]

Enfekte hücrelerin % 50’sinde koruma sağlayan RBV konsantrasyonu olarak tanımlanan EC50 değeri, RBV konsantrasyonlarına karşı belirlenen koruma % oranlarından yararlanılarak, GraphPad Prism Version 5.03 istatistik programı kullanılarak non-linear regresyon analiziyle belirlenmiştir. RBV’nin SI (Seçicilik İndeksi) değeri ise, CC50/EC50 oranından hesaplanmıştır.

1.1.2.5.2 Ekstraktların anti-RSV aktivitelerinin belirlenmesi

Cistus laurifolius metanol ekstraktının HEp-2 hücreleri üzerine karşı MNTK’si 31.25 µg/ml, su ekstraktının MNTK’si 62.50 µg/ml olarak belirlenmiştir. Cistus laurifolius metanol ve su ekstraktlarının HEp‒2 hücrelerine karşı belirlenen MNTK’lerinden (3125 µg/mL ve 62.50 µg/ml) başlangıç alan 2 misli sulandırmaları anti-RSV aktiviteleri yönünden Ho ve ark.’nın (2010) bildirdikleri “Cytopathic Effect (CPE) Reduction” testinin kolorimetrik XTT metoduna uyarlanması ile, 100 misli %50 doku kültürü infektif doz (DKID50) içeren RSV süspansiyonuna karşı kontrol edilmiştir. Test, şöyle yapılmıştır: Tripsin ile muamele edilen HEp-2 hücrelerinin GM (Growth Medium/Üretme Vasatı) kullanılarak 2.5 × 105 hücre/ml konsantrasyonda süspansiyonları hazırlanmıştır (Toplam 25 ml). Hazırlanan bu hücre süspansiyonlarından 96 kuyucuklu kültür pleytlerinin kuyucuklarına kuyucuk başına 100 µl hacimde (2.5 × 104 hücre/kuyucuk) ekim yapılmış ve 24 saat süreyle inkübe edilmiştir. Hücreler konfluent olduğunda, kuyucuklardaki GM çekilerek boşaltılmıştır. RSV stoğu, %2 FBS içeren EMEM MM (Maintenance Medium/İdame Vasatı) kullanılarak 100 DKİD50 oranında sulandırılmıştır.

Ekstraktların stok solüsyonunlarından (50 mg/ml) daha önce belirlenen MNTK’lerinden (31.25metanol µg/ml ve 62.50su µg/ml) konsantrasyonları 2 misli fazla olan sulandırmaları hazırlanmıştır (%2 FBS içerecek şekilde). Ekstraktların 2 × MNTK’de sulandırmaları hazırlandıktan sonra, bu sulandırmalardan idame vasatı (%2 FBS’li EMEM) kullanılarak 2 misli sulandırmalar hazırlanmıştır. Yani; metanol ekstraktının 62.50, 31.25, 15.625, 7.813, 3.906, 1.953, 0.977, 0.488, 0.244, 0.122 µg/ml konsantrasyonda sulandırmaları, su ekstraktının 125, 62.50, 31.25, 15.625, 7.813, 3.906, 1.953, 0.977, 0.488, 0.244 µg/ml konsantrasyonda sulandırmaları hazırlanmıştır. 96 kuyucuklu pleytlerin 1. kolonundaki 8 kuyucuk HK ve 2. kolonundaki 8 kuyucuk VrK olarak kullanılmıştır. HK kuyucuklarına 200’er µl idame vasatı konulmuştur. Pleytlerin VrK olarak kullanılan 2. kolonlarındaki 8 adet kuyucuğun her birine 100 DKİD50 oranında sulandırılan RSV süspansiyonundan 100’er µl ve idame vasatından 100’er µl eş zamanlı olarak konulmuştur. Pleytlerin geriye kalan kolonlarındaki (yani, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ve 12. kolonlarındaki) 8 kuyucuğun her birine 100 DKİD50 oranında sulandırılan RSV süspansiyonundan 100’er µl konulduktan sonra üzerlerine eş zamanlı olarak ekstraktların 2 × MNTK’lerinden başlangıç alan sulandırmalarından 100’er µl konulmuştur. Pleytlerin kapağı kapatılmış ve 37ºC’de %5 CO2’li ortamda 3 gün süreyle (daha doğrusu, VrK kuyucuklarında maksimum sinsityum oluşumu gözleninceye kadar) inkübe edilmiştir. VrK kuyucuklarında maksimum sinsityum oluşumu gözlendikten sonra, kuyucuklardaki süpernatant boşaltılmış ve kuyucuklara 150’şer µl serumsuz EMEM konulmuştur. Daha sonra, ticari olarak elde edilen XTT (2,3-bis[2 methoxy-4-nitro5-sulfophenyl]-5-(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide) ayıracının 5 mL’si ile yine ticari olarak elde edilen PMS (fenazin metosülfat: elektron bağlama ayıracı)’nin 0.1 ml’sinin karıştırılmasıyla hazırlanan karışımdan her kuyucuğa 50’şer µl konulmuştur. Pleytler, boyanın kuyucuklara homojen bir şekilde dağılması için hafifçe çalkalanmıştır. Pleytler, XTT formazan ürününün oluşması için 3 saat daha inkübe edilmiştir. Optik dansisite (OD)’ler, 570 nm dalga boyunda bir ELISA okuyucusunda (Multiskan EX, Labsystems) okutularak 8 kuyucuktan elde edilen OD ortalamaları kaydedilmiştir. Farklı ekstrakt konsantrasyonlarının virusa karşı koruma yüzde oranları, spektrofotometrik olarak aşağıdaki formülden hesaplanmıştır (Andrighetti-Fröhner ve ark., 2003):
Koruma %’si = [ (A−B) / (C−B) x 100 ] A = 8 gözdeki her bir ekstrakt konsantrasyonu için ortalama OD B = Virus kontrol OD’si (8 gözdeki OD değerlerinin ortalaması) C = Hücre kontrol OD’si (8 gözdeki OD değerlerinin ortalaması) Enfekte hücrelerin % 50’sinde koruma sağlayan ekstrakt konsantrasyonu olarak tanımlanan EC50 değeri, ekstrakt konsantrasyonlarına karşı belirlenen koruma % oranlarından yararlanılarak, GraphPad Prism Version 5.03 istatistik programı kullanılarak non-linear regresyon analiziyle belirlenmiştir. Ekstraktların seçicilik indeksi (SI) ise, CC50/EC50 oranından hesaplanmıştır.

1.2 Bulgular
1.2.1 Virus Titrasyon Testi Bulguları

Araştırmada kullanılan RSV’in HEp-2 hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen mikrotitrasyon testi sonucunda titresi, 3. gün sonunda DKİD50 = 10–4.5/0.1 ml olarak saptanmıştır.

1.2.2 Sitotoksisite Testi Bulguları

Bu çalışmada, Cistaceae familyası, Cistus cinsine ait Cistus laurifolius L.’nın yapraklarından elde edilen metanol ve su ekstraktları, kolorimetrik XTT testi ile RSV’ye karşı antiviral aktiviteleri yönünden incelenmiştir. Antiviral testlerin gerçekleştirilmesi için ön koşul olarak, virus-konakçı hücrelerine (RSV‒HEp-2) karşı ekstraktların ve RSV’ye karşı pozitif kontrol olarak kullanılan RBV’nin sitotoksisiteleri kolorimetrik hücre canlılık testi ile araştırılmıştır. Araştırmada RSV’ye karşı pozitif kontrol olarak kullanılan RBV’nin MNTK’si 0.98 µg/ml, CC50 değeri ise 117 µg/ml olarak belirlenmiştir (Tablo 1). Cistus laurifolius yaprak metanol ve su ekstraktlarının HEp-2 hücrelerine karşı MNTK’lerini ve CC50 değerlerini saptamak için 3 kopya halinde gerçekleştirilen test sonucunda, Cistus laurifolius yaprak metanol ve su ekstraktının MNTK’leri sırasıyla 31.25 µg/ml ve 62.50 µg/ml (Tablo 1), CC50 değerleri ise sırasıyla 95.21 µg/ml ve 167.93 µg/ml olarak belirlenmiştir (Tablo 1).

1.2.3 Antiviral Aktivite Testi Bulguları

RSV inhibisyonu için pozitif kontrol olarak kullanılan RBV’nin EC50 (%50 Etkili Konsantrasyon/Enfekte Hücrelerin %50’sinde Koruma Sağlayan Konsantrasyon) değerini saptamak için 3 kopya halinde gerçekleştirilen test sonucunda RBV’nin EC50 değeri, GraphPad Prism istatistik programı kullanılarak non-linear regresyon analiziyle 4.19 µg/ml olarak belirlenmiş, CC50’nin EC50’ye oranı olarak tanımlanan seçicilik indeksi (SI) ise 27.92 olarak belirlenmiştir (Tablo 1). Cistus laurifolius metanol ekstraktının EC50 değeri, MNTK’dan başlamak üzere log2 tabanına göre hazırlanan sulandırmalarının RSV’ye karşı koruma yüzde oranlarını saptamak için 3 kopya halinde gerçekleştirilen kolorimetrik XTT testi sonucunda önceden bildirilen formüle göre hesaplanan koruma % oranlarının grafiğe dönüştürülmesiyle, GraphPad Prism istatistik programı kullanılarak non-linear regresyon analiziyle 0.504 µg/ml olarak belirlenmiştir (Tablo 1). Metanol ekstraktının SI (CC50/EC50) değeri ise 188.91 olarak belirlenmiştir (Tablo 1). Cistus laurifolius su ekstraktının ise test edilen konsantrasyonlarda anti-RSV aktiviteye sahip olmadığı tespit edilmiştir (Tablo 1).

Tablo 1. Cistus laurifolius metanol ve su ekstraktlarının sitotoksisite ve antiviral aktivite deneyleri toplu sonuçlarıa



a Sitotoksisite ve antiviral aktivite XTT testi ile ölçülmüştür
MNTK: Maksimum non-toksik konsantrasyon
CC50: %50 Sitotoksik etkili konsantrasyon
EC50: %50 Etkili Konsantrasyon; virusun neden olduğu CPE’yi %50’ye kadar inhibe etmek için gerekli olan numune konsantrasyonu
Seçicilik İndeksi (SI): CC50/EC50
– : antiviral etkisi yok

1.3. Tartışma

RSV’nin neden olduğu akut respiratuvar enfeksiyonlara en çok bebekler ve çocuklarda rastlandığı bilinmektedir. RSV enfeksiyonuna bağlı ölüm oranı genellikle düşük olmakla birlikte, kalp veya solunum yetmezliği olan bebeklerde %37-73’e kadar, kemik iliği nakli yapılan kişilerde %36-45’e kadar ölüm oranında artış görülmektedir (Kimura ve ark., 2000; MacDonald ve ark., 1982; Englund ve ark., 1988; Harrington ve ark., 1992). Ribavirinden daha iyi etkinliği ve güvenliği olan özgün anti-RSV bileşikler araştırma hedefidirler. Doğal ürünler antiviral etkenlerin farklı bir kaynağını teşkil edebilirler. Örneğin, Cistus incanus spp. tauricus’dan elde edilen ekstraktların hiç bir olumsuz yan etki göstermeksizin bir RNA virusu olan influenza virusuna karşı antiviral aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur (Ehrhardt ve ark., 2007).

Türk halk hekimliğinde romatizmal ağrıların giderilmesinde, hemoroid tedavisinde, böbrek ve üriner sistem iltihaplanmalarının tedavisinde ve ateş düşürücü olarak kullanılan Cistus laurifolius yapraklarından hazırlanan metanol ve su ekstraktlarının sitotoksik ve antiviral aktiviteleri kolorimetrik XTT testi ile araştırılmıştır. Ekstraktların ve RBV’nin sitotoksik ve antiviral aktivitelerine yönelik bulgular Tablo 1’de özetlenmiştir. Tablo 1’de görüldüğü gibi, 95.21–167.93 µg/ml aralığında CC50 değerlerine sahip olan ekstraktların, Rukunga ve Simons’un (2006) kriterlerine göre HEp-2 hücreleri üzerine toksik olmadığı anlaşılmıştır. Rukunga ve Simons’un (2006) sınıflandırmasına göre; 2 µg/ml’den daha düşük CC50 değerine sahip olan ekstraktlar sitotoksik, 2-89 µg/ml aralığında CC50 değerine sahip olan ekstraktlar kısmen (orta derecede) sitotoksik ve 90 µg/ml’den daha büyük CC50 değerine sahip olan ekstraktlar non-toksik olarak değerlendirilmişlerdir.

Antiviral aktivite deneyleri, Cistus laurifolius metanol ekstraktının RSV’ye karşı RSV enfeksiyonunun tedavisinde FDA (Food and Drug Administration) tarafından onaylanan tek antiviral ilaç olan RBV’den daha etkili olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, Cistus laurifolius su ekstraktının RSV’ye karşı antiviral etkiye sahip olmadığı tespit edilmiştir. Tablo 1’de görüldüğü gibi, Cistus laurifolius metanol ekstraktının EC50 değeri 0.504 µg/ml olarak tespit edilirken, SI değeri 188.91 olarak tespit edilmiştir. RBV’nin EC50 ve SI değerleri ise sırasıyla 4.19 µg/ml ve 27.92 olarak tespit edilmiştir. Yine, Tablo 1’de görüldüğü gibi, ekstraktların HEp-2 hücreleri üzerine RSV enfeksiyonlarına karşı standart ilaç olarak kullanılan RBV’den daha az toksik olduğu, ekstraktlar ve RBV’nin CC50 değerlerinin EC50 değerlerinden daha yüksek olduğu dikkat çekmektedir. Bu durum, antiviral bir ajanın güvenirliği bakımından önemlidir (Schinazi ve ark. 2009). Ayrıca, Chattopadhyay ve ark. (2009), 3 ve 3’den büyük SI değerlerinin test ekstraktlarının potansiyel olarak güvenilir antiviral aktivitesinin göstergesi olarak kabul edilmesi gerektiğini bildirmişlerdir.

Petereit ve ark. (1991) öncülüğünde yapılan çalışmalar, Cistus türlerinin temel bileşenlerinin polifenolik bileşikler, özellikle oligomerik prosiyanidin B1 ve B3 ile birlikte kateşin, gallokateşin, gallokateşin-3-gallat gibi flavan-3-ol’ler ya da kateşinler ailesine ait monomerik flavonoidler olduğunu göstermiştir. Cistus yaprakları üzerinde yapılan bir başka fitokimyasal çalışma, flavonoller ailesine ait beş farklı flavonoid aglikon ve glikozit bileşiklerinin varlığını ortaya koymuştur (Demetzos ve ark., 1989). Ayrıca, proantosiyanidinler ve biyogenetik olarak ilişkili dihidroflavonollerin (Petereit ve ark., 1991) yanısıra şikimik asit, epikateşin-(4→6)-kateşin, dimerik prodelphinidinler (Danne ve ark., 1993) ve diğer polifenoller (Danne ve ark., 1994; Saracini ve ark., 2005) de farklı Cistus türlerinde bulunmuştur. Değişken fenolik yapıları olan doğal maddelerin bir grubu olan flavonoitlerin ise, dengue virus, hepatit B virusu, insan sitomegalovirus , herpes simplex virus, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus ve adenovirus dahil olmak üzere çeşitli viruslara karşı antiviral etkiye sahip olduğu bildirilmiştir (Chiang ve ark., 2003; Evers ve ark., 2005; Lyu ve ark., 2005; Xu ve ark., 2010; Zandi ve ark., 2011). Araştırmamızın materyalini oluşturan C. laurifolius’un Naringenin-7-metileter (De Pascual Teresa ve ark., 1979), Apigenin (Sadhu ve ark., 2006), 7-Metilapigenin (De Pascual Teresa ve ark., 1979; Sadhu ve ark., 2006), Kemferol 3,7-dimetil eter (De Pascual Teresa ve ark., 1979; Kupeli ve Yesilada, 2007; Sadhu ve ark., 2006; Ustun ve ark., 2006), Kersetin 3-metil eter (Kupeli ve Yesilada, 2007; Sadhu ve ark., 2006; Ustun ve ark., 2006), Kersetin 3,7-dimetil eter (Kupeli ve Yesilada, 2007; Sadhu ve ark., 2006; Ustun ve ark., 2006), Kersetin 3-O-α-D-ramnozit (Sadhu ve ark., 2006), Kersetin 3,4'-dimetil eter (Sadhu ve ark., 2006), Kersetin 5,3'-dimetil eter (Vogt ve ark., 1988), Kersetin 3,5,3'- trimetil eter (Vogt ve ark., 1988) gibi flavonoidler bakımından zengin olduğu kanıtlanmıştır. Dolayısıyla, C. laurifolius metanol ekstraktının anti-RSV aktivitesi, başta flavonoidler olmak üzere değişik polifenolik bileşiklerin varlığına bağlı olabilir. Öte yandan, aynı bitkinin su ekstraktlarının anti-RSV aktiviteye sahip olmaması, çözücü olarak kullanılan suyun bu maddeleri çözme yeteneğinin düşük olmasına dayandırılabilir. Yapılan bu çalışma, Cistus laurifolius metanol ekstraktının anti-RSV aktivitesini ortaya koyan ilk çalışma niteliğindedir.

