Duyuru

***maturidi*** · 03 April 2021, 22:37

Goldenseal'in ( Hydrastis canadensis ) Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus'a (MRSA) karşı Quorum Quenching ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Nadja B. Cech,Hiyas A. Junio,Laynez W. Ackermann,Jeffrey S. Kavanaugh, ve Alexander R. Horswill

Öz
Popüler bitkisel ilaç goldenseal ( Hydrastis canadensis L.) geleneksel olarak cilt enfeksiyonlarını tedavi etmek için kullanılır. Bu çalışma ile, H. canadensis ekstraktlarının metisiline dirençli Staphylococcus aureus'a (MRSA) karşı in vitro aktivitesini gösterdik . H. canadensis yapraklarından elde edilen bir özüt, tek başına alkaloid berberinden daha güçlü antimikrobiyal aktivite gösterdi (sırasıyla 75 ug / mL ve 150 ug / mL MIC'ler). LC-MS, ekstraktta alkaloidler ve efluks pompası inhibe edici flavonoidler tespit etti ve ikincisi, tek başına berberine kıyasla ekstraktın artan etkinliğini açıklayabilir. Biz aynı zamanda, ikinci bir mekanizma olarak, anti-hastalık oluşturma aktivitesi kanıtı göstermektedir H. canadensis karşı hareket ederS. aureus . H. canadensis çeşitli klinik olarak ilgili MRSA izolatları karşı yaprak ekstresi (ancak izole alkaloidler berberin, hydrastine ve canadine) göstermiştir çekirdek söndürme etkinliği (USA300 suş). Verilerimiz, bunun AgrCA iki bileşenli sistem aracılığıyla sinyal iletiminin zayıflatılmasıyla gerçekleştiğini göstermektedir. Bu gözlemle tutarlı olarak, özüt, MRSA tarafından toksin üretimini inhibe etti ve MRSA'nın in vitro keratinosit hücrelerine zarar vermesini önledi . Toplu olarak, sonuçlarımız, H. canadensis yaprak özlerinin, birkaç farklı mekanizma yoluyla MRSA'ya karşı etki eden bir bileşen karışımına sahip olduğunu göstermektedir . Bu bulgular, ham H. canadensis'in geleneksel uygulamasını desteklemektedir. enfeksiyonun önlenmesi tedavisinde özler.

Anahtar Kelimeler: Hydrastis canadensis , Ranunculaceae, quorum quenching, berberine, metisiline dirençli Staphylococcus aureus , anti-virülans

Giriş
Avrupa Antimikrobiyal Gözetim Sistemleri, dünya çapında 52 milyon kadar insanın çoklu ilaca dirençli bakterilerle kolonileştiğini tahmin ediyor. Bunların en yaygın ve ölümcül olanları arasında metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), şu anda ABD'de HIV / AIDS'ten daha fazla yıllık ölüme neden oluyor [ 1 ]. Toplum ve sağlık bakımı ortamlarında artan MRSA seviyeleri oranları ve ilaca dirençli bakteriyel enfeksiyonlarla ilişkili artan hastalık yükü ve daha yüksek tedavi maliyetleri [ 2 ] ile, MRSA gibi sorunlu patojenlerle mücadele etmek için yeni stratejiler geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır.

İlaca dirençli bakteriyel patojenleri etkisiz hale getirmek için virülans temelli yaklaşımlar giderek daha fazla geliştirilmektedir [ 3 ]. Bu ajanlar, mevcut antibiyotiklerden daha patojene özgü olacaktır, ancak tüm cilt ve yumuşak doku enfeksiyonlarının tahmini% 76'sını içeren S. aureus ve MRSA'nın neden olduğu hastalık yükünün çokluğu [ 4 ], MRSA hedefli terapötikler geliştirmenin değerini vurgulamaktadır. . Bu tür ajanların özgüllüğü ve virülans önleyici doğası, yaygın ilaç direncinin gelişimini sınırlayabilir, sonraki enfeksiyonu önleyecek immün yanıtların gelişimini kolaylaştırabilir ve normal mikrobiyal flora üzerindeki olumsuz etkilerden kaçınabilir [ 3 ]. MRSA virülans önleme stratejisi olarak çekici bir hedef, yetersayı algılama sistemidir [5 , 6 ].

S. aureus quorum-sensing, yardımcı gen düzenleyici veya " agr " sistemi olarak da adlandırılır (Şekil 1), birçok konakçıya zarar veren ajan veya "virülans faktörünün" üretimini kontrol eden hücre yoğunluğuna bağlı bir düzenleyici sistemdir. Bu sistem, S. aureus tarafından biyosentezlenen ve salgılanan, oto indükleyici peptid (AIP) adı verilen salgılanan bir peptid sinyaline yanıt verir . S. aureus suşuna bağlı olarak, salgılanan AIP'nin yapısı dört tipten herhangi biri olabilir (AIP-1, AIP-2, AIP-3 veya AIP-4). AIP sinyalinin hücre dışı konsantrasyonu yeterince yüksek olduğunda, AgrC adı verilen bir yüzey reseptörüne bağlanarak bir sinyal iletim kaskadını etkinleştirir. Bu kademenin temel bileşenleri AgrCA iki bileşenli düzenleyici çifttir ve aktive edildiğinde hücre dışı virülans faktörlerinin üretimini tetiklerler. Mutasyonlar tarsisteminin hayvan enfeksiyon modellerinde patogenezi azalttığı bilinmektedir [ 5 ] ve çok sayıda çalışma agr sisteminin küçük moleküllü inhibisyonunun hayvan modellerinde deri ve yumuşak doku enfeksiyonlarını hafiflettiğini göstermiştir [ 5 , 7 , 8 ].

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms710121f1.jpg'dir.

Şekil 1
S. aureus agr çekirdek algılama sisteminin şeması . AgrD, oto indükleyici peptid (AIP) sinyalinin peptid öncüsüdür. AgrB, AIP'yi oluşturan zara bağlı bir endopeptidazdır (AIP-1 dizisi gösterilmektedir). AgrC, AIP'yi bağlayan ve yanıt düzenleyici AgrA'yı fosforile eden bir membran histidin kinazdır, bu da agr kromozomal lokustaki P2 ve P3 promoterlerinden transkripsiyonu indükler . Bu indüksiyon, sistemi otomatik olarak indükler ve RNAIII transkriptinin üretimine yol açar. RNAIII, sistemin birincil efektörüdür ve virülans faktörlerinin salgılanmasını açar.