Kaynaklar

Agueda, B., Parladé, J., de Miguel, A. M., & Martínez-Peña, F. (2006). Characterization and identification of field ectomycorrhizae of Boletus edulis and Cistus ladanifer. Mycologia, 98 (1), 23-30. Andrighetti, C. R., Fröhmer, C. R., Antonio, R. V., Creczynski, T. B., Pasa, T. B., Barardi, C. R. M., & Simões, C. M. O. (2003). Cytotoxicity and potential antiviral evaluation of violacein produced by Chromobacterium violaceum. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 98, 843-848. Angelopoulou, D., Demetzos, C., Dimas, C., Perdetzoglou, D., & Loukis, A. (2001). Essential oils and hexane extracts from leaves and fruits of Cistus monspeliensis. Cytotoxic activity of ent-13- epi-manoyl oxide and its isomers. Planta Medica, 67 (2), 168-171. Arrington, J. M., & Kubitzki, K. (2003). Cistaceae. In: Kubitzki K, Bayer C (Eds.), Kubitzki’s The Families and Genera of vascular plants 5. Springer, Berlin & Heidelberg & New York, pp. 62- 70. Attaguile, G., Perticone, G., Mania, G., Savoca, F., Pennisi, G., & Salomone, S. (2004). Cistus incanus and Cistus monspeliensis inhibit the contractile response in isolated rat smooth muscle. Journal of Ethnopharmacology, 92 (2-3), 245-250. Baytop, T. (1999). Therapy with Medicinal Plants in Turkey (Past and Present). (2nd ed.). Istanbul: Nobel Medical Bookhouse. Bruggisser, R., von Daeniken, K., Jundt, G., Schaffner, W., & Tullberg-Reinert, H. (2002). Interference of plant extracts, phytoestrogens and antioxidants with the MTT tetrazolium assay. Planta Medica, 68, 445-448. Chattopadhyay, D., Chawla-Sarkar, M., Chatterjee, T., Dey, R. S., Bag, P., Chakraborti, S., & Khan, M. T. H. (2009). Recent advancements for the evaluation of antiviral activities of natural products. New Biotechnology, 25, 347-368. Chiang, L. C., Cheng, H. Y., Liu, M. C., Chiang, W., & Lin, C. C. (2003). In vitro anti-herpes simplex viruses and anti-adenoviruses activity of twelve traditionally used medicinal plants in Taiwan. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 26, 1600-1604. Chinou, I., Demetzos, C., Harvala, C., Roussakis, C., & Verbist, J. F. (1994). Cytotoxic and antibacterial labdane-type diterpenes from the aerial parts of Cistus incanus subsp. creticus. Planta Medica, 60 (1), 34-36. Collins, P. L., & Crowe, J. E. (2007). Respiratory syncytial virus and metapneumovirus, Fields Virology, D.M. Knipe, P. M. Howley, D.E. Griffin, M.A. Martin, R.A. Lamb, B. Roizman and S.E. Straus (eds.), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, pp. 1601-1646. Collins, P. L., & Graham, B. S. (2008). Viral and host factors in human respiratory syncytial virus pathogenesis. Journal of Virology, 82, 2040-2055. Coode, M. J. E. (1988). Cistaceae. P Davis, Mill R, Tan K, (Ed.). Flora of Turkey and the East Aegean Islands, vol. 10, Edinburgh University Press. Edinburgh, UK. 61p. Coode, M. J. E. (1965). Cistaceae. P. Davis (Ed.). Flora of Turkey and the East Aegean Islands, vol 1, Edinburgh UniversityPress. Edinburgh, UK. 506 p. Danne, A., Petereit, F., & Nahrstedt, A. (1993). Proanthocyanidins from Cistus incanus. Phytochemistry, 34 (4), 1129-1133. Danne, A., Petereit, F., & Nahrstedt, A. (1994). Flavan-3-Ols, prodelphinidins and further polyphenols from Cistus salviifolius. Phytochemistry, 37 (2), 533-538. De Andres, A. I., Gomez-Serranillos, M. P., Iglesias, I., & Villar, A. M. (1999). Effects of extract of Cistus populifolius L. on the central nervous system. Phytotherapy Research, 13 (7), 575-579. De Pascual Teresa, J., Urones, J. G., & Basabe, P. (1974). Flavonoids from Cistus ladaniferus. Anales de Quimica, 70 (2), 155-157. De Pascual Teresa, J., Urones, J. G., Agustinherrero, J., Cinosdelamano, M. S., & Grandebenito, M. (1978). Diterpenes from Cistus populifolius. 2. stereochemistry of 2-oxopopuli-folic acid, Anales De Quimica, 74 (1), 166-168. De Pascual Teresa, J., Urones, J. G., Basabe, P., Lianos, A., & Sanches, I. (1979). Flavonoids from Cistaceae. III. Halimium umbellatum (L.) Spach, Cistus laurifolius L. and C. monspeliensis L Anales de Quimica, 75 (2), 168-171. De Pascual Teresa, J., Urones, J. G., Marcos, I. S., Barcala, P. B., & Garrido, N. M. (1986). Diterpenoid and other components of Cistus laurifolius. Phytochemistry, 25 (5), 1185-1187. De Pascual Teresa, J., Urones, J. G., Marcos, I. S., Núñez, L., & Basabe, P. (1983). Diterpenoids and flavonoids from Cistus palinhae. Phytochemistry, 22 (12), 2805-2808. Demetzos, C. N., Chinou, J. B., Charvala, C. E., & Homatidou, V. I. (1990). The essential oil of Cistus parviflorus and its antimicrobial activity in comparison with C. monspeliensis. Fitoterapia, 5, 439-442. Demetzos, C., Anastasaki, T., & Perdetzoglou, D. (2002). A chemometric interpopulation study of the essential oils of Cistus creticus L. growing in Crete (Greece). Zeitschrift für Naturforschung C, 57 (1-2), 89-94. Demetzos, C., Dimas, K., Hatziantoniou, S., Anastasaki, T., & Angelopoulou, D. (2001). Cytotoxic and anti-inflammatory activity of labdane and cis-clerodane type diterpenes. Planta Medica, 67 (7), 614-618. Demetzos, C., Homatidou, V., Loukis, A. E., & Philianos, S. M. (1989). The essential oil of Cistus creticus: comparison with five other species of the genus Cistus. Planta Medica, 55, 633-634. Demetzos, C., Katerinopoulos, H., Kouvarakis, A., Stratigakis, N., Loukis, A., Ekonomakis, C., Spiliotis, V., & Tsaknis, J. (1997). Composition and antimicrobial activity of the essential oil of Cistus creticus subsp. eriocephalus. Planta Medica, 63 (5), 477-479. Demetzos, C., Mitaku, S., Couladis, M., Harvala, C., & Kokkinopoulos, D. (1994). Natural metabolites of ent-13-epi-manoyl oxide and other cytotoxic diterpenes from the Resin "LADANO" of Cistus creticus. Planta Medica, 60 (6), 590-591. Demetzos, C., Stahl, B., Anastassaki, T., Gazouli, M., Tzouvelekis, L. S., & Rallis, M. (1999). Chemical analysis and antimicrobial activity of the resin Ladano, of its essential oil and of the isolated compounds. Planta Medica, 65 (1), 76-78. Demirezer, L. O., Guvenalp, Z., Kuruuzum-Uz, A., & Kazaz, C. (2007). Labdane-type diterpenes from Cistus creticus L. Planta Medica, 73 (9), 953-953. Dimas, K., Demetzos, C., Marsellos, M., Sotiriadou, R., Malamas, M., & Kokkinopoulos, D. (1998). Cytotoxic activity of labdane type diterpenes against human leukemic cell lines in vitro. Planta Medica, 64 (3), 208-211. Dimas, K., Demetzos, C., Mitaku, S., Vaos, B., Marselos, M., Tzavaras, T., & Kokkinopoulos, D. (1999). Cytotoxic activity and antiproliferative effects of a new semi-synthetic derivative of ent3 beta-hydroxy-13-epi-manoyl oxide on human leukemic cell lines. Anticancer Research, 19 (5B), 4065-4072. Duman, R. (2016). Antiviral activity of Ferula halophila Peşmen against herpes simplex virus type 1 (HSV-1). International Journal of Scientific and Technological Research, 2, 4, 1-9. Ehrhardt, C., Hrincius, E. R., Korte, V., Mazur, I., Droebner, K., Poetter, A., Dreschers, S., Schmolke, M., Planz, O., & Ludwig, S. (2007). A polyphenol rich plant extract, CYSTUS052, exerts anti influenza virus activity in cell culture without toxic side effects or the tendency to induce viral resistance. Antiviral Research, 76, 38-47. Empey, K. M., Jr, R. S. P., & Kolls, J. K. (2010). Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virüs. Clinical Infectious Diseases, 50, 1258-1267. Englund, J. A., Sullivan, C. J., Jordan, M. C., Dehner, L. P., Verecellotti, G. M., & Balfour, F. (1988). Respiratory syncytial virus infection in immunocompromised adults. Annals of Internal Medicine, 109, 203-208. Evers, D. L., Chao, C. F., Wang, X., Zhang, Z., Huong, S. M., & Huang, E. S. (2005). Human cytomegalovirus-inhibitory flavonoids: studies on antiviral activity and mechanism of action. Antiviral Research, 68, 124-134. Falsey, A. R., & Walsh, E. E. (2000). Respiratory syncytial virus infection in adults. Clinical Microbiology Reviews, 13, 371-384. Fernandez-Arroyo, S., Barrajon-Catalan, E., Micol, V., Segura-Carretero, A., & FernandezGutierrez, A. (2010). High-performance liquid chromatography with diode array detection coupled to electrospray time-of-flight and ion-trap tandem mass spectrometry to identify phenolic compounds from a Cistus ladanifer aqueous extract. Phytochemical Analysis, 21 (4), 307-313. Güvenç, A., Yıldız, S., Özkan, A. M., Erdurak, C. S., Coşkun, M., Yılmaz, G., Okuyama, T., & Okada, Y. (2005). Antimicrobiological studies on Turkish Cistus species. Pharmaceutical Biology, 43 (2), 178-183. Harrington, R. D., Hooton, T. M., Hackman, R. C., Storch, G. A., Osborne, B., Gleaves, C. A., Benson, A., & Meyers, J. D. (1992). An outbreak of respiratory syncytial virus in bone marrow transplant centre. Journal of Infectious Diseases, 165, 987-993. Ho, W. S., Xue, J. Y., Sun, S. S., Ooi, V. E., & Li, Y. L. (2010). Antiviral activity of daphnoretin isolated from Wikstroemia indica. Phytotherapy Research, 24, 657-661. Jaszczyszyn, A., & Gąsiorowski, K. (2008). Limitations of the MTT assay in cell viability testing. Advances in Clinical and Experimental Medicine, 17 (5), 525-529. Kaerber, G. (1964). Diagnostic procedures for virus and ricketsial disease. Public Health Association, 3, 48-50. Kalpoutzakis, E., Aligiannis, N., Skaltsounis, A. L., & Mitakou, S. (2003). Cis-clerodane type diterpenes from Cistus monspeliensis. Journal of Natural Products, 66 (2), 316-319. Kalpoutzakis, E., Chinou, I., Mitaku, S., Skaltsounis, A. L., & Harvala, C. (1998). Antibacterial labdane-type diterpenes from the resin "ladano" of Cistus creticus subsp. creticus. Natural Product Letters, 11 (3), 173-179. Kimura, K., Mori, S., Tomita, K., Ohno, K., Takahashi, K., Shigeta, S., & Terada, M. (2000). Antiviral activity of NMSO3 against respiratory syncytial virus infection in vitro and in vivo. Antiviral Research, 47, 41-51. Kupeli, E., & Yesilada, E. (2007). Flavonoids with anti-inflammatory and antinociceptive activity from Cistus laurifolius L. leaves through bioassay-guided procedures. Journal of Ethnopharmacology, 112, 524-530. Lyu, S. Y., Rhim, J. Y., & Park, W. B. (2005). Antiherpetic activities of flavonoids against herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and type 2 (HSV-2) in vitro. Archives of Pharmacal Research, 28, 1293-1301. MacDonald, N. E., Hall, C. B., Suffin, S. C., Alexson, C., Harris, P. J., & Manning, J. A. (1982). Respiratory syncytial virus infection in infants with congenital heart disease. New England of Journal Medicine, 307, 397-400. Muñoz, F., & Navarro, C. (1993). Cistaceae. In: , Castroviejo Bolivar S (ed.), Flora Ibérica. Volúmen III. Madrid, España: Real Jardín Botánico, CSIC. p. 318-436. Ogutveren, M., & Tetik, S. S. (2004). Composition of the essential oil of Cistus parviflorus L. from Turkey. Journal of Essential Oil Research, 16 (2), 115-116. Peng, L., Wang, B., & Ren, P. (2005). Reduction of MTT by flavonoids in the absence of cells. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 45 (2), 108-111. Petereit, F., Kolodziej, H., & Nahrstedt, A. (1991). Flavan-3-ols and proanthocyanidins from Cistus incanus. Phytochemistry, 30 (3), 981-985. Polat, R., & Satil, F. (2012). An ethnobotanical survey of medicinal plants in Edremit Gulf (Balıkesir–Turkey). Journal of Ethnopharmacology, 139 (2), 626-641. Ramalho, P. S., de Freitas, V. A. P., Macedo, A., Silva, G., & Silva, A. M. S. (1999). Volatile components of Cistus ladanifer leaves. Flavour and Fragrance Journal, 14 (5), 300-302. Robles, C., & Garzino, S. (1998). Essential oil composition of Cistus albidus leaves. Phytochemistry, 48 (8), 1341-1345. Rukunga, G., & Simons, J. A. (2006). The potential of plants as a source of antimalarial agents: a review. Worid Agroforestry Centre (ICRAF), Nairobi, Kenya. Sadhu, S. K., Okuyama, E., Fujimoto, H., Ishibashi, M., & Yesilada, E. (2006). Prostaglandin inhibitory and antioxidant components of Cistus laurifolius, a Turkish medicinal plant. Journal of Ethnopharmacology, 108 (3), 371-378. Saracini, E., Tattini, M., Traversi, M. L., Vincieri, F. F., & Pinelli, P. (2005). Simultaneous LCDAD and LC-MS determination of ellagitannins, flavonoid glycosides, and acyl-glycosyl flavonoids in Cistus salvifolius L. leaves. Chromatographia, 62, 245. Sargın, S. A., Akçicek, E., & Selvi, S. (2013). An ethnobotanical study of medicinal plants used by the local people of Alaşehir (Manisa) in Turkey. Journal of Ethnopharmacology, 150 (3), 860- 874. Sargın, S. A., Selvi, S., & Acar, M. (2014). Türkiye’de yayılış gösteren Cistus L. (Cistaceae) cinsi üzerinde taksonomik ve morfolojik araştırmalar. Ulusal Botanik/Bitki Bilimi Kongresi, 25-28 Ekim 2014, Antalya. Sargın, S. A., Selvi, S., & López, V. (2015). Ethnomedicinal plants of Sarigöl district (Manisa), Turkey. Journal of Ethnopharmacology, 171, 64-84. Schinazi, R. F., Coats, S. J., Bassit, L. C., Lennerstrand, J., Nettles, J. H., & Hurwitz, S. J. (2009). Approaches for the development of antiviral compounds: the case of hepatitis C virus, In: Antiviral Strategies, Eds: Springer, p. 25-51. Shoemaker, M., Cohen, I., & Campbell, M. (2004). Reduction of MTT by aqueous herbal extracts in the absence of cells. Journal of Ethnopharmacology, 93 (2-3), 381-384. Somoza, B., deRojas, V. R. S., Ortega, T., & Villar, A. M. (1996). Vasodilator effects of the extract of the leaves of Cistus populifolius on rat thoracic aorta. Phytotherapy Research, 10 (4), 304- 308. Stępień, A., Aebisher, D., & Bartusik-Aebisher, D. (2018). Biological properties of Cistus species. European Journal of Clinical and Experimental Medicine, 16 (2), 127-132. Talorete, T.P., Bouaziz, M., Sayadi, S., & Isoda, H. (2006). Influence of medium type and serum on MTT reduction by flavonoids in the absence of cells. Cytotechnology, 52 (3), 189-198. Ulukaya, E., Ozdikicioglu, F., Oral, A. Y., & Demirci, M. (2008). The MTT assay yields a relatively lower results of growth inhibition than the ATP assay depending on the chemotherapeutic drugs tested. Toxicol in Vitro, 22, 232-239. Ustun, O., Ozcelik, B., Akyon,Y., Abbasoglu, U., & Yesilada, E. (2006). Flavonoids with antiHelicobacter pylori activity from Cistus laurifolius leaves. Journal of Ethnopharmacology, 108, 457-461. Vogt, T., & Gülz, P. G. (1988). Epicuticular lipophilic flavonoid aglycones in the genus Cistus L. Biological Chemistry Hoppe Seyler, 369 (1), 16-16. Vogt, T., Gülz, P. G., & Wray, V. (1988). Epicuticular 5-O-methyl flavonols from Cistus laurifolius. Phytochemistry, 27 (11), 3712-3713. Vogt, T., Proksch, P., Gülz, P. G., & Wollenweber, E. (1987). Rare 6- and 8-O-methylated epicuticular flavonols from two Cistus species. Phytochemistry, 26 (4), 1027-1030. Welliver, R. C. (2010). Pharmacotherapy of respiratory syncytial virus infection. Current Opinion in Pharmacology, 10, 289-293. Weyermann, J., Lochmann, D., & Zimmer, A. (2005). A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics, 288, 369-376. Wollenweber, E., & Mann, K. (1984). Flavonoid aglycones in the leaf resin of some Cistus species. Zeitschrift fur Naturforschung, 39c, 303-306. Wray, S. K., Gilbert, B. E., & Knight, V. (1985). Effect of ribavirin triphosphats on primer generation and elongation during influenza virus transcription in vitro. Antiviral Research, 5, 39-48. Xu, G., Dou, J., Zhang, L., Guo, Q., & Zhou, C. (2010). Inhibitory effects of baicalein on the influenza virus in vivo is determined by baicalin in the serum. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 33, 238-243. Yesilada, E., Gurbuz, I., & Ergun, E. (1997). Effects of Cistus laurifolius L. flowers on gastric and duodenal lesions. Journal of Ethnopharmacology, 55 (3), 201-211. Yeşilada, E., Gürbüz, I., & Shibata, H. (1999). Screening of Turkish anti-ulcerogenic folk remedies for anti-Helicobacter pylori activity. Journal of Ethnopharmacology, 66 (3), 289-293. Zandi, K., Teoh, B. T., Sam, S. S., Wong, P. F., Mustafa, M. R., & Abubakar, S. (2011). Antiviral activity of four types of bioflavonoid against dengue virus type-2. Virology Journal, 8, 560.