Amacımız , popüler [ 9 ] bitkisel ilaç goldenseal'in (Hydrastis canadensis L.) MRSA'nın çeşitli klinik izolatlarına karşı in vitro etkinliğini araştırmaktı . H. canadensis , en bol olanı berberin olan bir dizi alkaloid içerir [ 10 ]. Daha önce, H. canadensis , çeşitli Gram pozitif bakterilere [karşı antimikrobiyal aktivite göstermiştir 10 - 13 ] ve berberin MRSA büyümesini [inhibe ettiği gösterilmiştir 14 ]. Bununla birlikte, ham H. canadensis'in antimikrobiyal aktivitesiMRSA'ya karşı özütler hiçbir zaman rapor edilmedi ve bunların yetersayı su verme etkinliği araştırılmadı. Bu çalışmalarla, H. canadensis yaprak ekstraktlarının antimikrobiyal etkilerinin, farklı mekanizmalar aracılığıyla hareket eden çoklu bileşenlerin birleşik etkisinden kaynaklandığına dair merkezi hipotezi test ettik . Bu hipotez, kısmen Stermitz ve. al, berberinin antimikrobiyal aktivitesinin diğer bitki bileşenleri tarafından güçlendirildiği gösterilmiştir [ 15 , 16 ]. Bu deneylerde özellikle H. canadensis yaprak özütlerine odaklandık , çünkü önceki çalışmalarımız yaprak özütlerinin berberinin antimikrobiyal aktivitesine sinerjist olarak kök özlerinden daha etkili olduğunu gösterdi [ 17]. H. canadensis kök ekstraktlarının en yaygın olarak geleneksel tıp uygulamalarında kullanılmasına rağmen [ 18 ], enfeksiyona karşı altınmühür yaprak ekstrelerinin topikal kullanımı için emsal vardır [ 19 ]. Bu çalışmadaki hedeflerimiz, bir H. canadensis yaprağı ekstraktını bir antimikrobiyal ajan ve MRSA için çekirdek çoğaltıcı olarak değerlendirmek ve ham ekstraktın aktivitesini ana alkaloid berberin ile karşılaştırmaktı. Özellikle, toplum kökenli yumuşak doku enfeksiyonlarında gözlenen en yaygın MRSA suşu olarak ortaya çıkan USA300 MRSA izolatlarına karşı aktiviteyi araştırdık [ 4 , 20 ].

Malzemeler ve yöntemler
Bakterileri, Kimyasalları ve Biyokimyasalları Test Edin
Bu çalışmada kullanılan yabani tip S. aureus suşları CA-MRSA USA300 TCH1516 [ 21 ], LAC [ 22 ], AH1263 (LAC * olarak da adlandırılır) [ 23 ] ve SA502A'dır [ 24 ]. Plazmid pDB59 içeren S. aureus quorum-sensing raportör suşları da kullanıldı ve agr grup I (CA-MRSA USA300 LAC), agr grup II (SA502A) ve agr grup III (CA-MRSA MW2) temsilcilerini içeriyordu [ 25 ] . Söndürmeyi araştırmak için ek çalışmalar, S. aureus lux muhabir suşu ROJ143 kullanılarak yapılmıştır [ 26 , 27]. Epitel toksisite testleri için USA300 suşu AH1263'ün (LAC *) alfa toksini ( Δhla :: Erm) [ 28 ] veya agr ( Δagr :: Tet) [ 29 ] mutantları kullanıldı. Triptik soya suyu (TSB), Mueller Hinton suyu, karbonil siyanür m-kloro-fenilhidrazon (CCCP, TLC'ye göre saflık>% 98), berberin (HPLC'ye göre saflık>% 98), (1R, 9S) - (-) - β -hidrastin (HPLC'ye göre>% 98 saflık) ve DMSO, Sigma Aldrich'ten (Saint Louis, MO, ABD) ve kanadin (tetrahidroberberin, HPLC ile saflık>% 98, stereokimya onaylanmamış) Chromadex'ten (Irvine, CA, ABD) satın alındı. Sideroksilin, 8-desmetil-sideroksilin ve 6-desmetil-sideroksilin daha önce H. canadensis yapraklarından izole edilmiştir [ 30]>% 98 saflıkta. Asetik asit, Fisher Chemical'dan (Pittsburgh, PA, ABD) satın alındı. Etanol (% 95), HPLC dereceli asetonitril ve HPLC dereceli metanol, Pharmaco-AAPER'den (Shelbyville, KY, ABD) elde edildi. Su, bir nanodiamond sistemi (Barnstead, Dubuque, IA, ABD) ile saflaştırıldı.

Bitki materyali
Yetiştirilen Hydrastis canadensis L . (Ranunculaceae) Eylül 2008'de: K 35 ° 24.277 ', B 082 ° 20.993', 702.4 m yükseklikten hasat edilmiştir. Bir makbuz örneği North Carolina Üniversitesi Herbaryumunda (NCU583414) saklanır ve kimlik Dr. Alan S. Weakly tarafından onaylanır.

Ekstraksiyon ve LC-MS
Ekstreler, hidroetanolik Hydrastis canadensis takviyelerinin [ 31 ] imalatında kullanılan standart prosedürlere göre , başka bir yerde [ 17 ] tarif edildiği gibi hazırlandı . 1: 5 (g bitki materyali: mL çözücü) oranında% 50 etanol:% 50 su içeren bir çözücü kullanılmıştır. Çözücü (500 mL), H. canadensis bitkilerinin (100 g) tüm hava (yer üstü) kısmı ile harmanlandı ve 24 saat yumuşatıldı, sonra vakum altında süzüldü. Bu kağıt boyunca H. canadensis yaprak özütü olarak anılacak olan elde edilen özüt, oda sıcaklığında amber bir şişede saklandı. Biyolojik aktivite ve HPLC profili, üç yıllık bir süre boyunca bu ekstrakt için tutarlıydı.

Ekstrakt, alkaloid ve flavonoid miktarını ve kimliğini belirlemek için sıvı kromatografi - kütle spektrometrisi (LC-MS) ile profillendirildi. Alkaloidlerin ve flavonoidlerin kantitatif analizi ( Tablo 1, Ek Bilgiler ) yerleşik bir yöntem kullanılarak gerçekleştirildi [ 17 , 30 ]. Bileşen kimlikleri, bir ultra performanslı sıvı kromatografına (UPLC) (Waters, Alliance) bağlanan bir LTQ-Orbitrap yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinde (Thermo, San Jose, CA, ABD) doğrulandı. daha önce rapor edildiği gibi, doğrulanmış standartlara ait olanlar [ 30 ].

Aşağıdaki gradyan kullanıldı, burada A = HPLC dereceli asetonitril ve B =% 0.1 sulu formik asit: 0 ila 5.0 dakika arasında% 90 -% 70 B; % 70 ila% 50 B, 5 ila 7.0 dak; 7.0 ila 7.5 dakika arasında% 50 ila% 45, 7.5 ila 8.0 dakika arasında% 45 ila% 0 B,% 0 B'de 8.0 ila 8.5 dakika ve% 0 ila 90 8.5 ila 9.0 dakika. 100-1000 m / z kütle aralığı ile alkaloidler için pozitif iyon modunda ve flavonoidler için negatif iyon modunda MS analizi yapılmıştır . Kapiler sıcaklık 300 ° C, kılıf gaz basıncı 28 (keyfi birimler) ve kaynak, kılcal ve tüp lens voltajları sırasıyla 4.30 kV, 29 V ve 110 V idi.

Broth Mikrodilüsyon MIC Testleri
Minimum inhibitör konsantrasyon (MIC), Klinik Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) standart prosedürlerine göre ölçülmüştür [ 32 ]. Kısaca özütler veya saflaştırılmış berberin (+ kontrol), Mueller Hinton Broth içinde 4,7 ila 300 ug / mL arasında değişen konsantrasyonlarda üç kopya halinde 96 oyuklu plakalara ilave edildi. Araç (% 2 DMSO), negatif kontroldü ve DMSO içeriği, tüm oyuklarda% 2 olarak sabitlendi. Tek bir koloni izolatı 24 saatlik kültür , S. aureus AH1263, TCH1516, LAC, Mueller Hinton suyu içinde log fazında büyütülmüştür ve 1.0 x 10 bir son yoğunlukta ilave edildi ⁵CFU / mL. 600 nm'de abzorbans, bir POLARstar Optima mikroplaka okuyucusu (BMG Labtech, Inc) kullanılarak 24 saat sonra ölçüldü. MIC, tedavi ile araç kontrolü arasında istatistiksel olarak önemli bir farkın olmadığı konsantrasyon olarak tanımlandı. Bakteriler hariç tüm analiz bileşenlerini içeren kopya oyuklar için absorbans, analiz oyuklarının absorbansından çıkarıldı.