[igokcek]

[igokcek]

Cistus incanus ekstraktının HIV ve Filovirüslere karşı güçlü in vitro antiviral aktivitesi viral zarf proteinlerini hedefler

• Stephanie Rebensburg ,
• Markus Helfer ,
• Martha Schneider ,
• Herwig Koppensteiner ,
• Josef Eberle ,
• Michael Schindler ,
• Lutz Gürtler &
• Ruth Brack-Werner

Bilimsel Raporlar hacim 6 , Makale numarası: 20394 ( 2016 ) Bu makaleden alıntı yap

• 24k Erişim
• 54 Atıf
• 157 Altmetrik
• Metriklerdetaylar

Soyut

Virüs enfeksiyonlarının küresel tedavisini iyileştirmek için acilen yeni terapötik seçeneklere ihtiyaç vardır. Onaylanmış klinik güvenlik özelliklerine sahip bitkisel ürünler, yeni antiviral aktivitelerin tanımlanması için çekici başlangıç materyalleridir. Burada Cistus incanus (Ci) bitkisel ürünlerinin in vitro insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonlarını inhibe ettiğini gösteriyoruz.. Ci ekstresi, klinik HIV-1 ve HIV-2 izolatlarını ve daha da önemlisi, geniş anti-HIV aktivitesini doğrulayan çoklu ilaç direncine sahip bir virüs izolatını inhibe etti. Antiviral aktivite, virüs partikülleri için oldukça seçiciydi ve virüsün hücre yüzeyine birincil bağlanmasını ve viral zarf proteinlerinin heparine bağlanmasını önledi. Biyoanaliz kılavuzlu fraksiyonlama, Ci ekstraktının çok sayıda antiviral bileşik içerdiğini ve bu nedenle virüs direncini indüklemek için uygun şekilde düşük bir eğilime sahip olduğunu gösterdi. Aslında, virüsün Ci ekstraktlarının mevcudiyetinde 24 haftalık sürekli çoğalması sırasında hiçbir dirençli virüs ortaya çıkmadı. Son olarak, Ci ekstraktları, Ebola ve Marburg virüsü zarf proteinleri ile psödotiplenmiş virüs partiküllerinin neden olduğu enfeksiyonu da inhibe etti; bu, Ci ekstraktının antiviral aktivitesinin ortaya çıkan viral patojenlere kadar uzandığını gösterir.insanlarda yaşamı tehdit eden hastalıklara neden olan virüslere karşı in vitro antiviral aktivite ve virüs partiküllerini hedef alan ajanların umut verici kaynaklarıdır. giriiş

Virüs enfeksiyonları, küresel ölçekte insan sağlığı için ciddi tehditler oluşturmaktadır. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV), antiretroviral tedavi olmaksızın AIDS'e yol açan kronik, yaşam boyu enfeksiyona neden olur. 35 milyondan fazla kişi HIV/AIDS ile yaşıyor ve pandemi, özellikle düşük gelirli ülkelerde 1 on yılı aşkın bir süredir dünyanın önde gelen 10 ölüm nedeni arasında yer alıyor ¹ . Ebola virüsü (EBOV) gibi yeni ortaya çıkan virüsler, enfeksiyondan 2-21 gün sonra ortaya çıkan semptomlar ve yüksek ölüm riski (ortalama ölüm oranı ~%50) ile akut bir hastalığa neden olabilir (Ebola virüsü hastalığına ilişkin mevcut bilgilerin özeti için bkz. ²). EBOV, Mayıs 2014'te Batı Afrika'da (Gine, Liberya ve Sierra Leone) alevlenen gibi ani salgınlara neden olabilir. 10.000'den fazla kişinin ölümünün yanı sıra, bu salgın, kaynak yetersizliği ve uzun süreli çatışma ve istikrarsızlık nedeniyle zaten zayıflamış olan ve yerel sağlık sistemlerinin çökmesine yol açan ülkelere ek bir ağır yük getirdi.

Hayatı tehdit eden viral enfeksiyonların tedavisi için yeni antiviral ajanların geliştirilmesine güçlü bir ihtiyaç vardır. ^{HIV/AIDS'in ( ≥253} ) tedavisi için bir dizi onaylanmış ilacın mevcudiyetine rağmen , mevcut anti-HIV tedavileri çeşitli iyileştirmelerden yararlanmaya devam edecektir. Kısıtlamalar arasında, dirençli virüslerin ortaya çıkma riskinin yüksek olması, merkezi sinir sistemi gibi virüs sığınaklarına zayıf penetrasyon, özellikle uzun süreli tedavi bağlamında olumsuz etkiler ve kaynakların sınırlı olduğu alanlarda uygun fiyatlı tedavilere eksik erişim yer alır ^{4 , 5 , 6 , 7}. ^{Ayrıca, bu ilaçların çoğu virüs replikasyon döngüsünün giriş sonrası adımlarını bloke eder ve viral ters transkriptaz, proteaz veya integraz 3} gibi yalnızca birkaç viral hedefe saldırır .

HIV/AIDS'in aksine, şu anda EBOV enfeksiyonlarıyla savaşmak için onaylanmış hiçbir ilaç mevcut değildir. Hedefe yönelik antiviral tedavilerin olmaması, EBOV salgınlarını yönetmenin en korkutucu yönlerinden biridir.

Bitki kaynaklı doğal ürünler, tıbbi tedaviler için önemli bir rol oynamaktadır ^{8 , 9} . Bitki özleri, dünya nüfusunun büyük bir kısmı için birincil sağlık bakım biçimini temsil eder10 ve tek moleküllü ilaç kurşunlarının önemli bir kaynağıdır ^. Önemli bir örnek , 2015 Nobel Fizyoloji ve Tıp Ödülü sahibi YouYou Tu tarafından keşfedilen Artimisia annua ^11'in sıtmaya karşı etkinliğidir ¹² .

Çok sayıda şifalı bitki için antiviral aktiviteler bildirilmiştir ^{9 , 13} . Bununla birlikte, bitkisel antiviral ilaçlar olarak uygulanmaları, etkinliklerinin, güvenliklerinin, bileşimlerinin ve etki mekanizmalarının derinlemesine araştırılmasını gerektirir ¹⁴ . Klinik güvenlik ve biyolojik aktivitelere ilişkin veriler, bazıları Avrupa'da reçetesiz satılan ilaçlar olarak satılan birkaç bitki özü için mevcuttur. Yeni antiviral ajan kaynaklarının tanımlanması için bir ilk adım olarak, HIV-1 gibi başlıca insan viral patojenlerine karşı klinik olarak değerlendirilen bu bitkisel ilaçların antiviral aktivitelerini araştırmayı amaçlıyoruz. Bu yaklaşım, Pelargonium sidoides ¹⁵ özlerinin anti-HIV-1 aktivitesine ilişkin son gösterimimizle desteklenmektedir., Almanya'da bitkisel ilaç Umckaloabo® olarak ruhsatlandırılmıştır.

Bu çalışmada Cistus incanus'un (Pembe Rockrose) HIV ve Filovirüslere karşı antiviral aktiviteleri araştırıldı . Cistus incanus (Ci), Güney Avrupa ve Kuzey Afrika'nın Akdeniz bölgelerine özgüdür ve Pelargonium sidoides'ten (Geraniales) farklı bir taksonomik takıma (Malvales) aittir. Ci ekstraktlarının anti-enflamatuar, antioksidan, antimikotik ve antibakteriyel aktivitelere sahip olduğu gösterilmiştir ^{16 , 17 , 18 , 19} . Ci, polifenoller açısından zengindir ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23}, antimikrobiyal/antiviral aktivitelere sahip birçok temsilciyi içeren kimyasal bir bileşik sınıfı ^{24 , 25} . ^{Ayrıca, Ci ekstraktlarının influenza A virüsü 21 , 26} ile enfeksiyonu önlediği gösterilmiştir . ^{CYSTUS052 ®} kaynatma, boğaz pastilleri ve bitki çayı dahil olmak üzere farklı Ci müstahzarları ticari olarak mevcuttur . Üst solunum yolu enfeksiyonu olan hastalarla yapılan klinik araştırmalar, kontrol hastalarına kıyasla tedavi edilen hastalarda semptomlarda azalma ve daha az yan etki ortaya çıkardı, bu da CYSTUS052® 27, 28'in klinik etkinliğine ve olumlu bir ^{güvenlik profiline işaret ediyor} .

Ci ekstraktlarının, geleneksel ilaçlara karşı çoklu dirençli bir klinik virüs izolatı dahil olmak üzere farklı HIV izolatlarına karşı geniş önleyici aktivite gösterdiğini gösterdik. Etki modu çalışmaları, Ci'nin viral zarf proteinlerini hedef alarak virüsün konakçı hücrelere birincil bağlanmasını önlediğini göstermektedir. Ci ekstraktlarının antiviral aktivitesi aynı zamanda Ebola virüsü zarf proteinine yönelikti. Ekstrakt dekonvolüsyon çalışmaları, Ci ekstraktlarının HIV ve Ebola virüsüne karşı çok sayıda aktif bileşen içerdiğini ortaya çıkardı. Sonuçlarımız, Ci ekstraktının HIV ve Ebola virüsüne karşı güçlü antiviral aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir ve Ci ekstraktının, bu virüslerin replikasyon için konak hücrelere girmesini önleyen çoklu bileşikler içerdiğini göstermektedir. Sonuçlar

Cistus incanus ekstraktlarının çok çeşitli HIV izolatlarına karşı antiviral aktivitesi

Cistus incanus'un (Ci) farklı sulu özleri , oldukça hassas bir HIV haberci hücre dizisi (LC5-RIC) ve HIV inhibitörlerinin tanımlanması için oluşturulmuş teknoloji (EASY-HIT ²⁹ ) kullanılarak anti-HIV aktivitesi açısından değerlendirildi . Başlangıç testi ticari bir Ci müstahzarı (CYSTUS052®), Ci çayından demlenmiş bir ekstrakt ve taze, kendi kendine yetişen Ci bitkilerinden hazırlanan bir ekstrakt (n = 3) ile gerçekleştirilmiştir. Üç Ci ekstraktının tümü, LC5-RIC hücrelerinin HIV-1 laboratuvar izolatı HIV-1 _LAI tarafından benzer etkilerle enfeksiyonunu inhibe etti ( Ek Şekil S1 ). Ci ile muamele edilmiş hücrelerin yaşayabilirliği (MTT tahlili ile ölçülmüştür), tüm ekstraktlar için muamele edilmemiş hücrelerin ≥%80'i olmuştur. Anti-HIV etkinliğinin daha fazla analizi için CYSTUS052® kullandık.

Daha sonra Ci ekstraktının çok çeşitli klinik HIV izolatlarına karşı antiviral aktivitesini araştırdık. Şekil 1'de gösterildiği gibi , Ci ekstresi hem HIV tip 1 hem de 2 tarafından enfeksiyonu inhibe etti. İki farklı gruptan [Major (HIV-1M _MVP899-87 ) ve Outlier (HIV-1O _MVP5180-91 )] klinik izolatlar tarafından enfeksiyonun inhibisyonu LC5-RIC raportör hücreleri ve birincil insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile gösterildi. Daha da önemlisi, Ci ekstraktı ayrıca çoklu ilaç direnci mutasyonları olan bir HIV-1 M grubu/B sınıf izolatını (HIV-1 _{V13-03413B ) inhibe etti.} Bu izolat, virolojik tedavi başarısızlığı olan bir hastadan elde edilmiştir. _{HIV-1 V13-03413B'nin} proteaz ve ters transkriptaz dizilerinin analiziHIV-GRADE aracıyla ³⁰ , HIV-1 _{V13-03413B'nin} 4 NNRTI'den 3'üne (Nükleosid olmayan ters transkriptaz inhibitörleri), 10 NRTI'den 8'ine (nükleosid ters transkriptaz inhibitörleri) ve 14 proteaz inhibitöründen 13'üne karşı yüksek düzeyde direnci tahmin etti ve bu sınıflarda kalan ilaçlara karşı orta düzeyde direnç. Şekil 1
Cistus incanus ekstresi, çok çeşitli insan immün yetmezlik virüslerinin (HIV) enfektivitesini inhibe eder.

( A ) Cistus incanus (Ci) ekstraktının antiviral aktivitesi, HIV tip 1 ve HIV tip 2 izolatlarını inhibe eder . Enfeksiyon inhibisyonu , farklı koruyucu tropizmlere (HIV-1 _LAI : X4-tropic; HIV-1 _{AD8(R5) sahip HIV-1 izolatları kullanılarak insan HIV raportör hücreleriyle (HIV-1 AD8(R5)} için LC5-RIC veya LC5-RIC-R5) değerlendirildi. 1 _AD8(R5) : R5-tropik, M (Major) (HIV-1M _MVP899-87 ) veya O (Outlier) grubuna (HIV-1O _MVP5180-91 ) ait HIV-1 klinik izolatları, bir klinik izolat HIV tip 2 (HIV-2 _MVP10668-93 ) ve çoklu ilaç direncine sahip bir klinik HIV-1 izolatı (HIV-1 _V13-03413B ). ( B )Cistus incanus (Ci) ekstresi, birincil insan hedef hücrelerinin HIV enfeksiyonunu inhibe eder. İnterlökin-2 ile uyarılmış periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) , farklı Ci ekstrakt konsantrasyonlarının mevcudiyetinde HIV-1 _LAI veya HIV-10 _MVP5180-91 virüsüne maruz bırakıldı . PBMC tarafından üretilen enfeksiyöz virüs seviyeleri, PBMC'nin kültür üst fazlarının LC5-RIC hücreleri ile analiz edilmesiyle belirlendi. 3 donörden alınan PBMC'ler ile deneyler yapıldı. Doz-yanıt eğrileri, her biri 100 μg/ml ile 3,12 μg/ml arasında 6 konsantrasyonda Ci ekstraktı ile gerçekleştirilen 3 bağımsız enfeksiyon testi için gösterilmiştir. Semboller ortalama değerleri ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını belirtir. EC50 _, hesaplanan yarı maksimal etkili konsantrasyonu ifade eder.