Floresan raportörlerle quorum quenching assays
PDB59 içeren S. aureus quorum-sensing raportör suşları, çalkalanarak 37 ° C'de 10 ug / mL'de kloramfenikol ile takviye edilmiş TSB içerisinde gece boyunca büyütüldü. Özleri veya numunelerin test edilmesi için, kültürler (yaklaşık 4-10 x 10 ila 500-kat TSB seyreltildi ⁶ seyreltildikten sonra CFU / mL) ve 180 uL bir mikrotiter plakası içine dağıtılmıştır. Uygun konsantrasyona ulaşmak için numune veya araç kontrolü eklendi (20 uL) ve plakalar çalkalanarak (200 rpm) 37 ° C'de inkübe edildi. Belirlenen zaman noktalarında, bir Tecan Infinite M200 plaka okuyucusunda absorbans (600 nM) ve floresans (eksitasyon 485 nm, emisyon 530 nm) ölçüldü. Bildirilen değerler 30 saatlik büyüme içindir.

Lux muhabiriyle quorum quenching assay
AIP-1 ve AIP-2 , sırasıyla , S. aureus suşları AH1263 ve SA502A'nın gece TSB kültürlerinin filtre ile sterilize edilmesiyle elde edildi [ 24 ]. Lux raportör suşu ROJ143'ün bir gecelik kültürü, kloramfenikol (10 ug / mL) içeren TSB'de 1:50 oranında alt kültürlendi ve 0,8'lik OD _600'e çalkalanarak 37 ° C'de büyütüldü . Lux raportör suşunun alikotları (164 µL), 20 µL AH1263 koşullu ortam (yani AIP-1) ve H. canadensis içeren dörtlü mikrotitre plaka oyuklarına eklenmiştir.çeşitli alt inhibitör konsantrasyonlarda ekstrakte edildi, öyle ki tüm oyuklar% 0.8'lik bir nihai DMSO konsantrasyonu içeriyordu. Çalkalama (200 rpm) ile 37 ° C'de 90 dakika inkübasyonun ardından, biyolüminesans bir Tecan Infinite M20 plaka okuyucuda ölçülmüştür. Karşılaştırma için, lüks muhabir, H. canadensis'i SA502A koşullu ortamla (ayrıca% 0.8 DMSO'da) değiştirerek AIP-2 ile inhibe edildi .

İnsan derisi epitel toksisite analizi
USA300 suşu AH1263 (LAC *) ve bir alfa-toksin mutasyonu veya bir agr delesyonuna sahip türevler , TSB içerisinde gece boyunca büyütüldü. 10 mL TSB ve bir dizi alt inhibe edici H. canadensis konsantrasyonları (sabit% 0.8 DMSO ile ) içeren kültür şişeleri (50 mL) , AH1263 gece boyunca kültür ile 1: 500 aşılandı. Yalnızca DMSO aracı içeren TSB alikotları agr ve hla mutantları ile aşılanmıştır . 37 ° C'de çalkalama (225 rpm) ile 11 saatlik büyümenin ardından, kültürler SpinX filtrelerinden (0.22 µm, Corning) süzüldü ve ortamın α-toksin içeriği, daha önce açıklandığı gibi immünoblotlama ile ölçüldü [ 28]. İnsan keratinositleri (HaCaT), penisilin / streptomisin ile% 10 fetal buzağı serumu ile RPMI içinde kültürlendi [ 33 ]. Harcanan ortam, filtre ile sterilize edildi ve HaCaT ortamında 5 kat seyreltildi. Bu harcanan ortamın (0.5 mL) alikotları, 24 oyuklu plakalarda birleşen HaCaT'ye ilave edildi ve 24 saat inkübe edildi. Toksisiteyi değerlendirmek için laktat dehidrojenaz salımı, ticari olarak temin edilebilen bir kit (Promega CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay) ile ölçüldü.

İstatistik
Ortalamaların kontrollere kıyasla önemi, iki örneklemli eşit varyans, 2 kuyruklu öğrenci t-testleri ile hesaplandı.

Sonuçlar ve tartışma
Bu çalışmanın amaçlarından biri, bir H. canadensis ekstresinin MRSA'ya karşı antimikrobiyal aktivitesini , majör alkaloid berberininki ile karşılaştırmaktı. Bir H. canadensis yaprak özütü ( Şekil 1S'deki, Destekleyici Bilgiler'deki kromatograma bakınız ) berberin içeriğine standardize edildi ve antimikrobiyal aktivitesi, tek başına aynı berberin konsantrasyonları ile MRSA suşu USA300 AH1263 (LAC *) [ 22 ] ile yan yana değerlendirildi. (şekil 2). Ekstrakt, saf berberine (150 µg / mL) kıyasla daha düşük bir MIC değeri (75 µg / mL, µg berberin / mL test hacmi olarak rapor edilir) göstererek, berberin dışındaki bileşenlerin buna karşı aktivitesinde rol oynadığını gösterir. MRSA. Berberinin bu testte pozitif kontrolde görev yaptığını ve gözlemlediğimiz MİK'in bu alkaloidin S. aureus'a karşı aktivitesi ile ilgili çok sayıda önceki raporla tutarlı olduğunu unutmayın [ 10 , 34 , 35 ]. Ekstrelerin tek başına berberine kıyasla artmış aktivitesinin sideroksilin, 8-desmetil-sideroksilin ve 6-desmetil-sideroksilin (Figür 3), daha önce H. canadensis'in bileşenlerinde bildirilen [ 30 , 36 ]. H. canadensis flavonoidlerinin, efluks pompası inhibisyonu yoluyla berberinin antimikrobiyal aktivitesini artırdığı gösterilmiştir [ 30 ] ve burada araştırılan H. canadensis ekstrelerinde tespit edilmiştir ( Tablo 1S, Destekleyici Bilgiler ).

Resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms710121f2.jpg'dir.

Goldenseal ( Hydrastis canadensis ) yaprak ekstresi ve berberinin antimikrobiyal aktivitesinin MRSA suşu USA300 AH1263'e karşı karşılaştırılması [ 22 ]. Ekstrakt, x ekseninde gösterilen berberin içeriğine standardize edildi. Her iki test numunesi için iki kat seri seyreltme yoluyla farklı konsantrasyonlar hazırlandı. Yaprak özütü, 150 µg / mL'de izole edilmiş berberinin MIC'sinden üç kat daha düşük olan 38 µg / mL'de (µg berberin / mL test hacmi olarak ifade edilir) bir MIC değeri gösterdi. Hata çubukları , üçlü test kuyularının OD _600'ü için standart sapmayı temsil eder .

Resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms710121f3.jpg'dir.

Başlıca alkaloidlerin yapıları, berberin ( 1 ), (1R, 9S) - (-) - β-hidrastin ( 2 ) ve kanadin (tetrahidroberberin) ( 3 ) ve flavonoidler, sideroksilin ( 4) , 8-desmetil-sideroksilin ( 5) ) ve Hydrastis canadensis'te bulunan 6-desmetil-sideroksilin ( 6 ) .