Tam boyutlu resim
Ci ekstraktının anti-HIV aktivitesi için polifenollerin önemini aydınlatmak için, polifenollerin polivinilpirolidona (PVPP) adsorpsiyonu yoluyla Ci ekstraktından polifenolle zenginleştirilmiş bir fraksiyon (CiPP) ürettik. CiPP, test edilen tüm HIV izolatları paneline karşı doza bağlı antiviral aktivite gösterdi ( Şekil 2A ). CiPP fraksiyonunun antiviral aktivitesi ~0,7 ila 2,0 μg/ml aralığındaydı ve tüm Ci ekstraktınınkinden ≥5 kat daha güçlüydü ( Şekil 1A ve 2A'yı karşılaştırın ). _{Buna karşılık, polifenol-tükenmiş fraksiyon, aynı konsantrasyonlarda HIV-1 LAI} ile test edildiğinde hiçbir antiviral aktivite göstermedi ; bu, Ci ekstraktının antiviral aktivitesinden polifenollerin sorumlu olduğunu gösterir ( Şekil 2B ). şekil 2
Polifenoller, Cistus incanus ekstraktının anti-HIV aktivitesi için çok önemlidir .

Tüm Cistus incanus (Ci) ekstraktının polivinilpirolidona (PVPP) maruz bırakılması ve ardından santrifüjleme ve adsorbe edilmiş polifenollerin (PP) elüsyonu ile PVPP peletinin sulu süpernatandan ayrılmasıyla bir polifenol açısından zenginleştirilmiş fraksiyon (CiPP ile zenginleştirilmiş fraksiyon) üretildi . PVPP peletinden. (Daha fazla ayrıntı için Malzemeler ve Yöntemlere bakınız). ( A ) Polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyon, HIV tip 1 ve HIV tip 2 izolatlarının neden olduğu enfeksiyonu etkili bir şekilde engeller. Polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyonun HIV-inhibisyon aktivitesi, LC5-RIC hücreleri ile aynı HIV izolatları paneliyle ve tüm Ci ekstraktının test edilmesi için kullanılan aynı koşullar altında test edildi (bkz. Şekil 1 ) . ( B )Anti-HIV aktivitesi, polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyon tarafından seçici olarak korunur . Polifenolle zenginleştirilmiş ve polifenolle tüketilmiş fraksiyonun anti-HIV aktiviteleri, HIV-1 _LAI ve LC5-RIC hücreleri kullanılarak karşılaştırıldı. Polifenol-tükenmiş fraksiyon (=CiPP-tükenmiş fraksiyon), santrifüjlemeden sonra PVPP topağının sulu süpernatanını temsil eder. Doz-yanıt eğrileri, her biri 25 μg/ml ile 0,78 μg/ml arasında 6 konsantrasyonda Ci ekstraktı ile gerçekleştirilen 3 bağımsız enfeksiyon testi için gösterilmiştir. Semboller ortalama değerleri ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını belirtir. EC50 _, hesaplanan yarı maksimal etkili konsantrasyonu ifade eder.

Tam boyutlu resim
Ci işleminin, PBMC'nin canlılığı üzerindeki etkisinin MTT tahlili ile test edilmesi, tüm ekstrakt için ≥250 μg/ml CC50 değerleri ortaya çıkardı ( _Ek Şekil S2 ).  CiPP , tüm ekstrakttan bile daha düşük sitotoksisite (CC50 >1200 μg/ml) gösterdi _. Böylece polifenollerin zenginleştirilmesi, ekstraktın sitotoksik bileşenlerini ortadan kaldırır ve antiviral aktiviteyi arttırır.

Birlikte bu sonuçlar, Ci ekstraktının çok çeşitli HIV izolatlarına karşı güçlü antiviral aktivitesini gösterir ve polifenollerin anti-HIV aktivitesi için çok önemli olduğunu gösterir. Etki mekanizması: Ci özü, HIV'in konakçı hücreleri istila etmesini önler

^{EASY-HIT sisteminde Ci ekstraktının antiviral testi, HIV replikasyon döngüsünün 29} erken evresini etkileyen antiviral ajanların karakteristiği olan tahlilin ilk adımında inhibisyonu ortaya çıkardı . Bu nedenle, ekleme zamanı (TOA) deneyleri yaptık. TOA tahlili, antiviral bileşiğin eklendiği zaman noktasının virüs enfeksiyonunu önleme kapasitesi üzerindeki etkisini ölçer ^{29 , 31} . Referans bileşikleri olarak HIV-1 füzyon inhibitörü T20 ve ters transkripsiyon inhibitörü Efavirenz'i kullandık. Ortaya çıkan Ci profili, zaman noktalarında füzyon inhibitörü T20 için gözlemlenenden bile daha erken inhibisyon kaybı gösterir ( Şekil 3A)), Ci'nin HIV-1 replikasyon döngüsünde çok erken bir adımı engellediğini gösterir. Bu ayrıca, Ci ekstraktı ve ters transkriptaz inhibitörü Efavirenz ile birlikte tedavi edilen HIV'e maruz kalan hücrelerde hücre ile ilişkili genomik viral RNA'nın tespit edilememesi ile desteklenir (Şekil 3B ). Figür 3
Cistus incanus özü, hücrelerin HIV tarafından istila edilmesini engeller.

( A ) Ci ekstraktının antiviral aktivitesi, HIV replikasyon döngüsünün çok erken bir aşamasını inhibe eder. Eklenme zamanı (TOA) tahlilleri, Cistus incanus (Ci) ekstresi veya referans inhibitörler T20 (virüs-hücre füzyonu) ve Efavirenz (ters transkripsiyon) ile yapıldı. Her bir zaman noktası, üçlü oyuklarda test edildi ve enfeksiyon seviyeleri, işlenmemiş kültürlerinkilere (=%100) normalleştirildi. Semboller, ortalama değerleri ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını gösterir. ( B ) Ci ekstresi, genomik HIV RNA'nın hücrelere verilmesini engeller . _{LC5-CD4 kültürleri HIV-1 LAI'ye} maruz bırakıldıyokluğunda (Ci yok) veya 100 μg/ml tam Ci ekstraktı (Ci) veya Ci-türevi polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyon (CiPP) varlığında 4 saat boyunca. Efavirenz, hedef hücrelerde HIV ters transkripsiyonunu bloke etmek için dahil edilmiştir. 4 saatlik virüs maruziyetinden sonra kültürlerden RNA izole edildi, cDNA üretildi ve kantitatif PCR analizi için kullanıldı. HIV-1 dizilerinin seviyeleri, RNA polimeraz II referans dizileriyle ilişkiliydi. Veriler, HIV-1'e maruz kalan kültürlerdeki HIV-RNA genomlarının arka plana göre normalize edilmiş (yani virüs yok) nispi seviyeleri olarak ifade edilir. Her çubuk, 3 virüse maruz kalma deneyinin ortalama sonuçlarını temsil eder. Hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. ( C , D ) Ci ekstraktı virüs partiküllerinin hücrelere tutunmasını engeller. Ci veya CiPP'nin GFP etiketli HIV-1 virüs partiküllerinin LC5-RIC hücrelerine bağlanması üzerindeki etkisini analiz etmek için dönen disk konfokal mikroskopisi kullanıldı. Hücreler 4 saat virüse maruz bırakıldı. Füzyon inhibitörü T20, virüsün hedef hücrelere girişini bloke etmek için dahil edildi. Kontroller, Ci (bağlanma kontrolü) olmadan virüse maruz kalan hücrelerden ve maruz kalmayan hücrelerden (arka plan) oluşuyordu. Hücre çekirdekleri DAPI boyaması ile görselleştirildi. ( C ) Hücre ile ilişkili GFP noktalarının kantitatif analizi. 4 görüntüden 60 hücre ile ilişkili GFP sinyalleri, her örnek için analiz edildi. Çubuklar, hücre başına GFP sinyallerinin ortalama değerlerini temsil eder ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. ( D ) Her örnek için temsili görüntüler. Ölçek çubukları: 20 mikron.

Tam boyutlu resim
^{Daha sonra, daha önce 15} tarif edildiği gibi , GFP etiketli HIV-1 parçacıkları (HIV-1 NL4-3 Gag-iGFP ³² ) ve dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak, virüs parçacıklarının konakçı hücrelere bağlanması üzerindeki Ci ekstraktının etkisini değerlendirdik . Virüs eki, virüs-hücre ilişkisini maksimize etmek için T20 varlığında test edildi. Beklendiği gibi, çok sayıda yeşil flüoresan, hücre ile ilişkili nokta, Ci'nin yokluğunda görülebiliyordu ve bu, virüs partiküllerinin konakçı hücrelere eklendiğini doğruladı ( Şekil 3C,D Ek kontrolü). Buna karşılık, Ci ekstraktı ile tedavi, hücre başına GFP sinyallerinin sayısını (Ci ekstraktı ve CiPP) güçlü bir şekilde azalttı; bu, Ci ekstraktının virüs partiküllerinin konak hücrelerle birleşmesini engellediğini gösterir.

Birlikte bu sonuçlar, Ci ekstraktının viral partiküllerin hücrelere bağlanmasını bloke ettiğini ve böylece konakçı hücrelere viral girişi engellediğini göstermektedir. Ci ekstraktının antiviral aktivitesi, HIV zarf proteinlerini hedefler

Antiviral Ci bileşenlerinin virüs parçacıklarını mı yoksa konakçı hücreleri mi hedeflediğini doğrulamak için, enfeksiyondan önce hücreleri veya virüs parçacıklarını Ci ekstraktı ile önceden inkübe ettik. LC5-RIC hücrelerinin Ci ekstresi ile ön inkübasyonunun virüs enfeksiyonu üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır ( Şekil 4A ). Buna karşılık, virüs partiküllerinin Ci ile ön inkübasyonu, enfeksiyonu güçlü bir şekilde azalttı ve hücrelere Ci ekstraktı ve virüsün eş zamanlı eklenmesiyle elde edilenlerden bile daha düşük enfeksiyon seviyeleri sağladı (yani, standart tahlil koşulları). Bu sonuçlar, Ci ekstraktının doğrudan virüs partiküllerini etkilediğini göstermektedir. Şekil 4
Cistus incanus ekstraktının HIV-inhibitör aktivitesi seçici olarak viral zarf proteinlerini hedefler.

( A ) Ci ekstraktının antiviral bileşenleri virüs partikülleri ile etkileşir ancak hücreleri hedef almaz . _{Grafik, virüs inokulumunun (HIV-1 LAI} ) veya hedef hücrelerin (LC5-RIC) Ci ekstraktı ile ön inkübasyonunun anti-HIV-1 aktivitesi üzerindeki etkilerini göstermektedir . Kontrol olarak antiviral aktivite, hücrelere eş zamanlı olarak virüs aşısı ve Ci özütünün eklendiği standart koşullar altında test edildi. Semboller, üç kopya halinde analiz edilen her ekstrakt seyreltmesi için ortalama değerleri ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını belirtir. Ci ekstraktı ile işlenen kültürlerin enfeksiyon değerleri, işlenmemiş kültürlere göre ifade edilir (= %100 enfeksiyon). ( B ) Ci tedavisi, virüs partiküllerinin heparine bağlanmasını bloke eder._{Virüs yakalama deneyleri heparin boncukları ve HIV-1 LAI} içeren virüs numuneleri ile (virüs + Ci) veya Ci ekstraktı olmadan (yalnızca virüs) inkübe edilerek gerçekleştirilmiştir . Yakalanan virüs boncuk fraksiyonunda (sol panel) ve elüatta (sağ panel) Gag-p24 ELISA ile ölçüldü. Ci ile muamele edilmiş virüs numunelerinden yakalanan Gag-p24 antijen seviyeleri, muamele edilmemiş kontrol numunelerinden yakalanan Gag-p24 antijen seviyelerine (=%100) göre ifade edilir. Farklı miktarlarda virüsle gerçekleştirilen iki bağımsız yakalama deneyinin sonuçları gösterilmiştir. Gag-p24 seviyeleri, kontrol numunesi için ölçülen değerlere normalleştirildi (yalnızca virüs = %100). Sütunlar ortalama değerleri ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını belirtir (nd = tespit edilmedi). ( C )Ci ile muamele edilmiş virüs partikülleri, virüs zarflarındaki hücre kaynaklı CD44 proteinlerine bağlanan antikorlar tarafından yakalanır . _{Virüs yakalama deneyleri, anti-insan CD44 antikorları ile konjüge edilmiş mikro boncuklar ve (virüs + Ci) ile veya Ci özütü olmadan (yalnızca virüs) inkübe edilmiş HIV-1 LAI} virüs numuneleri ile gerçekleştirildi . Yakalanan virüsün seviyeleri, elüatın (soldaki grafik) Gag-p24 ELISA'sı ile belirlendi. Yakalanan virüsün enfektivitesi, LC5-RIC hücreleri (sağ grafik) ile belirlendi. Çubuklar, her numune için 3 kopyanın ortalama sonuçlarını ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını temsil eder.

Tam boyutlu resim
Ci ekstraktının HIV-1 zarf glikoproteinlerini hedefleyip hedeflemediğini araştırmak için, virüs partiküllerinin Ci ekstraktı ile işlenmesinin HIV-1 partiküllerinin heparin tarafından yakalanmasını etkileyip etkilemediğini analiz ettik. HIV-1'in heparine bağlanmasına viral zarf proteini gp120 aracılık eder (33'te gözden geçirilmiştir ⁾ . Heparin afinite kromatografisi için HIV-1 stokları, heparin boncukları ile inkübe edildi ve yüksek tuz tamponuyla yıkanarak elute edildi. Virüs yakalama, heparin boncukları ve elüattaki HIV-1 antijeninin (Gag-p24) miktarının belirlenmesiyle belirlendi. Virüs antijeni boncuk fraksiyonunda veya Ci ile işlenmiş HIV-1 ile gerçekleştirilen virüs yakalama deneylerinin elüatında saptanmadı, oysa virüs antijeni, işlenmemiş virüs örnekleriyle gerçekleştirilen yakalama tahlilleri için kolayca saptandı (Şekil 4B )). Bu sonuçlar, Ci tedavisinin heparine gp120 aracılı bağlanmasını bloke ettiğini gösterir.

Daha sonra, Ci bileşenlerinin viral zarftaki hücre kaynaklı proteinleri de hedefleyip hedeflemediğini araştırdık. CD44 konak proteininin HIV zarflarına dahil edildiği bilinmektedir (34'te gözden geçirilmiştir ⁾ ve anti-CD44 antikorlarına bağlanma, enfeksiyöz virüs partiküllerini saflaştırmak için bir yöntem olarak kullanılır. Bu nedenle, CD44-pozitif hücreler (LC5-RIC) tarafından üretilen virüs parçacıkları ve CD44'e karşı antikorlara konjüge edilmiş manyetik mikro boncuklar ile virüs yakalama deneyleri gerçekleştirdik. Yakalanan virüs parçacıklarının miktarı HIV-1 Gag-p24 ELISA ile ölçüldü ve enfeksiyöz virüs parçacıklarının seviyeleri LC5-RIC haberci hücrelerle belirlendi. Şekil 4C'de gösterildiği gibi, virüs parçacıkları, hem Ci ile işlenmiş hem de işlenmemiş virüs örneklerinden anti-CD44 mikro tanecikleri tarafından yakalandı. Bununla birlikte, Ci ile işlenmiş örneklerden yakalanan virüs, işlenmemiş örneklerden yakalanan virüse kıyasla güçlü bir şekilde azalmış enfektivite gösterdi.