Sonuçlarımız, H. canadensis yaprak özlerinin antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir . Bu aktivite büyük olasılıkla, üç farklı MRSA suşuna karşı 150 µg / mL ila 300 µg / mL arasında değişen MIC değerleri gösteren alkaloid berberinin etkisinden kaynaklanmaktadır ( Tablo 2S, Destekleyici Bilgiler ). Özellikle, diğer iki altınmühür alkaloid [ 10 ], kanadin ve hidrastin (Figür 3), değerlendirilen üç MRSA suşuna karşı herhangi bir antimikrobiyal aktivite göstermedi ( Tablo 2S ).

Mevcut çalışma, antimikrobiyal aktivite elde etmek için nispeten yüksek konsantrasyonlarda H. canadensis yaprak özleri veya saflaştırılmış berberin gerektiğini göstermektedir; ancak, bu botanikin çeşitli enfeksiyonlar için oldukça etkili bir tedavi olduğuna dair birçok anekdot raporu vardır [ 18 ]. S. aureus agr çoğunluğu algılama sistemi cilt enfeksiyonları önemli bir rol oynar. Bu nedenle, çekirdek yoğunlaştırma aktivitesinin, H. canadensis ekstraktlarının MRSA'ya karşı aktivitesini kısmen açıklayabileceğini varsaydık . Daha önce diğer çekirdek quenching ajanlarını karakterize etmek için kullanılan bir muhabir deneyi kullanıldı [ 37]. Alt inhibitör konsantrasyonlardaki özütler raportör suşlarla inkübe edildiğinde, agr tip I, II ve III habercilerle tutarlı ve sağlam doza bağlı bir söndürme etkisi gözlemledik (Şekil 4). Bu üç agr sınıfı, tüm S. aureus suşlarının büyük çoğunluğunu temsil eder [ 38 ], bu da H. canadensis yaprak ekstraktlarının genel bir quorum quenching maddesi içerdiğini gösterir. Bu yetersayı yumuşatma etkisi, majör H. canadensis alkaloid berberine (Şekil 4D), agr sistemini 75 µg / mL'de bile inhibe etmedi . Ayrıca diğer alkaloidler, hidrastin veya kanadin ile su verme aktivitesini gözlemleyemedik (veriler gösterilmemiştir).

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms710121f4.jpg'dir.

S. aureus agr P3-GFP muhabir suşlarında H. canadensis yaprak ekstresi ve berberin ile quorum quenching . Haberci suşlar ( agr tip I, panel A ; agr tip II, panel B ; agr tip III, panel C ) triptik soya suyu içinde büyütüldü ve özüt (berberine standardize edilmiş) 25 ve 50 ug / mL'de test edildi. Bu konsantrasyonlar, bu testin koşulları altında alt inhibitör oldukları için seçildi. Haberci suşlar, ekstrakt ile 30 saat süreyle inkübe edildi ve GFP floresansı ölçüldü. Karşılaştırma için, AIP reseptörünün rekabetçi bir inhibitörü ~% 95'e kadar söndürülür (gösterilmemiştir). D panelinde , her biriagr raportör suşu aynı şekilde büyütüldü ve ölçüldü ve berberin (Berb) 75 ug / mL'ye eklendi ve araç kontrolü (Veh) olarak steril su ile karşılaştırıldı. * A , B panellerindeki araca (DMSO) kıyasla p <0.01'i gösterir . ve Cı . p- değerleri, iki kuyruklu bir öğrencinin t-testi ile hesaplandı ve hata çubukları, üçlü ölçümler için ortalamanın standart sapmasını temsil eder. Panel D' de araç ve berberin arasındaki sonuçlardaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi.

Yetersayı algılayan kontrollü lüks destekleyici içeren bir S. aureus muhabir suşu kullanılarak , H. canadensis yaprak özütü çekirdek quenching mekanizması hakkında fikir edinmek için başka deneyler yapılmıştır [ 27 ]. Bu lux muhabir suşu, agrBD genlerindeki bir silme nedeniyle kendi AIP'sini yapmaz . Ortama AIP-1 eklendiğinde, lüks haberci açılır ve biyolüminesans oluşturur. Bu muhabir türü, AgrCA iki bileşenli sistemin (Şekil 1) söndürme eyleminin hedefi olabilir. Sabit seviyede AIP-1 içeren numuneler oluşturduk, bunları çeşitli alt inhibitör konsantrasyonlarda H. canadensis (0-75 µg / mL, berberine standardize edilmiş) ile birleştirdik, bu karışımları muhabir suşlara maruz bıraktık ve biyolüminesansı ölçtük (Şekil 5). AgrCA'nın ekstraktın bazı bileşenlerinin olası bir hedefi olduğunu düşündüren doza bağlı inhibisyon gözlemledik. Bu hipotezi desteklemek için, özüt, bir AgrC rekabetçi antagonisti AIP-2 (Şekil 5). En belirgin inhibisyon mekanizması, hücre dışı ortama maruz kalan ve eksojen ajanlara karşı savunmasız olan AgrC üzerindeki AIP reseptörüdür [ 5 ]. Bu reseptöre bağlanma, lux muhabiri tarafından gözlenen biyolüminesans baskılanmasına neden olacaktır . Bununla birlikte, gözlemlenen etki için alternatif bir açıklama, aktif bileşiğin, yeni bir etkileşim yoluyla AIP'yi sekestre etmesi veya inaktive etmesi veya muhtemelen agr P3 promotörünü farklı bir düzenleyici mekanizma yoluyla bastırmasıdır .

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms710121f5.jpg'dir.

S. aureus agr lux muhabirinin H. canadensis yaprak ekstresi ile inhibisyonu . Eksojen AIP-1'e yanıt veren bir S. aureus lux muhabir suşu kullanıldı. Sabit bir AIP-1 seviyesi ekstrakt ile karıştırıldı, lux raportör ile inkübe edildi ve biyolüminesans ölçüldü. Ekstrakt, berberine standardize edildi ve 10–80 µg / mL konsantrasyon aralığına eklendi. Pozitif kontrol olarak bilinen bir inhibitör olan AIP-2 kullanıldı. Bildirilen değerler, ortalamanın standart sapmasını temsil eden hata çubukları ile dörtlü test kuyularının ortalamasını temsil eder ve * araca kıyasla p <0.0001'i gösterir (iki kuyruklu bir öğrencinin t-testi ile hesaplanmıştır).

H. canadensis yaprak özütünün gözlenen yetersayı çoğaltma aktivitesinin alaka düzeyinin başka bir kanıtı olarak, S. aureus tarafından alfa toksin üretimi üzerindeki etkisini araştırdık . Alfa toksin, deri apsesi dermonekrozunun birincil nedenidir [ 26 ] ve bu nedenle, potansiyel olarak H. canadensis biyoaktivitesi ile ilgilidir. Bu toksin hla geni tarafından kodlanır ve agr çekirdek algılama sisteminin doğrudan kontrolü altındadır [ 5 ]. USA300 suşu AH1263, artan özüt konsantrasyonları ile inkübe edildiğinde, alfa-toksin seviyeleri immünoblot ile değerlendirildiği gibi uyum içinde azaldı (Şekil 6A). Bu bulgular, transkripsiyonel raportör tahlil sonuçlarını doğrular (Şekiller 4 ve ve5).5). Beklendiği gibi, immünoblot için bir kontrol olarak dahil edilen USA300 Δ hla mutantı alfa toksin üretmedi.