Bu sonuçlar, Ci bileşenlerinin, virüs zarfını hedefleyerek ve viral gp120 zarf proteininin bağlanma aktivitesini inhibe ederek virüs enfektivitesini bloke ettiğini, ancak virüs parçacığında konakçı hücreden türetilmiş CD44 proteini ile etkileşime girmediğini gösterir. Ci ekstresi, anti-HIV aktivitesine sahip birden fazla bileşen içerir

Ci ekstraktında anti-HIV aktivitesi sergileyen bileşiklerin karmaşıklığını ölçmek için Ci ekstraktı, biyoanaliz kılavuzluğunda fraksiyonlamaya tabi tutuldu. ^{Ci özü, karmaşık bitki özlerinin 35} dekonvolüsyonu için doğrulanmış çok adımlı bir prosedürle ayrıldı . İlk olarak, Ci ekstraktından 96 fraksiyonluk bir set hazırlandı. Bu fraksiyonlar, tüm fraksiyonların (5 ug/ml) tek doz testi ve ardından en aktif fraksiyonların 45'inin anti-HIV aktivitesinin doza bağımlı analizi ile anti-HIV aktivitesi açısından değerlendirildi. Birkaç potansiyel aktivite kümesi tanımlandı, bunlardan biri örnek teşkil edecek şekilde ince fraksiyonasyona tabi tutuldu ( Şekil 5A ). _{Anti-HIV aktivitesi, EC 50} veren birkaç ince fraksiyonla bu kümeden türetilen ince fraksiyonların çoğu için gösterilmiştir.5 ug/ml'nin altındaki değerler ( Şekil 5B ). Yüksek antiviral aktiviteye ve yapı aydınlatması için elverişli özelliklere dayalı olarak daha fazla saflaştırma için ince fraksiyon F seçildi ve yüksek çözünürlüklü fraksiyonlar F1-F9 elde edildi. Bu yüksek çözünürlüklü fraksiyonların ( Şekil 5C ) antiviral aktivitelerinin test edilmesi, yüksek anti-HIV aktivitesine (EC50 < 1.1 ug/ml) sahip iki adayı (F-3, F-4) ortaya _çıkardı  . Son olarak, yüksek çözünürlüklü fraksiyon F-4'ün HPLC analizi tek bir tepe noktası verdi (%99 saflık). Şekil 5
Cistus incanus (Ci) ekstraktının yinelemeli fraksiyonlanması sırasında anti-HIV aktivitesinin profili, çoklu aktif bileşikleri ortaya çıkarır.

( A ) Ci ekstraktının ilk ayrılması sırasında elde edilen 45 yüksek aktiviteli fraksiyonun anti-HIV aktivite profili . Yüksek aktiviteli fraksiyonlar A4-D12, ilk ayırma adımında üretilen 96 fraksiyonluk bir setin tek doz anti-HIV taramasıyla belirlendi. _{Tarama, LC5-RIC hücreleri ve HIV-1 LAI} ile yapıldı . Her bir yüksek aktiviteli fraksiyonun anti-HIV aktivitesinin ölçülmesi için, hücreler, 100 ug/ml ila 3,125 ug/ml (2-kat seri dilüsyonlar) ve EC arasında değişen fraksiyonun farklı konsantrasyonlarının varlığında virüse maruz bırakıldı. ₅₀ değer belirlendi. _{Semboller ortalama EC 50'yi} belirtirher bir fraksiyon için üçlü testlerin değerleri ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. Çerçeve, A8 –A12 kesirlerinden oluşan örnek bir etkinlik kümesini işaretler. ( B ) A'da tanımlanan örnek aktivite kümesinden türetilen ince fraksiyonların anti-HIV aktiviteleri (A8-A12 fraksiyonları). Aktivite kümesi, daha sonra anti-HIV aktivitesi için test edilen ince AM fraksiyonlarını veren ikinci bir fraksiyonasyon adımına tabi tutuldu. Çubuklar, her bir fraksiyon için 3 bağımsız tahlilin ortalama değerlerini ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. #: Ölçülen konsantrasyonlarda antiviral aktivite saptanmadı. ( C ) İnce fraksiyon F'den türetilen yüksek çözünürlüklü fraksiyonların anti HIV aktiviteleri.İnce fraksiyon F, üçüncü bir fraksiyonasyon aşamasına tabi tutularak, anti-HIV aktivitesi için tekrar test edilen yüksek çözünürlüklü F1 ila F9 fraksiyonları elde edildi. Çubuklar, her bir fraksiyon için 3 bağımsız tahlilin ortalama değerlerini ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. #: En yüksek konsantrasyonda antiviral aktivite saptanmadı.

Tam boyutlu resim
Bu sonuçlar, Ci ekstraktının, kimyasal ekstrakt dekonvolüsyonu ile ayrılabilen çoklu anti-HIV bileşikleri içerdiğini göstermektedir. Uzun süreli geçiş sırasında Ci-dirençli HIV çıkışı yok

_{Uzun süreli Ci tedavisi sırasında dirençli virüslerin potansiyel ortaya çıkışını araştırmak için, HIV-1 LAI'yi} LC5-RIC hücrelerinde Ci varlığında birçok kez pasajladık ve pasajlanan virüsün Ci'ye duyarlılığını düzenli aralıklarla test ettik. _{48 enfeksiyon turu (=24 hafta) gerçekleştirildi ve her enfeksiyon turu için HIV-1, Ci ile 24 saat boyunca EC 50} veya EC _90'a karşılık gelen konsantrasyonlarda inkübe edildi , ardından virüs için Ci olmadan 2-3 gün inkübasyon yapıldı. büyüme Aşırı büyüme virüsünün Ci ekstraktı tarafından inhibisyona duyarlılığı, her ikinci enfeksiyon turundan sonra analiz edildi. Bu prosedür, kontrol olarak Ci olmadan da gerçekleştirildi.

Şekil 6'da gösterildiği gibi virüs, tüm gözlem süresi boyunca kararlı bir seviyede Ci tedavisine duyarlılığı korudu. Ci ekstraktının varlığında üretilen virüsün duyarlılığı, Ci tedavisi yokluğunda üretilen virüsün duyarlılığı ile karşılaştırılabilirdi. Bu sonuçlar, uzun süreli Ci tedavisinin Ci dirençli virüslerin ortaya çıkmasına neden olmadığını göstermektedir. Şekil 6
Cistus incanus ekstraktının varlığında uzun süreli virüs geçişi sırasında HIV-1 direncinin ortaya çıkmaması .

Virüs, 48 pasaj (yani 24 hafta) boyunca Ci ekstraktı olsun ya da olmasın pasajlandı ve her hafta Ci ekstraktı tarafından inhibisyona duyarlılık açısından izlendi. Ci ekstraktı ile her pasaj için, LC5-RIC hedef hücreleri bir gün boyunca Ci ekstraktı varlığında HIV-1 _LAI virüsüne maruz bırakıldı , ardından kaçış virüsünün Ci ekstraktı olmadan 2-3 gün genişlemesi izledi. Uzun süreli virüs pasajı , ilk virüs aşılamasına karşı EC50 (CiEC 50 çizgi grafiği) veya EC 90 (CiEC 90 çizgi grafiği) inhibe edici konsantrasyonlara _karşılık gelen _iki konsantrasyonda _Ci ekstraktı _ile gerçekleştirildi . _{Daha yüksek Ci ekstrakt konsantrasyonu (CiEC 90)} varlığında pasajlama), daha düşük Ci ekstraktı konsantrasyonu ile 6 haftalık geçişten sonra toplanan virüs ile başlatıldı. Virüs, kontrol olarak Ci ekstraktı olmadan paralel olarak pasajlandı (yalnızca virüs çizgi grafiği). Her ikinci pasajdan toplanan virüs, Ci özütünün farklı konsantrasyonlarda (100 μg/ml ila 3.125 μg/ml; iki katlı seri dilüsyonlar) veya özütsüz (=%100 enfeksiyon) olduğu enfeksiyon deneylerinde Ci özü tarafından inhibisyon açısından değerlendirildi. Semboller, üç bağımsız deneyde her virüs numunesi için belirlenen ortalama EC50'yi ve hata çubukları ortalamanın standart sapmasını temsil _eder .

Tam boyutlu resim Ci özü ayrıca Filovirüs zarf proteinlerini de hedefler

Bu çalışma, Ci ekstraktının antiviral aktivitesinin HIV-1 ve HIV-2'ye yönelik olduğunu göstermektedir. Daha önce bildirilen Influenza A virüsünün ^{21 , 26} inhibisyonu ile birlikte , bu sonuçlar, Ci ekstraktının birden fazla ilgisiz virüse karşı antiviral aktiviteye sahip olduğunu kuvvetle önerir. Ci tarafından inhibe edilen virüslerin spektrumunu daha fazla araştırmak için Ci ekstraktının Ebola virüsü (EBOV) ve Marburg virüsü (MARV) zarf glikoproteinlerini de hedefleyip hedeflemediğini araştırdık. Bu amaçla, zarflarında HIV-1 gp120 yerine Ebola virüsü Zaire alt türlerini (ZEBOV) veya MARV glikoproteinlerini ^{36 , 37} taşıyan psödotiplenmiş HIV-1 viryonları ürettik . Şekil 7A'da gösterildiği gibi, tüm Ci özütünün yanı sıra Ci türevli polifenoller (CiPP), ZEBOV ve MARV psödotipli virüslerin neden olduğu enfeksiyonu inhibe etti ( Şekil 7A ). Psödotiplenmiş virüs proteinlerine karşı antiviral aktiviteler, doğal HIV-1 gp120'ye sahip viryonlar için elde edilenlerle karşılaştırılabilirdi ( Şekil 7A , 1 ve 2'yi karşılaştırın ). Buna karşılık, ZEBOV ve MARV psödotipli virionlar, HIV-1 füzyon inhibitörü T20'den, EASY-HIT sisteminde T20 için önceden belirlenen EC50 değerinden _{yaklaşık 100 kat daha yüksek olan 500} ^nM'lik konsantrasyonlara kadar etkilenmemiştir29 . GFP etiketli ZEBOV sözde tip virüsleri kullanarak, Ci özütünün virüslerin hücrelere bağlanmasını engellediğini gösterdik ( Şekil 7B). Ayrıca küme 1 ve küme 2'den üretilen ince fraksiyonların ayrıca ZEBOV sözde tip virüs enfeksiyonunu önlediğini ve doğal gp120 taşıyan HIV-1 parçacıklarıyla elde edilene benzer bir aktivite profili verdiğini bulduk (Şekil 7C; Şekil 5B ile karşılaştırın ) ). Şekil 7
Cistus incanus (Ci) psödotiplenmiş lentivirüs partiküllerinde blok Filovirüs zarf proteinlerini özütler.

Filovirüs zarf glikoproteinleri ile psödotiplenmiş lentivirüs partikülleri, bir env -defektif HIV-1 provirüsü (pBR-NL43-Gag-iGFP-Δenv) içeren bir plazmid ve Zaire Ebola virüsünden (ZEBOV-) bir zarf glikoproteini kodlayan plazmitler ile birlikte transfekte edilmiş hücreler tarafından üretildi. GP) veya Marburg Virüsü (MARV-GP). ( A ) Ci ekstraktı ve Ci ekstraktının (CiPP) polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyonu, Ebola virüsü (sol panel) veya Marburg virüsünden (sağ panel) zarf proteinleri ile psödotiplenmiş virüs partikülleri tarafından hücrelerin enfeksiyonunu inhibe eder.LC5-RIC hücreleri, 50 ug/ml ila 1.56 ug/ml (seri 2-kat seyreltmeler) arasında değişen farklı konsantrasyonlarda Ci ekstraktı yokluğunda veya varlığında psödotiplenmiş lentivirüs partiküllerine maruz bırakıldı. HIV-1 füzyon inhibitörü T20 paralel olarak test edildi (500 nM ila 15.63 nM). Doz-yanıt eğrileri gösterilmiştir. EC _50, Ci ve CiPP için belirtilmiştir. T20 için yıldız işareti (*), test koşulları altında psödotiplenmiş virüs partiküllerine karşı antiviral aktivitenin olmadığını gösterir. Semboller, üçlü kopyaların ortalama değerlerini ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını belirtir. ( B ) Ci ve CiPP, psödotiplenmiş virüs partiküllerinin hücrelere birincil bağlanmasını önler.Ebola virüsü Zaire için zarf glikoproteinleri ile psödotiplenmiş GFP etiketli virüs partikülleri ile bağlanma deneyleri yapıldı. Hücrelerle ilişkili GFP sinyalleri, dönen disk konfokal mikroskopi ve Volocity 6.2.1 görüntüleme yazılımı ile ölçüldü. Her örnek için 4 görüntüdeki 60 hücre analiz edildi. Çubuklar, hücre başına GFP sinyallerinin ortalama değerlerini temsil eder ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir. ( C ) Ci ekstraktının yinelemeli fraksiyonlanması sırasında üretilen ince AM fraksiyonları (bkz . Şekil 5B ), psödotiplenmiş virüs partiküllerinin neden olduğu enfeksiyonu inhibe eder. Antiviral aktivite, sabit dozda Ci ekstraktı (10 μg/ml) ile test edildi. Çubuklar, her bir fraksiyon için üçlü testlerin ortalama değerlerini ve hata çubukları, ortalamanın standart sapmasını gösterir.

Tam boyutlu resim
Birlikte bu sonuçlar, Ci ekstraktının antiviral aktivitesinin HIV-1 gp120 ile sınırlı olmadığını, aynı zamanda Ebola virüsü ve Marburg virüsü zarf glikoproteinlerine kadar uzandığını ve bu viral proteinlerin enfeksiyona aracılık etmesini önlediğini göstermektedir. Tartışma

Küresel ölçekte akut ve kronik hayatı tehdit eden viral enfeksiyonların tedavisini sağlamak için güçlü, ucuz ve güvenli antiviral ajanlara acil bir ihtiyaç vardır. ^{Çeşitli şifalı bitkilerin, Herpesvirüsler, Dang Virüsleri, Hepatit B ve C virüsleri ve HIV 13 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43} gibi başlıca insan viral patojenlerini inhibe ettiği gösterilmiştir . Bu kapsamlı çalışmalara rağmen, bitkisel ürünler henüz viral enfeksiyonların küresel tedavisi için yaygın olarak bulunabilen, güvenli ve etkili tıbbi maddeler haline gelmemiştir44 ^.

Standartlaştırılmış ticari Ci özütü Cystus052 ^{® klinik testlere tabi tutulmuştur, insan sağlığına yararlı birçok biyolojik aktivite gösterir ve daha önce hücre kültüründe 26} ve bir hayvan modelinde ²¹ Influenza A virüs replikasyonunu inhibe ettiği gösterilmiştir (ayrıca bkz. Giriş). Burada Ci ekstraktının HIV ve Filovirüslere karşı güçlü antiviral etkilerini gösteriyoruz ve Ci ekstraktının viral zarf bileşenlerini hedef alarak virüs partiküllerinin hücrelere bağlanmasını engellediğini gösteriyoruz.

Ci ekstraktının (hem tam ekstrakt hem de polifenolle zenginleştirilmiş fraksiyon) anti-HIV aktivitesinin birden fazla HIV izolatı ile incelenmesi, HIV tip 1 ve tip 2 ve HIV-1 grup O dahil olmak üzere farklı ana HIV genotiplerini temsil eden klinik izolatlara karşı karşılaştırılabilir antiviral etkiler ortaya çıkardı. HIV tipleri 1 ve 2 (%50'nin üzerinde amino asit çeşitliliği) ve HIV-1 grubu M ve O (%35'in üzerinde amino asit çeşitliliği) ⁴⁵ arasındaki yüksek genetik çeşitlilik nedeniyle bu bulgu beklenmedikti . Ayrıca, HIV-2 ve HIV-1 grup O, birkaç onaylı anti-HIV ilaca HIV-1 grup M'den daha az duyarlıdır. Bu nedenle HIV-2, T20'ye (Efavirenz) ve HIV-1 grup O, çeşitli entegrelere karşı doğal olarak dirençlidir ve nükleosid olmayan ters transkriptaz inhibitörleri ^{46 , 47 , 48, 49} . Ek olarak, Ci ekstresi, Ebola veya Marburg virüsü zarf proteinlerini içeren virüs partiküllerinin neden olduğu enfeksiyonu önledi ve bu, Ci ekstresinin antiviral aktivitesinin Filovirüslerin zarf bileşenlerini de hedef aldığını gösterdi. ^{Anti-Influenza A aktivite 21 , 26} ile ilgili önceki raporlarla birlikte , bu sonuçlar Ci ekstraktının çok sayıda alakasız, majör insan viral patojenlerine (yani HIV, Marburg virüsü, Ebola virüsü, Influenza A virüsü) karşı geniş spektrumlu antiviral aktivite gösterdiğini göstermektedir.