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms710121f6.jpg'dir.

Bir H. canadensis özütü, MRSA toksin üretimini inhibe eder ve insan keratinosit (HaCaT) hücrelerine zarar verir. MRSA (OD ₆₀₀ = 0.1) özüt veya araç kontrolünün berberin ile normalize edilmiş konsantrasyonlarında (10, 20, 40, 60 ve 80 ug / mL) özütlenmeye maruz bırakıldı ve 11 saat süreyle inkübe edildi. Harcanan ortam toplandı ve alfa-toksin immünoblotları gerçekleştirildi ( A ). Konfluent HaCaT hücreleri katmanları oluşturuldu ve aynı ekstraktla işleme tabi tutulan örnekler, bir laktat dehidrojenaz testi ( B ) ile hasarı değerlendirmek için hücrelerle inkübe edildi . Kontroller olarak alfa toksin ( hla ) ve agrçekirdek algılayıcı mutantlar kullanıldı. % Liziz için bildirilen değerler, üçlü test kuyularının ortalamalarıdır (ortalamanın standart sapmasını temsil eden hata çubukları ile) ve p- değerleri, iki kuyruklu bir öğrenci t-testi ile hesaplanmıştır.

İlişkilendirmek için H. canadensis deri enfeksiyonları için yaprak ekstresi çekirdek söndürme gözlemler, kültürlü insan keratinosit hücreleri (HaCaT) MRSA etkileşimleri değerlendirmek için bir test kullanılabilir. Agr sisteminin inhibisyonunun veya alfa toksinindeki mutasyonların, cilt apse oluşumunu azalttığı [ 5 , 28 ] emsaline dayanarak, kontroller olarak MRSA yabani tip ve mutant suşları test ettik. USA300 suşu AH1263'ten harcanan ortam veya Δ agr veya Δ hla mutasyonuna sahip türevler, HaCaT hücrelerine maruz bırakıldı ve hücre canlılığı, bir laktat dehidrojenaz (LDH) salım deneyi kullanılarak değerlendirildi (Şekil 6B). Beklendiği gibi, vahşi tip USA300 önemli hasara neden olurken (% 83 öldürme), Δ agr ve Δ hla mutantlarının HaCaT hücre bütünlüğü üzerinde neredeyse hiçbir etkisi yoktu. USA300 suşunun bir H. canadensis ekstresine (80 µg / mL) maruz bırakılmasından sonra, HaCaT hücrelerine USA300 hasarı% 38'e belirgin bir şekilde düştü. Bu sonuçlar, H. canadensis'in agr sisteminin inhibisyonunun, alfa toksin üretiminin azalmasına neden olduğunu ve bunun da insan derisi keratinositlerine verilen zararı azalttığını göstermektedir.

Sonuç olarak, verilerimiz, H. canadensis'in deri enfeksiyonlarını tedavi etmek için geleneksel kullanımına destek vermektedir . H. canadensis yaprak özleri, kısmen alkaloid berberine bağlı, ancak kanadin veya hidrastine bağlı olmayan doğrudan antimikrobiyal aktiviteye sahiptir. Önemlisi, antimikrobiyal aktivite, H. canadensis'in MRSA'ya karşı etki ettiği görülen birkaç mekanizmadan sadece biridir . Biz göstermektedir H. canadensis söndürmek alt inhibitör konsantrasyonlarında yaprağı özü AGRçekirdek algılama sistemi ve bu aktivitenin başlıca alkaloidler berberin, hidrastin veya kanadinden kaynaklanmadığı. Bu çekirdek söndürme etkisinin ortaya çıktığı en olası mekanizma, AgrCA iki bileşenli sistem yoluyla sinyal iletiminin zayıflatılmasıdır. Bu tür bir zayıflama, MRSA'ya maruz kalan H. canadensis tarafından toksin üretiminde gözlenen azalmaya neden olacaktır . Toplu olarak, sonuçlarımız, H. canadensis yaprak özütlerinin, farklı mekanizmalarla MRSA'ya karşı etki eden birkaç bileşen sınıfı içerdiğini göstermektedir . Bu tür bir karışımın, patojeni çoklu yollarla hedefleme yeteneği sayesinde, MRSA enfeksiyonlarının tedavisinde veya önlenmesinde tek başına bileşenlerinden daha iyi sonuç verirlik göstermesi beklenir. Bu tahmin gelecek ile değerlendirilebilirin vivo araştırmalar.

Ek materyal 01
Teşekkürler
Bu yayın, Ulusal Tamamlayıcı ve Alternatif Tıp Merkezi'nden (NCCAM) NBC'ye 1R15AT005005-01 ve 2R44AT003365-02 tarafından ve Ulusal Enstitülerin her iki bileşeni olan Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü'nden (NIAID) AI078921 tarafından desteklenmiştir . Sağlık (NIH). H. canadensis'e , Carol Ann McCormick'e kuponlarla yardım ettiği için ve Dr. Brandie M. Ehrmann'a kütle spektrometresi desteği sağladığı için teşekkür ederiz .