Ci ekstraktının antiviral aktivite modunu araştırmak için tasarlanan farklı deneysel analizler, Ci ekstraktının virüs partiküllerinin konakçı hücrelerle etkileşime girmesini önlediğini ortaya çıkardı. Ci ekstraktı ile tedavi, viral RNA'nın hücrelere iletilmesini bloke ederek, Ci'nin giriş seviyesinde hareket ettiğini gösterdi. Ekleme zamanı analizleri, Ci tedavisinin viral ve hücresel zarların füzyonundan önce çok erken bir aşamada virüsün girişini bloke ettiğini gösterdi. Ayrıca Ci tedavisi, GFP etiketli virüs partiküllerinin (HIV-1 ve Ebola virüsü psödotipli) hücrelere bağlanmasını engelledi. Birlikte bu sonuçlar, Ci tedavisinin, virüs parçacıklarının hücrelere birincil bağlanmasını önlediğini ve konakçı hücrelerin virüs saldırısına karşı maksimum koruma sağlayan bir etki mekanizması olduğunu doğrular. Tersine,^{50 , 51 , 52} . Mevcut klinik olarak onaylanmış anti HIV ilaçları koleksiyonu yalnızca iki giriş inhibitörü ³ içerir , yani füzyon inhibitörü T20 ve CCR5 ko-reseptör blokeri Maraviroc. Onaylanan ilaçların çoğu, HIV enzimlerini, yani proteaz, ters transkriptaz ve birkaç integraz inhibitörünü hedefler. Ci ekstresi HIV'i farklı bir etki şekliyle inhibe ettiğinden, yaygın olarak kullanılan ilaçlara dirençli virüsleri inhibe edebilmelidir. Gerçekten de, Ci ekstraktının , tüm onaylı proteaz ve ters transkriptaz inhibitör ilaçlarına direnç kazandıran mutasyonlar ileçok dirençli bir HIV-1 izolatının (HIV-1 _{V13-03413 )} in vitro replikasyonunu etkili bir şekilde bloke ettiğini gösterdik

Bu çalışma aynı zamanda Ci ekstraktının antiviral bileşenlerinin viral zarf proteinlerini hedef aldığına ve viral yerine hücresel bileşenler için seçicilik gösterdiğine dair kanıt sağlar. Ön inkübasyon tahlilleri, Ci ekstraktının antiviral bileşenlerinin spesifik olarak virüs partiküllerini hedeflediğini ancak konakçı hücreler tarafından tutulmadığını doğruladı. Ci ekstraktının antiviral aktivitesinin virüs seçiciliği için daha fazla destek, bu çalışmada gerçekleştirilen HIV-1 virüs yakalama deneylerinden gelir; - antikor ligandı ile hücreden türetilmiş CD44 proteini. Virüs partiküllerinde gp120'nin seçici olarak bloke edilmesi, ancak CD44 proteininin bloke edilmemesi, Ci ekstraktının bileşenlerinin, tüm virüs partiküllerini spesifik olmayan bir şekilde sarmak yerine viral zarflar üzerinde gp120'yi spesifik olarak maskelediğini göstermektedir.

Sadece HIV-133 değil ^, diğer pek çok ilgisiz virüs, hücrelere birincil bağlanma için proteoglikanların heparin ve heparan sülfat parçalarını kullanır. Filovirüslere ek olarak bunlar, Herpes virüslerini ve Hepatit B ve C virüslerini içerir ^{53 , 54 , 55 , 56} . Ci ekstraktının, viral bileşenlerin bağlanma için çok sayıda virüs tarafından kullanılan hücre kısımlarına bağlanmasını bloke ettiğine dair bulgumuz, Ci ekstraktının farklı virüslere karşı geniş aktivitesi için daha fazla destek sağlar. ^{Son zamanlarda, yeşil çaydan elde edilen tek moleküllü bir doğal ürünün ,} farklı virionların heparan sülfat glikanlara birincil bağlanmasını engellediği de bildirilmiştir57, virüsün hücrelere bağlanmasını engelleyen geniş spektrumlu doğal ürünlerin ortaya çıktığına dair kanıt sağlıyor. HIV ile ilgili olarak, gp120'nin hedeflenmesi, Ci ekstraktının hücreleri, HIV girişinin ötesine geçen gp120-hücre etkileşimlerinin zararlı sonuçlarından da koruyabileceğini düşündürmektedir. Bunlar, anormal sinyal olaylarının ^{58 , 59} , T-hücrelerinin ⁶⁰ apoptozunun ve nöronal hasarın ^{61 , 62} indüklenmesini içerir .

Ci ekstraktının virüs direncini indükleme eğilimini araştırmak için tasarlanan hücre kültürü deneyleri, HIV-1'in Ci ekstraktının mevcudiyetinde 24 hafta (=168 gün) pasajlanması sırasında Ci-dirençli virüsün aşırı büyümesini ortaya çıkarmadı. Buna karşılık, virüs direnci riskinin, tek bileşikli bağlanma inhibitörü Fostemsavir (BMS-663068) ⁶³ için çok daha yüksek olduğu bildirilmiştir . Bu nedenle, hücre kültüründe 14 günlük seçim, Fostemsavir'e dirençli HIV-1 _{LAI virüsleri ve HIV-1 LAI'de} tek bir amino asit ikamesi oluşturmak için yeterliydi.Env direnç için yeterliydi. Biyoanaliz kılavuzlu fraksiyonlama çalışmaları, Ci ekstraktında çoklu antiviral bileşiklerin varlığını gösterir. Aktif moleküllerin bu kombinasyonu, muhtemelen, tek bileşikli antiretroviral ilaçlarla tedaviye kıyasla, Ci tedavisi sırasında dirençli virüslerin ortaya çıkma riskinin düşük olmasından sorumludur.

Bu çalışma, hücre kültürü koşulları altında Ci ekstraktının güçlü ve geniş antiviral aktivitesini göstermektedir. Ayrıca, klinik çalışmalar in vivo ^{27 , 28} Ci ekstresi için olumlu bir güvenlik profili göstermiştir . Bu gözlemler, Ci ekstraktının antiviral aktivitelerinin daha fazla araştırılmasını desteklese de, bu çalışmada sunulan sonuçlara dayanarak Ci ekstraktının ilaç olarak kullanılmasını savunmadığımızı belirtmek önemlidir. Ci ekstraktının in vivo potansiyelinin değerlendirilmesiantiviral terapötik uygulamalar, kapsamlı gelecek araştırmaları gerektirir. Bu yöndeki önemli bir adım, Ci ekstraktından bireysel antiviral ajanların tanımlanması ve bunların farmakokinetik özelliklerinin analizi olacaktır. Ci ekstraktının in vivo uygulamasının araştırılması için başka bir yol, HIV bulaşmasının ⁶⁴ cinsel yolla bulaşmasını önlemek için topikal mikrobisitler olarak potansiyel kullanımıdır . Antiviral aktivitenin bu çalışmada bulunan düşük pH ve yüksek sıcaklıklara direnci, Ci ekstraktının topikal uygulamalar için keşfini destekleyen cesaret verici özellikleridir.

Son olarak Ci ekstraktı, yeni antiviral ajanların madenciliği için bir kaynak da sağlayabilir. Bu nedenle, doğal ürünler, sınırlı kimyasal çeşitlilik de dahil olmak üzere sentetik kitaplıkların çeşitli kısıtlamalarının üstesinden geldikleri için ilaç keşfi için yeniden popülerlik kazanıyor ⁶⁵ . Ayrıca, 1981'den 2010'a kadar FDA tarafından onaylanan ilaçların %34'ünün ya doğal ürünlere dayalı ya da bunlardan türetilmiş olmasıyla, doğal ürünlerin geçmişte ilaç geliştirmede çok başarılı öncüler olduğu ^{kanıtlanmıştır66}. Antiviral aktivitenin Ci ekstraktından polifenolik bileşiklerin zenginleştirilmesiyle izole edilebileceğini ve çok sayıda sıralı fraksiyonlama adımı boyunca korunduğunu gösterdik. Bu, azaltılmış karmaşıklığa sahip aktif ajanların Ci ekstraktından üretilebileceğini gösterir. Kompleks veya basitleştirilmiş Ci ekstraktından tek aktif bileşiklerin tanımlanması, yeni antiviral ajanlara yol açabilir ve ayrıca klinik çalışmalarda Ci türevli antiviral ajanların farmakolojik özelliklerinin izlenmesi için imza molekülleri sağlayabilir. Çözüm

Ci özü, geniş antiviral aktiviteyi düşük virüs direnci riski ile birleştirir. Etki mekanizması, viral zarf glikoproteinlerinin seçici olarak hedeflenmesiyle hücrelere birincil virüs bağlanmasının bloke edilmesini içerir. Bunun aksine, geniş spektrumlu antiviral aktiviteye sahip diğer birçok doğal ürün, konakçı hücre bileşenlerini ⁶⁷ hedef alır . Sonuçlarımız, Ci ekstraktı içindeki çoklu antiviral bileşenlerin konakçı hücreye virüs ekini bloke ettiğini göstermektedir. Toplamda, bu çalışmada gösterilen Ci ekstraktının geniş ve güçlü in vitro antiviral etkileri, Ci ekstraktının ve bileşenlerinin yeni antiviral yaklaşımlar için daha fazla araştırılmasını desteklemektedir. Malzemeler ve yöntemler

Virüsler ve virüs üretimi

^{HIV-1 stoklarının üretimi ve miktarının belirlenmesi, 15 , 29'da} açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir . Kısaca, HIV-1 laboratuvar izolatlarının stokları, HEK 293 T hücrelerinin, NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH: pLAI.2 (Dr. Keith Peden ⁶⁸ ), pNL(AD8) (Dr. Eric O. Freed'den ⁶⁹ ). ^{GFP etiketli virüsler, pBR-NL43-Gag-iGFP 32} ile transfeksiyon yoluyla üretildi . Zarfta CD44 bulunan viryonlar, LC5-RIC hücrelerinin (yüzey CD44 için pozitif) HIV-1 _{LAI ile enfekte edilmesiyle üretildi}virüs. Virüs içeren hücre kültürü süpernatanları, transfeksiyon/enfeksiyondan 72 saat sonra toplandı ve -80 °C'de saklandı. ^{Virüs stoklarındaki virüs seviyeleri, Gag-p24 antijen enzimine bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) (Advanced Bioscience Laboratories, Maryland) ve 29'da} açıklandığı gibi LC5-RIC hücreleri üzerinde titrasyon yoluyla nicelleştirildi .

Primer klinik HIV izolatları HIV-1M _MVP899-87 , HIV-10 _MVP5180-91 HIV-2 _MVP10668-93 ve HIV-1 _{V13-03413B ,} ^70'te açıklandığı gibi elde edildi . Çoklu dirençli izolat HIV-1 _V13-03413Bvirolojik tedavi başarısızlığı olan bir hastadan elde edilmiş ve dizi analizi ile ters transkriptaz (RT) ve proteazı (PR) kodlayan bölgelerde çoklu ilaç direnci mutasyonları içerdiği gösterilmiştir. RT: T69I, V75I, L100I, K103N, Y115F, V118I, Q151M, V179L, M184V, L210F, K219E, H221Y; PR: L10I, V11I, K20R, V32I, L33F, E35D, M46I, I54L, Q58E, A71V, G73T, V82A, I84V, L90M. Klinik izolatların üretimi için, hücre kültürü süpernatanı içeren virüste HIV ile enfekte H9 hücrelerinin donmuş stokları eritildi ve 6 hücre pasajı için kültürlendi. Her üç ila dört günde bir, enfekte olmuş hücre popülasyonunun yaklaşık yarısı, enfekte olmamış H9 hücreleri ile değiştirildi ve enfekte olmuş hücre popülasyonunun kültür süpernatanının yaklaşık %60-70'i taze ortam ile değiştirildi.²⁹ . HIV inhibisyon deneyleri, inhibitörlerin yokluğunda LC5-RIC haberci kültürlerin nispi flüoresan sinyal yoğunluklarında en az 100 kat artış sağlayan virüs aşılama hacimleriyle gerçekleştirildi.

^{Ebola veya Marburg virüsü glikoprotein psödotipli virüsünün üretimi için HEK293T hücreleri, HIV omurga plazmidi pBR-NL43-Gag-iGFP-Δenv 71} ve glikoprotein ekspresyon plazmitleri pCAGGS-ZEBOV-V5 ³⁶ veya pCAGGS-Marv- ile birlikte transfekte edildi. V5 ³⁷ ve psödotiplenmiş virüs partikülleri, transfeksiyondan 72 saat sonra toplandı ve -80 °C'de saklandı. Hücreler ve hücre kültürü

Yapışkan şekilde büyüyen hücre çizgileri (HEK293T, LC5-türevleri), %10 FCS ve %1 antibiyotik-antimikotik solüsyon (Gibco® Life Technologies, ABD) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamında (DMEM; Gibco® Life Technologies, ABD) kültürlendi. H9 hücreleri, %10 FCS ve %1 antibiyotik-antimikotik solüsyon (Gibco® Life) ile desteklenmiş Çok Düşük Endotoksin Roswell Park Memorial Institute-1640 Ortamında (VLE-RPMI 1640; Gibco® Life Technologies, ABD) süspansiyon içinde kültürlendi. Teknolojiler, ABD). Tüm hücreler standart koşullar altında tutuldu (37 °C; %5 C02 ₎ .

İnsan embriyonal böbrek hücre hattı HEK293T (ATCC®-Numara CRL-11268) ve insan T-lenfoma hücre hattı H9 (ATCC®-Numara HTB-176) ATCC aracılığıyla elde edildi. LC5 hücre çizgisi, HeLa hücrelerinden türetilmiştir. ^{LC5-CD4, LC5-RIC ve LC5-RIC-R5'in üretimi, özellikleri ve kültürü 15 , 29 , 72'de} ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.. Kısaca, LC5-CD4 hücreleri, insan CD4 ve neomisin direncinin ekspresyonu için kararlı bir şekilde entegre edilmiş sekanslar içerir. LC5-RIC hücreleri, HIV-1 Tat ve Rev'in kontrolü altında bir DsRed-raportör geninin stabil entegrasyonu ve higromisin B direnci için sekanslar ile LC5-CD4 hücrelerinden türetilmiştir. LC5-RIC-R5 hücreleri, LC5-RIC hücrelerinden, bir insan CCR5 kodlayan cDNA'nın ve puromisin direncine yönelik dizilerin kararlı entegrasyonuyla türetildi. LC5'ten türetilmiş hücre çizgileri, düzenli aralıklarla uygun antibiyotiklerle kültürlendi.

Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC), daha önce Fuss ve ark. ⁷³ _ Hücreler daha sonra yıkandı ve kalan trombositleri ve eritrositleri uzaklaştırmak için amonyum klorür potasyum (ACK) tamponu (Gibco® Life Technologies, ABD) ile işlendi. Hücreler hemen gece boyunca %10 FCS ve %1 antibiyotik-antimikotik solüsyon (Gibco® Life Technologies, ABD) ve 20 U/ml hIL-2 (Roche, Almanya) ile desteklenmiş VLE-RPMI 1640 ortamında (Biochrom AG, Almanya) kültive edildi. ) ve 1 μg/ml fitohemaglutinin (PHA) (Biochrom AG, Almanya) stimülasyon için hücrelere eklendi. Hücreler, enfeksiyon için kullanılmadan önce üç gün boyunca uyarıldı. Cistus incanus ekstreleri ve fraksiyonları

Antiviral testler için kullanılan Ci ekstraktının ana kaynağı tıbbi ürün CYSTUS052® idi (Dr. Pandalis Urheimische Medizin GmbH und Co. KG, Almanya). Ek olarak, kurutulmuş Cistus incanus bitkilerinden (Cistus incanus Bio Tee, Dr. Pandalis Urheimische Medizin GmbH ve Co. KG, Almanya) ve taze bitkilerden (Cystus®, Cistus incanus ssp. Tauricus;Rühlemann's Kräuter und Duftpflanzen, Horstedt, Almanya) bitki materyalini 1 saat suda kaynatarak elde edin. Tüm Ci özütleri steril olarak filtrelendi (0,45 μm şırınga filtresi Millex®-HV, Merck Millipore, Darmstadt, Almanya), bir Eppendorf Vakum Konsantratöründe kurutuldu, kuru kütlenin ağırlığı belirlendi ve kuru kütle -20 °C'de saklandı kullanana kadar. Test için kuru kütle, tipik olarak ml başına 10 mg kuru kütle içeren stok solüsyonlarla hücre kültürü ortamında çözüldü.

Polifenoller, Helfer ve diğ. ¹⁵ . Kısaca polifenoller, polivinilpirolidona (PVPP, Sigma Aldrich) adsorbe edildi ve 0.5 N NaOH ile yıkandı. Elüatlar, HC1 ile pH 6'ya dengelendi ve bir C18 SPE kolonu (Bond Elut C18, Agilent Technologies, California, ABD) ile katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile saflaştırıldı.

Ekstrakt dekonvolüsyonu için Ci ekstraktının ayrılması, bitki ekstraktlarının konvolüsyonu için tescilli teknoloji kullanılarak Bicoll GmbH tarafından gerçekleştirildi. Antiviral aktivitelerin değerlendirilmesi için hücre bazlı deneyler

Enfeksiyon Testlerinin İnhibisyonu

Virüs enfeksiyonunun antiviral ajanlar tarafından inhibisyonunun test edilmesi için standart tahlil formatı, Kremb ve diğ. ^{15 , 29} . ^{Kısaca, LC5-RIC raportör hücreleri, 1 x 104} yoğunlukta 96 oyuklu plakalara ekilmiştir. 100 ul kültür ortamı içinde oyuk başına hücreler. 24 saat sonra, test bileşikleri ve kültür başına 10 pg Gag-p24/hücre veya ≥100 nispi flüoresans yoğunluğu artan birim ile sonuçlanan virüs aşısının uygun hacimleri hücrelere ilave edildi. Plakalar, 48 saat süreyle inkübe edildi ve kültürlerin flüoresan sinyalleri, 552/596 nm'lik uyarma/emisyon dalga boylarında bir Tecan Infinite M200 plaka okuyucusu (Tecan, Crailsheim, Almanya) ile ölçüldü. Test bileşikleri, 2 kat seri dilüsyonlar tarafından üretilen en az 6 konsantrasyonda test edildi. Kontroller, test bileşiği (=%100 enfeksiyon) olmadan virüse maruz bırakılan kültürlerden ve virüs ve bileşik içermeyen kültürlerden (=arka plan) oluşuyordu. Her bir bileşik konsantrasyonu, en az üçlü gözlerde test edildi ve altı gözde kontroller yapıldı. Floresan sinyaller, arka plan sinyalleri için düzeltildi ve bileşikle muamele edilmiş kültürlerin floresan sinyalleri, muamele edilmemiş, virüse maruz kalan kültürlerinkine normalleştirildi (=%100 enfeksiyon). Test bileşiğinin antiviral gücü, maksimum etkili konsantrasyonun yarısı (EC₅₀ ), bu da enfeksiyonun %50 inhibisyonunu sağlayacak şekilde hesaplanan konsantrasyonu belirtir.

Birincil insan hedef hücrelerinin enfeksiyonunun inhibisyonu, hIL-2 ve PHA (yukarıya bakın) içeren kültür ortamında 96 oyuklu plakalara (  göz başına 1 x ^{105 hücre) ekilen ve 24 saat kültürlenen uyarılmış PBMC'lerle test edildi.} Kültürlere virüs aşısı (10 pg Gag-p24/hücre) ve test bileşikleri eklendi (120 ul toplam kültür hacmi). Test bileşikleri, her konsantrasyon için en az 3 tekrarlı gözde farklı konsantrasyonlarda (yukarıya bakın) ve 6 tekrarlı gözde kontrollerde test edildi. 48 saat sonra, her kuyudan 20 ul kültür süpernatanı, LC5-RIC raportör hücrelere aktarıldı ve 72 saat sonra ölçülen raportör kültürlerin floresan sinyalleri. Ekleme zamanı (TOA) deneyleri

TOA tahlilleri, 96 oyuklu plakalarda LC5-RIC hücreleri ile yapıldı. Tahlil formatı, birkaç modifikasyonla pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere inhibitör güçlerini belirlemek için kullanılana benzerdi (yukarıya bakın). İnhibitörler kuyucuklara ya HIV-1 _LAI virüsü aşısı ile aynı anda (zaman noktası 0 olarak tanımlanır) ya da daha sonraki çeşitli zaman noktalarında ilave edildi ve virüs ilavesinden 48 saat sonra kültürlerin flüoresan sinyalleri belirlendi. Ci ekstraktına ek olarak, referans inhibitörler olarak T20 ve Efavirenz kullanıldı (her ikisi de NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH yoluyla elde edildi). Tam inhibisyonu sağlamak için, tedavi için kullanılan inhibitör konsantrasyonları 5 × EC50'yi _, yani 100 μg/ml Ci ekstraktı, 100 nM Efavirenz ve 500 nM T20'yi aştı.

Ön inkübasyon deneyleri , 100 ug/ml ila 3.12 ug/ml (2-kat seri dilüsyonlar) arasında değişen farklı konsantrasyonlarda Ci ekstraktı kullanılarak standart bir enfeksiyon deneyi formatında (yukarıya bakın) yapıldı. Hücrelerin Ci ekstraktı ile ön inkübasyonu için, LC5-RIC kültürleri Ci ekstraktı ile 3 saat inkübe edildi, hücreler bir kez PBS ile yıkandı ve enfeksiyon için hücrelere taze ortamda virüs (HIV-1 LAI) eklendi _. Virüs inokulumunun Ci ekstraktı ile ön inkübasyonu için, virüs inokulumu, Ci ekstraktının uygun dilüsyonları ile üç saat boyunca ön inkübasyona tabi tutuldu ve virüs-Ci karışımı, enfeksiyon için LC5-RIC hücrelerine aktarıldı. Paralel bir plakada hücreler, standart enfeksiyon tahlilinde kullanılan koşullara karşılık gelen Ci ekstraktı ve virüs aşılamasına eş zamanlı olarak maruz bırakıldı.

Virüs bağlanma deneyleri , Helfer ve diğ. ¹⁵. Kısaca, LC5-RIC hücreleri, 12 oyuklu plakalarda cam kapak slipleri (24 x 24 mm) üzerine ekildi ve GFP etiketli HIV-1 virionları veya psödotiplenmiş virüs partikülleri (HIV-1'in 1 ml kültür süpernatanı veya psödotiplenmiş virüs) ile inkübe edildi. 100 μg/ml bütün Ci ekstraktı (Ci) veya Ci polifenol fraksiyonu (CiPP) mevcudiyetinde kuyucuk başına hücre üretimi). Virüs bağlanması için pozitif kontrol olarak, hücreler Ci özü olmadan virüse maruz bırakıldı. Arka plan kontrolü, virüs ve Ci özü olmadan kültürlenmiş hücrelerden oluşuyordu. HIV-1 viryonlarının bağlanması, virüsün hücrelere girişini bloke etmek için 50 nM T20 füzyon inhibitörü varlığında test edildi. 4 saatlik inkübasyonun ardından, hücreler PBS ile yıkandı, %2 paraformaldehit ile 30 dakika sabitlendi, tekrar 3 kez yıkandı ve hücre içi DNA'yı lekelemek için 15 dakika DAPI boyama solüsyonunda (1:10 000) inkübe edildi. Lameller cam slaytlara sabitlendi ve örnekler, Perkin Elmer UltraView Vox sistemiyle donatılmış bir Nikon TiE kullanılarak dönen disk konfokal mikroskopisi ile analiz edildi (maruz kalma süreleri GFP: 100 mS, DAPI: çeşitli; Brightfield: çeşitli). Volocity 6.2.1. yazılım, virüs parçacıklarını ölçmek için kullanıldı (=GFP noktaları; en parlak noktanın etrafındaki 1 μm yarıçap içindeki tüm pikseller olarak tanımlanır, yoğunluk eşiği 755). DAPI-pozitif hücreler manuel olarak sayıldı. Virüs yakalama deneyleri

Viral zarflarda konakçıdan türetilen CD44'ün hareketsizleştirilmiş liganda bağlanmasına dayalı virüs yakalama deneyleri, anti-insan CD44 antikorları (μMACS VitalVirus HIV Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Almanya) ve LC5- tarafından üretilen HIV-1 _LAI ile konjüge edilmiş manyetik mikro boncuklarla gerçekleştirildi. Üreticinin talimatlarına göre RIC hücreleri (CD44 pozitif). HIV-1 _{LAI ile enfekte olmuş LC5-RIC hücrelerinin kültür süpernatanları, 3.000} g'de santrifüjlendi hücre kalıntılarını gidermek için. Eşdeğer miktarlarda HIV-1 Gag-p24 (59 ng/μl) ve 200 μg/ml Ci ekstresi veya DMEM içeren numuneler (1 mi) standart hücre kültürü koşulları altında inkübe edildi. 2 saat sonra örneklere anti-CD44 mikro boncuklar (250 µl) eklendi ve 30 dakika inkübasyona devam edildi. Virüs/mikroboncuk karışımı, manyetik alan içerisinde bir μMACS kolonuna yüklendi ve ardından kolonlar 3 kez yıkandı. Virüs elüsyonu için kolonlar manyetik alandan çıkarıldı ve virüs partikülleri 300 ul DMEM ile yıkandı. Elüattaki virüs seviyeleri, akış ve yıkama fraksiyonları, Gag-p24 antijeni ELISA ile ve LC5-RIC hücreleri ile standart bir enfeksiyon tahlilinde 2 kat seri seyreltmede 20-2.5 ul titre edilerek belirlendi.

Viral gp120 kaplama proteininin heparin boncuklarına bağlanmasına dayanan virüs yakalama deneyleri, Salvador ve ark. ⁵⁴ . Virüs numunelerinin hazırlanması için, 10 ml HIV-1 _{LAI kültür süpernatanı}üreten hücreler, Amicon® Ultra -15 100 k Santrifüj Filtre Üniteleri (Merck Millipore, Darmstadt, Almanya) ile ultrasantrifüjleme yoluyla konsantre edildi ve tutulan kısım 10 ml bağlama tamponu (PBS içinde 10 mM sodyum fosfat) içine alındı. 1 ml virüs solüsyonu ya 150 ug/ml Ci ile ya da ilgili miktarda PBS ile 3 saat inkübe edildi. Heparin boncukları, HiTrap™ Heparin HP, 1 ml kolonlardan (GE Healthcare; Almanya) çıkarıldı, iki kez PBS ile yıkandı ve 5 ml bağlama tamponunda yeniden süspanse edildi. 600 ul virüs çözeltisine (+ veya -Ci) 200 ul boncuk çözeltisi ilave edildi ve virüs boncuk karışımları, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. Boncuklar daha sonra 900 g'de 3 dakika peletlendi, süpernatan atıldı ve boncuk peleti iki kez 1 ml PBS ile yıkandı. Boncuk peletinin bir örneği (100 ul), virüsün boncuklara bağlanmasının değerlendirilmesi için çıkarıldı. Kalan boncuk topakları, elüsyon tamponunda (PBS içinde 10 mM sodyum fosfat; 2 M NaCI) yeniden süspanse edildi, boncuklar, santrifüjleme yoluyla çıkarıldı ve süpernatan (=elüat) toplandı. Boncuk peletleri ve elüatlar -20 °C'de saklandı ve Gag-p24 antijeni ELISA ile HIV-1 varlığı açısından değerlendirildi. HIV genomik RNA iletiminin hücrelere qRT-PCR ile değerlendirilmesi

Her deney, virüse maruz kalan kültürlerin 3 örneğinden ve virüse maruz kalmayan kültürlerin bir arka plan örneğinden oluşuyordu. Tüm numuneler iki kopya halinde test edildi. Virüs maruziyeti, maksimum virüs RNA iletimini değerlendirmek için tam Ci özü (Ci) veya Ci polifenol fraksiyonu (CiPP) varlığında veya Ci özü olmadan gerçekleştirildi. LC5-CD4 hücreleri, 6 oyuklu plakalara ( oyuk başına 4 x ¹⁰⁵ hücre) ekildi , 24 saat süreyle inkübe edildi ve HIV-1 _LAI (10 pg Gag-p24/hücre), ya (100 ug/ml) ile birlikte eklendi veya Ci özü olmadan. Tüm kültürler ayrıca, iletilen viral RNA'nın ters transkripsiyonunu önlemek için 50 nM Efavirenz (NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH aracılığıyla elde edildi) içeriyordu.

Virüs eklenmesinden dört saat sonra, hücreler kapsamlı bir şekilde yıkandı, toplandı ve üreticinin talimatlarına göre RNeasy-kit (Quiagen, Hollanda) kullanılarak RNA izole edildi. HIV-1 RNA seviyeleri, qPCR ile RNA polimeraz II (RPII) temizlik geninin transkript seviyelerine göre ölçüldü. Bu amaçla, üreticinin protokolüne göre Superscript®III First-Strand Synthesis System (Life Technologies, ABD) kullanılarak rastgele heksamerler ile ters transkripsiyon yoluyla RNA'dan cDNA üretildi. qPCR, FastStart DNA Master SYBR Green I-Kit, Roche Light Cycler 1.5 cihazı ve LightCycler 480 Yazılımı, Sürüm 1.5 (standart LightCycler protokolü) ile gerçekleştirildi. HIV-1 dizilerinin amplifikasyonu için aşağıdaki primerler kullanılmıştır: HIV-ileri primer 5'-CCA GTC ACA CCT CAG GTA CCT TTA AGA CC-3' ve HIV-ters primer 5'-GTG TGT GGT AGA TCC ACA GAT CAA GG-3'. RPII dizileri aşağıdaki primerler RPII'ler 5'-GCA CCA CGT CCA ATG ACA-3' ve RPIIas 5'-GTG CGG CTG CTT CCA TAA-3' ile büyütüldü. Veriler ikinci türev maksimum yöntemi ile analiz edildi ve bağıl ifade oranları 2 ile hesaplandı.^–ΔΔCT yöntemi ⁷⁴ , ΔCT'nin [CT (HIV hedefi) - CT'yi (RPII referansı) temsil ettiği ΔΔCT, virüse maruz kalan ΔCT numuneleri eksi arka plan numunelerinin ΔCT'si (virüs yok) anlamına gelir. Direnç Testi

HIV-1 _LAI, 6 oyuklu plakalarda Ci özü olan veya olmayan LC5-RIC hücrelerinde 48 kez (24 hafta) geçirildi. Her pasaj için hücreler, 24 saatlik enfeksiyon için Ci özü varlığında virüse maruz bırakıldı. Ortam daha sonra taze ortam ile değiştirildi ve kültürler, virüs üretimi için 48 ila 72 saat süreyle inkübe edildi. Kültür süpernatanları toplandı ve bir sonraki virüs geçişi için inokulum olarak 500 ul kullanıldı. Ci ekstraktı ile muamele , sırasıyla EC50 ve EC90'a karşılık gelen 8.06 ug/ml veya 15.5 ug/ml Ci ekstraktı ile gerçekleştirildi (başlangıç HIV-1 inokulumu _ile belirlendi ₎ . Pasajlama, kontrol olarak Ci ekstraktı yokluğunda paralel olarak gerçekleştirildi.

_{Her ikinci geçişte, virüsün Ci ekstraktı tarafından inhibisyona duyarlılığı, EC50} değerlerini belirlemek için 5 ul kültür süpernatanları ve 100 ila 3,125 ug/ml arasında değişen Ci ekstraktı konsantrasyonları kullanılarak standart enfeksiyon deneyleri ile belirlendi . Hücre canlılığı deneyi

^{Hücre yaşayabilirliği üzerindeki bileşik etkiler, mitokondriyal enzimler 75} tarafından sarı MTT'nin mor formazana indirgenmesini ölçen MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolyum bromür) tahlili ile izlendi . MTT tahlili, Kremb ve ark. ²⁹ . istatistiksel analiz

EC50 /CC50 _{değerleri , değişken eğim ve üst için 100 ve alt için 0 olarak ayarlanmış kısıtlamalar ile sigmoidal doz} -tepki denklemi kullanılarak GraphPad Prism v5 ile hesaplanmıştır. Ek Bilgiler

Bu makaleden nasıl alıntı yapılır : Rebensburg, S. et al. Cistus incanus ekstraktının HIV ve Filovirüslere karşı güçlü in vitro antiviral aktivitesi viral zarf proteinlerini hedefler. bilim 6 , 20394 ; doi: 10.1038/srep20394 (2016). Referanslar

• DSÖ. 2000 ve 2012'de dünyada önde gelen 10 ölüm nedeni . Şu adresten erişilebilir: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (Erişim: 21 Ekim 2015).
• NEJM. Ebola Virüsü Hastalığı: Güncel Bilgiler . Şu adresten erişilebilir: http://www.nejm.org/action/showMediaPlayer?doi=10.1056/NEJMp1410741&aid=NEJMp1410741_attach_1 (Erişim: 21 Ekim 2015).
• AIDS bilgisi. FDA Onaylı HIV İlaçları . Şu adresten erişilebilir: https://aidsinfo.nih.gov/education-m...-hiv-medicines (Erişim: 21 Ekim 2015).
• Taiwo, B., Hicks, C. & Eron, J. HIV-1 için kombinasyon antiretroviral tedavinin yeni çağında karşılanmamış terapötik ihtiyaçlar. Antimikrobiyal Kemoterapi Dergisi (2010).
• Vella, S., Schwartländer, B., Sow, SP, Eholie, SP & Murphy, RL Antiretroviral tedavinin ve bunun dünyanın sınırlı kaynaklara sahip bölgelerinde uygulanmasının tarihi. AIDS 26, 1231–1241 (2012).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Tan, IL & McArthur, JC HIV ile ilişkili nörolojik bozukluklar. CNS ilaçları 26, 123–134 (2012).
  