Şuraya gidin: Referanslar

1. Klevens RM, Morrison MA, Nadle J, Petit S, Gershman K, Ray S, Harrison LH, Lynfield R, Dumyati G, Townes JM, Craig AS, Zell ER, Fosheim GE, McDougal LK, Carey RB, Fridkin SK. Amerika Birleşik Devletleri'nde invazif metisiline dirençli Staphylococcus aureus enfeksiyonları. JAMA. 2007; 298 : 1763–1711. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
2. Roberts RR, Hota B, Ahmad I, Scott D, Foster SD, Abbasi F, Schabowski S, Kampe LM, Ciavarella GG, Supino M, Naples J, Cordell R, Levy SB, Weinstein RA. Chicago eğitim hastanesinde antimikrobiyal dirençli enfeksiyonların hastane ve toplumsal maliyetleri: Antibiyotik yönetimi için çıkarımlar. CID. 2009; 49 : 1175–1184. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
3. Waldor MK. Patojenleri etkisiz hale getirmek - antibiyotik gelişimi için yeni bir yaklaşım. Yeni Eng J Med. 2006; 354 : 296–297. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
4. Moran GJ, Krishnadasan A, Gorwitz RJ, Fosheim GE, McDougal LK, Carey RB, Talan DA. Acil servisteki hastalarda metisiline dirençli S. aureus enfeksiyonları. N Engl J Med. 2006; 355 : 666–674. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
5. Thoendel M, Kavanaugh JS, Flack CE, Horswill AR. Staphylococci'de Peptid Sinyali. Chem Rev. 2011; 111 : 117–151. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
6. Antunes LCM, Ferreira RBR, Buckner MMC, Finlay BB. Bakteriyel virülansta çoğunluk algılama. Mikrobiyoloji. 2010; 156 : 2271–2282. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
7. Mayville P, Ji G, Beavis R, Yang H, Goger M, Novick RP, Muir TW. Virülanstan sorumlu Staphylococcus aureus'tan sentetik oto indükleyici tiyolakton peptidlerinin yapı-aktivite analizi . Proc Natl Acad Sci. 1999; 96 : 1218–1223. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
8. Park J, Jagasia R, Kaufmann GF, Mathison JC, Ruiz DI, Moss JA, Meijler MM, Ulevitch RJ, Janda KD. Bakteriyel çekirdek algılama sinyalinin antikor bozulması yoluyla enfeksiyon kontrolü. Chem Biol. 2007; 14 : 1119–1127. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
9. Blumenthal M. Herb piyasa seviyeleri, beş yıllık patlamanın ardından. Herbalgram. 1999; 47 : 64–65. [ Google Scholar ]
10. Scazzocchio F, Cometa MF, Tomassini L, Palmery M. Hydrastis canadensis ekstraktının ve bunun başlıca izole edilmiş alkaloidlerinin antibakteriyel aktivitesi . Planta Med. 2001; 67 : 561–564. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
11. Jung HA, Beavers R, Parekh H, Coulburn J, Wu CD. Goldenseal ( Hydrastis canadensis ) yaprakları oral patojenlere karşı antimikrobiyal aktiviteye sahiptir. J Dent Res. 2006; 85 (Özel Sayı A): 475. [ Google Scholar ]
12. Mahady GB, Pendland SL, Stoia A, Chadwick L. Helicobacter pylori'nin Sanguinaria canadensis ve Hydrastis canadensis kaynaklı izokinolin alkaloidlerine in vitro duyarlılığı . Phytother Res. 2003; 17 : 217–221. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
13. Villinski JR, Dumas ER, Chai HB, Pezzuto JM, Angerhofer CK, Gafner S. Berberis thunbergii, Berberis vulgaris ve Hydrastis canadensis'in antibakteriyel aktivitesi ve alkaloid içeriği . Pharm Biol. 2003; 41 : 551–557. [ Google Scholar ]
14. Yu HH, Kim KJ, Cha JD, Kim HK, Lee YE, Choi NY, You YO. Metisiline dirençli Staphylococcus aureus'a karşı tek başına ve ampisilin veya oksasilin ile kombinasyon halinde berberinin antimikrobiyal aktivitesi . J Med Food. 2005; 8 : 454–461. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
15. Stermitz FR, Lorenz P, Tawara JN, Zenewicz LA, Lewis K. Tıbbi bir bitkide sinerji: Bir çoklu ilaç pompası inhibitörü olan 5'-metoksihidnokarpin ile güçlendirilmiş berberinin antimikrobiyal etkisi. Proc Nat Acad Sci. 2000; 97 : 1433–1437. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
16. Stermitz FR, Tawara-Matsuda J, Lorenz P, Mueller P, Zenewicz LA, Lewis K. 5'Methoxyhydnocarpin-D ve phenophorbide A: Dirençli Staphylococcus aureus'un berberin büyümesi inhibisyonunu güçlendiren Berberis türü bileşenleri . J Nat Prod. 2000; 63 : 1146–1149. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
17. Ettefagh KA, Burns JT, Junio HA, Kaatz GW, Cech NB. Goldenseal (Hydrastis canadensis L.) özleri, efluks pompası inhibisyonu yoluyla berberinin antibakteriyel aktivitesini sinerjik olarak arttırır. Planta Med. 2010; 77 : 835–840. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
18. Upton R. Goldenseal kökü Hydrastis canadensis: Analiz, kalite kontrol ve terapötik standartlar. Santa Cruz: Amerikan Bitkisel Farmakopesi; 2001. [ Google Scholar ]
19. Klinik ve Ev için Moore M. Herb Formülleri. Albuquerque, NM: Güneybatı Botanik Tıp Okulu; 1995. [ Google Scholar ]
20. Seybold U, Kourbatova EV, Johnson JG, Halvosa SJ, Wang YF, King MD, Ray SM, Blumberg HM. Sağlık bakımı ile ilişkili kan dolaşımı enfeksiyonlarının ana nedeni olarak toplumla ilişkili metisiline dirençli Staphylococcus aureus USA300 genotipinin ortaya çıkışı. Clin Infect Dis. 2006; 42 : 647–656. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
21. Highlander SK, Hultén KG, Qin X, Jiang H, Yerrapragada S, Mason EO, Shang Y, Williams TM, Fortunov RM, Liu Y, Igboeli O, Petrosino J, Tirumalai M, Uzman A, Fox GE, Cardenas AM, Muzny DM, Hemphill L, Ding Y, Dugan SB, PR, Buhay CJ, Dinh HH, Hawes AC, Holder M, Kovar CL, Lee SL, Liu W, Nazareth LV, Wang Q, Zhou J, Kaplan SL, Weinstock GM. İnce genetik değişiklikler, metisiline dirençli ve hassas Staphylococcus aureus'un virülansını artırır . BMC Microbiol. 2007; 7 : 99. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
22. Lauderdale KJ, Boles BR, Cheung AL, Horswill AR. Staphylococcus aureus Biyofilm Olgunlaşmasında Sigma B, agr ve Proteolitik Aktivite arasındaki bağlantılar . Infect Immun. 2009; 77 : 1623–1635. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
23. Boles BR, MT, Roth AJ, Horswill AR. Polisakkaritten bağımsız Staphylococcus aureus biyofilm oluşumunda rol oynayan genlerin tanımlanması . Plos Bir. 2010; 5 : e10146. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
24. Malone CL, Boles BR, Horswill AR. Synechocystis DnaB Mini-Intein Kullanılarak Peptidleri Oto İndükleyen Staphylococcus aureus Biyosentezi . Appl Environ Microbiol. 2007; 73 : 6036. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
25. Kirchdoerfer RN, Garner AL, Flack CE, Mee JM, Horswill AR, Janda KD, Kaufmann GF, Wilson IA. Bir çekirdek söndürme antikorunun ligand tanınması ve ayırt edilmesi için yapısal temel. J Biol Chem. 2011; 286 : 17351–17358. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
26. Kennedy AD, Wardenburg JB, Gardner DJ, Long D, Whitney AR, Braughton KR, Schneewind O, DeLeo FR. Alfa-Hemolizinin Aktif veya Pasif Bağışıklama ile Hedeflenmesi, Bir Fare Modelinde USA300 Deri Enfeksiyonunun Şiddetini Azaltır. J Infect Dis. 2010; 202 : 1050–1058. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
27. Thoendel M, Horswill AR. Peptit biyosentezini otomatik olarak indüklemek için gerekli Staphylococcus aureus AgrD kalıntılarının tanımlanması . J Biol Chem. 2009; 284 : 21828–21838. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
28. Pang YY, Schwartz J, Thoendel M, Ackermann LW, Horswill AR, Mide bulantısı WM. Staphylococcus aureus USA300'ün insan polimorfonükleer nötrofilleri ile agr-bağımlı etkileşimleri . J Doğuştan Bağışıklık. 2010; 2 : 546–559. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
29. Kiedrowski MR, Kavanaugh JS, Malone CL, Mootz JM, Voyich JM, Smeltzer MS, Bayles KW, Horswill AR. Nükleaz, toplulukla ilişkili metisiline dirençli Staphylococcus aureus'ta biyofilm oluşumunu modüle eder . PLoS ONE. 2011; 6 : e26714. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
30. Junio HA, Sy-Cordero AA, Ettefagh KA, Burns JT, Micko KT, Graf TN, Richter SJ, Cannon RE, Oberlies NH, Cech NB. Botanik İlaçların Sinerjiye Yönelik Fraksiyonasyonu: Goldenseal ( Hydrastis canadensis ) J Nat Prod. 2011; 74 : 1621–1629. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
31. Cech RA. Bitki Tıbbı Yapmak. Williams: Horizon Otları; 2000. s. 276. [ Google Akademik ]
32. Aerobik olarak çoğalan bakteriler için Seyreltme antimikrobiyal duyarlılık testleri için Yöntemler. 3. baskı. Villanova, PA: Klinik Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi; 1993. [ Google Scholar ]
33. Boukamp P, Petrussevska RT, Breitkreutz D, Hornung J, Markham A, Fusenig NE. Kendiliğinden ölümsüzleştirilmiş bir anöploid insan keratinosit hücre hattında normal keratinizasyon. J Cell Biol. 1988; 106 : 761–771. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
34. Amin AH, Subbaiah TV, Abbasi KM. Berberin sülfat: antimikrobiyal aktivite, biyoanaliz ve etki şekli. Can J Microbiol. 1969; 15 : 1067–1076. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
35. Hyeon-Hee Y, Kang-Ju K, Jeong-Dan C, Hae-Kyong K, Young-Eun L, Na-Young C, Yong-Ouk Y. metisiline dirençli Staphylococcus aureus . J Med Food. 2005; 8 : 454–461. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
36. Coulburn J, Chin YW, Parekh H, Yildiz S, Beaver R, Kinghorn AD, Wu CD. Hydrastis canadensis L. (Goldenseal) Yapraklarından Oral Antimikrobiyal Bileşikler . J Dent Res. 2007; 86 (Özel Sayı A): 2156. [ Google Scholar ]
37. Orta Appalachian bölgesinde Hydrastis canadensis L. (Ranunculaceae) ve Panax quinquefolius L.'nin (Araliaceae) dağılımı ve bolluğu .
38. Holtfreter S, Grumann D, Schmudde M, Nguyen HTT, Eichler P, Strommenger B, Kopron K, Kolata J, Giedrys-Kalemba S, Steinmetz I, Witte W, Bröker BM. Klinik Staphylococcus aureus izolatlarında süperantijen genlerinin klonal dağılımı . J Clin Microbiol. 2007; 45 : 2669–2680. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]

***maturidi*** · 03 April 2021, 22:52

Flukonazole Dirençli Patojenik Mayalarda Berberin Antifungal Aktivitesi: Candida spp.

Anderson Ramos da Silva , ^birJoão Batista de Andrade Neto , ^birCecília Rocha da Silva , ^birRosana de Sousa Campos , ^birRose Anny Costa Silva , ^birDaniel Domingues Freitas , ^birFrancisca Bruna Stefany Aires do Nascimento , ^birLarissa Nara Dantas de Andrade , ^aLetícia Serpa Sampaio , ^aThalles Barbosa Grangeiro , ^bHemerson Iury Ferreira Magalhães , ^cBruno Coêlho Cavalcanti , ^dManoel Odorico de Moraes ,^d ve Hélio Vitoriano Nobre Júnior
Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk reddi
Bu makale PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır .
Şuraya gidin: ÖZ

Mantar enfeksiyonlarının insidansı ve özellikle biyofilm oluşumu ile ilişkili mantar antibiyotik direnci insidansı, morbidite ve mortaliteye katkıda bulunarak önemli ölçüde artmıştır. Bu nedenle yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi gerekmektedir. Bu bağlamda, doğal ürünler, olası antifungal ajanların ana kaynağı olarak ortaya çıkmıştır. Berberine, Berberis aquifolium , Berberis vulgaris , Berberis aristata ve Hydrastis canadensis ve Phellodendron amurense gibi doğal bitkilerin köklerinden, rizomlarından ve gövde kabuğundan izole edilen protoberin tipi bir izokinolin alkaloididir.. Berberinin geniş antibakteriyel ve antifungal aktiviteye sahip olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, berberinin flukonazole dirençli Candida ve Cryptococcus neoformans suşlarına ve ayrıca Candida'nın biyofilm formuna karşı potansiyel antifungal etkisispp. değerlendirildi. Berberinin antifungal etkisi, bir sıvı mikrodilüsyon yöntemi (Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü'nün M27-A3 yöntemi) ve bileşiğin olası etki mekanizmasının da değerlendirildiği akış sitometri teknikleriyle belirlendi. Biyofilm değerlendirmesi için, bir kolorimetrik 3- (4,5-dimetil-2-tiyazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromür (MTT) deneyi, sabit hücrelerin duyarlılığını belirlemek için kullanıldı. Çalışmada kullanılan izolatlar, Federal Ceará Üniversitesi Biyoprospeksiyon Laboratuvarı ve Maya Deneyleri Laboratuvarı'na (LABEL) aitti. 24 ve 72 saat sonra, flukonazole dirençli Candida ve Cryptococcus neoformanssuşlar, sırasıyla 8 µg / ml ve 16 µg / ml'ye eşit berberin MİK'leri göstermiştir. Sitometrik analiz, berberin ile tedavinin plazma ve mitokondriyal membranların bütünlüğünde değişikliklere ve muhtemelen apoptoz nedeniyle hücre ölümüne yol açan DNA hasarına neden olduğunu gösterdi. Muameleden sonra biyofilm oluşturan izolatların değerlendirilmesi, biyofilm hücre aktivitesinde istatistiksel olarak önemli düşüşler gösterdi ( P <0.001).

Şuraya gidin: GİRİŞ

Mayalar, özellikle bağışıklığı baskılanmış hastaları etkileyen fırsatçı mantar enfeksiyonlarında en yaygın etkenlerdir ( 1 ). Candida mayaları, nozokomiyal enfeksiyonlarda görülen patojenlerdir. Candida spp. hastanelerde edinilen mantar enfeksiyonlarının en sık izole edilen üçüncü etkenidir ( 2 ) ve farklı tıp merkezlerindeki önemli prevalansları ve neden oldukları komplikasyonlar nedeniyle belirtilmektedir. Ayrıca bu enfeksiyonların teşhis edilmesi zordur ve% 50 ölüm oranlarına yol açar ( 3 , 4 ).

Fırsatçı ve patojenik mantar Cryptococcus neoformans , yaşamı tehdit eden menenjite neden olabilir. Her yıl, dünya çapında yaklaşık 1 milyon yeni kriptokokal menenjit vakasının meydana geldiği tahmin edilmektedir ve bu da C. neoformans enfeksiyonunu küresel bir halk sağlığı sorunu haline getirmektedir ( 5 , 6 ). Kriptokokoz tedavisi için antifungal ilaçlar bulunmasına rağmen, özellikle C. neoformans'ın antifungal ajanlara direnci nedeniyle birçok nedenden dolayı sıklıkla başarısız olurlar ( 7 ).

Diğer bir güncel sorun, biyofilmlerle ilişkili nozokomiyal enfeksiyonlardır. Bu enfeksiyonların tedavisi zordur çünkü bu mikrobiyal yapılar hem geleneksel antimikrobiyal ajanların aktivitesine hem de savunma mekanizmalarını barındırmaya dirençlidir. Candida spp. başlıca implante tıbbi cihazlarla ilişkili olan bu enfeksiyonlardan sorumlu ana organizmalardandır ( 2 ).

Bu bağlamda bitkisel antifungal ajanlar doğal kökenlerinden dolayı önem kazanmıştır ( 8 ). Berberine, Berberis aquifolium , Berberis vulgaris , Berberis aristat a, Hydrastis canadensis , Phellodendron amurense , Coptis chinensis ve Tinospora cordifolia ( 9 , - 11 ). Bazı çalışmalarda berberin özütünün bakteri, virüs, protozoa, mantar ve mayalara karşı önemli antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir ( 12 ).