  Madde PubMed Google Akademik
• Tang, MW & Shafer, RW HIV-1 Antiretroviral Resistance. İlaçlar 72, e1–e25 (2012).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
• Cragg, GM & Newman, DJ Natural ürünleri: sürekli yeni uyuşturucu ipuçları kaynağı. Biochimica et Biophysica Açta (BBA)-Genel Konular 1830, 3670–3695 (2013).
  
  Madde CAS Google Akademik
• Cowan, MM Antimikrobiyal maddeler olarak bitki ürünleri. Klinik mikrobiyoloji incelemeleri 12, 564–582 (1999).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Farnsworth, NR, Akerele, O., Bingel, AS, Soejarto, DD & Guo, Z. Terapide şifalı bitkiler. Dünya sağlık örgütü bülteni 63, 965 (1985).
  
  PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Miller, LH & Su, X. Artemisinin: Çin bitki bahçesinden keşif. Hücre 146, 855–858 (2011).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Nobel Ödülü. 2015 Nobel Tıp Ödülü Sahipleri için Basın Bülteni . Şu adresten erişilebilir: http://www.nobelprize.org/nobel_priz...015/press.html (Erişim: 21 Ekim 2015).
• Muhtar, M. et al. Tıbbi bitkilerin antiviral potansiyelleri. Virüs araştırması 131, 111–120 (2008).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Cordell, GA & Colvard, MD Doğal ürünler ve geleneksel tıp: bir paradigmayı başlatmak. Doğal ürünler dergisi 75, 514–525 (2012).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Helfer, M. ve ark. Tıbbi bitki Pelargonium sidoides'in kök özü, güçlü bir HIV-1 bağlanma inhibitörüdür. PLoS BİR 9 (1) , e87487 (2014).
  
  Madde REKLAMLAR PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Chinou, I., Demetzos, C., Harvala, C., Roussakis, C. & Verbist, J. Cistus incanus subsp. kretikus. Planta medica 60, 34–36 (1994).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Bouamama, H., Villard, J., Benharref, A. & Jana, M. Cistus incanus ve C. monspeliensis yaprak özlerinin antibakteriyel ve antifungal aktiviteleri. Terapi 54, 731–733 (1998).
  
  Google Akademik
• Riehle, P., Vollmer, M. & Rohn, S. Cistus incanus bitkisel infüzyonlarındaki fenolik bileşikler — mayalama işlemi sırasında antioksidan kapasite ve termal stabilite. Uluslararası Gıda Araştırması 53, 891–899 (2013).
  
  Madde CAS Google Akademik
• Wittpahl, G. ve ark. Cistus incanus bitki çayının polifenolik bileşimi ve Streptococcus mutans'a karşı antibakteriyel ve yapışma önleyici aktivitesi. Planta medika (2015).
• Cistus incanus'tan Petereit, F., Kolodziej, H. & Nahrstedt, A. Flavan-3-ols ve proanthocyanidins. Fitokimya 30, 981–985 (1991).
  
  Madde CAS Google Akademik
• Polifenol açısından zengin bir bitki özü olan Droebner, K., Ehrhardt, C., Poetter, A., Ludwig, S. & Planz, O. CYSTUS052, farelerde anti-influenza virüsü aktivitesi gösterir. Antiviral araştırma 76, 1–10 (2007).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Riehle, P., Rusche, N., Saake, B. & Rohn, S. Cistus incanus bitkisel çaylarında kantitatif fenolik bileşiklerin mevcudiyeti ve ekstrakte edilebilirliği üzerinde yaprak içeriğinin ve bitkisel partikül boyutunun etkisi. Tarım ve gıda kimyası dergisi 62, 10978–10988 (2014).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Barrajón-Catalán, E. et al. Birkaç Cistus cinsi türünden elde edilen sulu özlerin polifenolik bileşiminin sistematik bir çalışması: evrimsel ilişki. Fitokimyasal Analiz 22, 303–312 (2011).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Daglia, M. Antimikrobiyal maddeler olarak polifenoller. Biyoteknolojide güncel görüş 23, 174–181 (2012).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Andrae-Marobela, K., Ghislain, FW, Okatch, H. & Majinda, RR Polifenoller: çeşitli çok hedefli anti-HIV-1 ajanları sınıfı. Mevcut ilaç metabolizması 14, 392–413 (2013).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Ehrhardt, C. ve ark. Polifenol açısından zengin bir bitki özü olan CYSTUS052, hücre kültüründe toksik yan etkiler veya viral direnci indükleme eğilimi olmaksızın anti influenza virüsü aktivitesi uygular. Antiviral araştırma 76, 38–47 (2007).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Kalus, U., Kiesewetter, H. & Radtke, H. Üst solunum yolu enfeksiyonu olan hastalarda CYSTUS052® ve yeşil çayın subjektif semptomlar üzerindeki etkisi. Fitoterapi araştırması 24, 96–100 (2010).
  
  Madde PubMed Google Akademik
• Kalus, U. et al. Üst solunum yolu enfeksiyonu olan hastaların tedavisi için Cistus incanus (CYSTUS052): prospektif, randomize, plasebo kontrollü bir klinik çalışma. Antiviral araştırma 84, 267–271 (2009).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Kremb, S. ve ark. EASY-HIT: Birden çok HIV inhibitörü sınıfının kapsamlı keşfi için HIV tam replikasyon teknolojisi. Antimikrobiyal ajanlar ve kemoterapi 54, 5257–5268 (2010).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• HIV-DERECELİ. Araştırma için HIV Dizi analizi . Şu adresten erişilebilir: http://www.hiv-grade.de/grade/deployed/rade.pl?program=hivalg (Erişim: 21 Ekim 2015).
• Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E. & Pannecouque, C. Antiviral bileşiklerin hedef tanımlamasına yönelik ilaç ekleme zamanı yaklaşımı. Doğa protokolleri 6, 925–933 (2011).
  
  Madde CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
• Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H. & Schindler, M. Makrofaj dahili HIV-1, nötralize edici antikorlardan korunur. Viroloji Dergisi 86, 2826–2836 (2012).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Connell, BJ & Lortat-Jacob, H. İnsan immün yetmezlik virüsü ve heparan sülfat: bağlanmadan giriş inhibisyonuna. İmmünolojide sınırlar 4(385), 2 (2013).
  
  Madde CAS Google Akademik
• Ott, DE HIV virionlarında hücresel proteinler. Tıbbi virolojide incelemeler 7, 167–180 (1997).
  
  Madde MathSciNet CAS PubMed Google Akademik
• Helleboid, S. ve ark. Nükleer reseptör RORa'nın (NR1F1) biyoyararlı, güçlü ve yüksek afiniteli bir agonisti olarak doğal olarak oluşan neoruscogenin'in tanımlanması. Biyomoleküler tarama dergisi 19(3), 399–406 (2013).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Kühl, A. et al. Ebola virüsü glikoproteini ve HIV-1 Vpu, antiviral faktör tetherine karşı koymak için farklı stratejiler kullanır. Enfeksiyon Hastalıkları Dergisi 204, 850–860 (2011).
  
  Madde CAS Google Akademik
• Gnirß, K. ve ark. Tetherin antagonizması için gerekli olan filovirüs glikoproteinlerindeki belirleyicilerin analizi. Virüsler 6, 1654–1671 (2014).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Chattopadhyay, D. & Khan, MTH Ethnomedicines ve herpes virüslerine karşı etnomedicinal fitoforlar. Biyoteknoloji yıllık incelemesi 14, 297–348 (2008).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Kadir, SLA, Yaakob, H. & Zulkifli, RM Potansiyel dang hummasına karşı şifalı bitkiler: bir gözden geçirme. Doğal ilaçlar dergisi 67, 677–689 (2013).
  
  Madde CAS Google Akademik
• Chen, Y. & Zhu, J. Bireysel geleneksel Çin bitkisel tıbbının in vitro ve in vivo Anti-HBV etkisi : analitik bir inceleme. Viral hepatit Dergisi 20, 445–452 (2013).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Ashfaq, UA & Idrees, S. Hepatit C virüsüne karşı şifalı bitkiler. Dünya gastroenteroloji dergisi: WJG 20, 2941–2947 (2014).
  
  Madde CAS PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
• Chingwaru, W., Vidmar, J. & Kapewangolo, PT Sahra altı Afrika bitkilerinin insan immün yetmezlik virüsü enfeksiyonlarının tedavisindeki potansiyeli: Bir gözden geçirme. Fitoterapi Araştırması 29, 1452–1487 (2015).
  
  Madde PubMed Google Akademik
• Dvorkin-Camiel, L. & Whelan, JS Bulaşıcı hastalıkların tedavisinde tropikal amerikan bitkileri. Diyet takviyeleri dergisi 5, 349–372 (2008).
  
  Madde PubMed Google Akademik
• Cordell, GA Sürdürülebilir ilaçlar ve küresel sağlık hizmetleri. Planta medica 77, 1129–1138 (2011).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Li, G. ve ark. Nüfus perspektifinden HIV genom çapında varyasyonun entegre bir haritası. Retroviroloji 12 (2015).
• Peterson, K., Jallow, S., Rowland-Jones, SL & de Silva, TI HIV-2 enfeksiyonu için antiretroviral tedavi: düşük kaynak ortamlarında yönetim için öneriler. AIDS araştırma ve tedavisi 2011 (2011).
• Bush, S. & Tebit, D. HIV-1 grubu O kökeni, evrimi, patogenezi ve tedavisi: 25 yıl sonra bir aykırı değerin karmaşıklığının çözülmesi. AIDS incelemeleri 17, 147–158 (2014).
  
  Google Akademik
• Megens, S. & Laethem, KV HIV-1 genetik varyasyonu ve ilaç direnci gelişimi. Anti-enfektif Tedavi Uzman İncelemesi 11 (2013).
• Depatatureaux, A. ve ark. İntegraz inhibitörlerine karşı HIV-1 grup O direnci. Edinilmiş immün yetmezlik sendromları dergisi 70, 9–15 (2015).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Kurt, MC ve ark. Zarflı virüslerin girişini hedefleyen geniş spektrumlu bir antiviral. Ulusal Bilimler Akademisi Tutanakları 107, 3157–3162 (2010).
  
  Madde REKLAMLAR CAS Google Akademik
• Haqqani, AA & Tilton, JC Giriş inhibitörleri ve bunların HIV-1 enfeksiyonunun tedavisinde kullanımı. Antiviral araştırma 98, 158–170 (2013).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Nyakatura, EK, Frei, JC & Lai, JR Ebola Virüsü giriş inhibitörlerinin kimyasal ve yapısal yönleri. ACS bulaşıcı hastalıkları 1, 42–52 (2014).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Spillmann, D. Heparan sülfat: viral saldırganlar için çapa mı? Biochimie 83, 811–817 (2001).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Salvador, B. ve ark. Filovirüsler, hedef hücrelere bağlanmaları için glikozaminoglikanları kullanır. Viroloji Dergisi 87, 3295–3304 (2013).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Schulze, A., Gripon, P. & Urban, S. Hepatit B virüsü enfeksiyonu, heparan sülfat proteoglikanlarına geniş bir yüzey proteinine bağımlı bağlanma ile başlar. Hepatoloji 46, 1759–1768 (2007).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Barth, H. ve ark. Hepatit C virüsü zarf glikoproteini E2'nin hücresel bağlanması, hücre yüzeyi heparan sülfat gerektirir. Journal of Biological Chemistry 278, 41003–41012 (2003).
  
  Madde CAS Google Akademik
• Colpitts, CC & Schang, LM Küçük bir molekül, viryonun heparan sülfat veya sialik asit içeren glikanlara bağlanmasını engeller. Viroloji Dergisi 88, 7806–7817 (2014).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Wilen, CB, Tilton, JC & Doms, RW Viral Molecular Machines 223–242'de HIV girişinin moleküler mekanizmaları (Springer, 2012).
• Yuan, S. ve ark. HIV-1 gp120 kaynaklı ağrının patogenezinde bir Wnt5a sinyal yolu. Ağrı 156, 1311–1319 (2015).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Alexander, L. ve ark. Zarf aracılı CD4+-T-hücre tükenmesinin insan immün yetmezlik virüsü bağlanma inhibitörleri tarafından inhibisyonu. Antimikrobiyal ajanlar ve kemoterapi 53, 4726–4732 (2009).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Kaul, M. & Lipton, SA HIV-1 enfeksiyonu ve AIDS ile ilişkili nöroimmünite ve nörodejenerasyon mekanizmaları. Journal of Neuroimmune Pharmacology 1, 138–151 (2006).
  
  Madde PubMed Google Akademik
• Mocchetti, I., Bachis, A. & Avdoshina, V. İnsan immün yetmezlik virüsü-1'in nörotoksisitesi: viral proteinler ve aksonal taşıma. Nörotoksisite araştırması 21, 79–89 (2012).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Zhou, N. ve ark. Ön ilaç BMS-663068'in aktif maddesi olan HIV-1 bağlanma inhibitörü BMS-626529'a duyarlılığın genotipik bağıntıları. Antimikrobiyal Kemoterapi Dergisi 69, 573–581 (2014).
  
  Madde CAS Google Akademik
• Baeten, J. & Celum, C. HIV enfeksiyonunun önlenmesi için sistemik ve topikal ilaçlar: antiretroviral temas öncesi profilaksi. Tıbbın yıllık incelemesi 64, 219–232 (2013).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Harvey, AL, Edrada-Ebel, R. & Quinn, RJ Genomik çağda ilaç keşfi için doğal ürünlerin yeniden ortaya çıkışı. Nature Review Drug Discovery 14, 111–129 (2015).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Newman, DJ & Cragg, GM 1981'den 2010'a kadar 30 yılda yeni ilaçların kaynağı olarak doğal ürünler. Journal of natural products 75, 311–335 (2012).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Martinez, J., Sasse, F., Brönstrup, M., Diez, J. & Meyerhans, A. Antiviral ilaç keşfi: doğadan gelen geniş spektrumlu ilaçlar. Doğal ürün raporları 32, 29–48 (2015).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Peden, K., Emerman, M. & Montagnier, L. HIV-1 LAI, HIV-1 MAL ve HIV-1 ELI'nin enfeksiyöz moleküler klonlarından türetilen virüslerin doku kültüründe geçişte büyüme özelliklerindeki değişiklikler. Virology 185, 661–672 (1991).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik
• Freed, EO, Englund, G. & Martin, MA Makrofaj enfeksiyonunda insan immün yetmezlik virüsü tip 1 matrisinin temel alanının rolü. Journal of virology 69, 3949–3954 (1995).
  
  PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Gürtler, LG ve ark. Kamerun'dan insan immün yetmezlik virüsü tip 1'in (MVP-5180) yeni bir alt tipi. Journal of virology 68, 1581–1585 (1994).
  
  PubMed PubMed Merkezi Google Akademik
• Gaudin, R. ve diğerleri. Birincil insan makrofajlarında HIV yaşam döngüsünde kinesin KIF3A için kritik rol. Hücre biyolojisi Dergisi 199, 467–479 (2012).
  
  Madde PubMed PubMed Merkezi CAS Google Akademik
• Wachinger, M. ve ark. Antimikrobiyal peptidler melittin ve cecropin, viral gen ekspresyonunu baskılayarak insan immün yetmezlik virüsü 1'in replikasyonunu inhibe eder. Journal of General Virology 79, 731–740 (1998).
  
  Madde CAS Google Akademik
• Fuss, IJ, Kanof, ME, Smith, PD & Zola, H. Periferik kan ve kordon kanından tüm mononükleer hücrelerin izolasyonu. İmmünolojide güncel protokoller. 7.1.1–7.1.8 (2009).
• Livak, KJ & Schmittgen, TD Gerçek zamanlı kantitatif PCR ve 2−ΔΔCT yöntemi kullanılarak göreli gen ekspresyon verilerinin analizi. Yöntemler 25, 402–408 (2001).
  
  Madde PubMed CAS Google Akademik
• Mosmann, T. Hücresel büyüme ve hayatta kalma için hızlı kolorimetrik deney: proliferasyon ve sitotoksisite deneylerine uygulama. İmmünolojik yöntemler dergisi 65, 55–63 (1983).
  
  Madde CAS PubMed Google Akademik

[igokcek]

[igokcek]

[igokcek]

[igokcek]

[igokcek]

[igokcek]

[igokcek]

[igokcek]

[igokcek]

[igokcek]

[igokcek]