Çalışmalar ayrıca berberinin Candida albicans suşlarına karşı önemli bir antifungal etkiye sahip olduğunu göstermiştir ( 13 , - 15 ).

Bu çalışmanın amacı, berberinin farklı flukonazole dirençli Candida ve Cryptococcus neoformans suşlarına karşı antifungal potansiyelini değerlendirmektir . Ek olarak, berberinin C. albicans'a etkisi ve Candida tropicalis tarafından üretilen biyofilmlere karşı aktivitesi , akış sitometri prosedürleri ve standart bir tek hücreli jel elektroforezi (kuyruklu yıldız) testi ile değerlendirildi.

MALZEMELER VE YÖNTEMLER
İzole eder.
Merkezi Halk Sağlığı Laboratuvarı'nda (LACEN-CE) kan örneklerinden izole edilen ve Ceara Federal Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'ne bağlı Maya Biyoprospeksiyon Laboratuvarı ve Maya Deneyleri Laboratuvarı'ndan Maya Koleksiyonunun bir parçası olan on bir Candida suşu ( LABEL / FF / UFC) ve iki ATCC suşu ( Candida parapsilosis ATCC 22019 ve Candida krusei ATCC 6258) kullanıldı. Suşlar, Sabouraud dekstroz agar (HiMedia, Mumbai, Hindistan) içinde aşılanmış ve 24 saat 37 ° C'de inkübe edilmiştir. Daha sonra suşlar , saflıklarını değerlendirmek için CHROMagar Candida (HiMedia) içinde büyütüldü .

Moleküler tanımlama.
Genomik DNA, daha önce tarif edildiği gibi ( 16 ) setiltrimetilamonyum bromür (CTAB) yüzey aktif maddesine dayanan bir protokol kullanılarak saflaştırıldı . Dahili kopyalanmış aralayıcı 1 (ITS1), ITS2 ve 5.8S rRNA genini içeren nükleer DNA bölgesi, primer ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ′) ve ITS5 (5′-GCAAGTAAAAGTCGTAACAAGA-3 ′) kullanılarak PCR ile amplifiye edildi. White ve ark. ( 17 ). Amplifikasyon reaksiyonları (300 ng ila 400), 1 x GoTaq reaksiyon tamponu (Promega, Madison, WI, ABD), 1.5 mM MgC! Genomik DNA ihtiva 25 ul, nihai hacim içinde gerçekleştirilmiştir ₂, Her biri 200 μM deoksinükleosit trifosfat (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, ABD), her bir primer için 0,5 μM ve 1,25 U GoTaq DNA polimeraz (Promega). Reaksiyonlar, bir başlangıç denatürasyon adımı (95 ° C'de 2 dakika) için programlanmış bir Mastercycler gradyan termosiklörde (Eppendorf, Hamburg, Almanya) gerçekleştirildi, ardından 95 ° C'de 1 dakika, 60 ° C'de 1 dakika, 35 döngü, ve 72 ° C'de 3 dakika. Son döngüyü 72 ° C'de 10 dakikalık bir son inkübasyon izledi. DNA hariç reaksiyon karışımının tüm bileşenlerini içeren kontrol numuneleri, DNA kontaminasyonunun meydana gelmediğini test etmek için kullanıldı. Amplifikasyon özgüllüğü,% 1.0 agaroz jel elektroforezi ( 18). Kalan amplifiye ürünler, bir Illustra GFX PCR DNA ve jel bant saflaştırma kiti (GE Healthcare Life Sciences) kullanılarak saflaştırıldı. Saflaştırılmış amplikonların konsantrasyonları, 260 nm'de 10 kat seyreltme emilimi ölçülerek belirlendi. DNA dizilimi, Sanger zincir sonlandırma yöntemi kullanılarak Macrogen Inc.'de (Seul, Güney Kore) gerçekleştirildi. Her amplikonun her iki ipliği, ITS4 ve ITS5 primerleri kullanılarak sekanslandı. Daha sonra, diziler Phred / Phrap / Consed paketi ( 19 , - 21 ) kullanılarak birleştirildi. ITS1 ve ITS2 dizilerinin başlangıcı ve bitişi, ITSoneDB ( 22 ) ve ITS2'den ( 23) veritabanları, sırasıyla. ITS / 5.8S dizileri GenBank veri tabanına kaydedildi ve BLAST programı ( 24 ) kullanılarak kamuya açık DNA dizisi veri tabanlarında bulunanlarla karşılaştırıldı .

In vitro antifungal aktivite.
Et suyu mikrodilüsyon (BMD) duyarlılık testi, 0.165 M MOPS (morfolinpropansülfonik asit) ile tamponlanmış RPMI 1640 sıvı besi yeri (pH 7.0) kullanılarak Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü'nün (CLSI) ( 25 ) M27-A3 dokümanındaki yönergelere göre gerçekleştirilmiştir. (Sigma Chemical, St. Louis, MO). Flukonazol (FLC; Merck Sharp & Dohme, São Paulo, Brezilya) damıtılmış su içinde çözüldü ve berberin klorür çözeltisi (Sigma Chemical) dimetil sülfoksit (DMSO; Sigma Chemical) içinde hazırlandı. FLC ve berberin, 0.125 ila 64 ug / ml arasında değişen konsantrasyonlarda test edilmiştir. Mayalar ve bileşikler, 96 oyuklu kültür plakalarında 35 ° C'de 24 saat inkübe edildi ve sonuçlar CLSI tarafından önerildiği gibi görsel olarak incelendi ( 26). Her bileşiğin MIC'si, mantar büyümesini% 50 inhibe eden konsantrasyon olarak belirlendi. Kesme noktaları, CLSI dokümanı M27-S4 ( 26 ) ' deki bilgilere göre belirlendi . C. parapsilosis ATCC 22019 ve C. krusei ATCC 6258 suşları kontrol olarak kullanılmıştır ( 25 ).

Etki mekanizması çalışmaları.
Hücre yoğunluğunu, membran bütünlüğünü, mitokondriyal transmembran potansiyelini (m) ve DNA hasarını (kuyruklu yıldız testi) değerlendirmek için, flukonazole dirençli C. albicans 2 suşu, artan berberin konsantrasyonlarına (MIC, 2 × MIC, ve 4 × MIC). Tüm testler, üç bağımsız deneyde üç kez gerçekleştirildi.

Maya süspansiyonunun hazırlanması.
Hücre süspansiyonları, üslü büyüme fazındaki kültürlerden hazırlandı. Hücreler, santrifüjleme ile toplandı ( 4 ° C'de 10 dakika süreyle 1.600 x g ) ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle 1.200 x g'de santrifüjleme yoluyla% 0.85 salin solüsyonu ile iki kez yıkandı . Daha sonra, bunlar (-10 yeniden süspansiyon haline getirildi ⁶ HEPES tampon içinde, hücre / ml),% 2 glikoz ile desteklenmiş (pH 7.2). Amfoterisin B (AMB; 4 μg / ml; Sigma Chemical) hücre ölümü kontrolü olarak kullanıldı ( 27 , 28 ).

Hücre yoğunluğu ve zar bütünlüğünün belirlenmesi.
Fungal suş hücre yoğunluğu ve membran bütünlüğü, 2 mg / litre propidyum iyodür (PI) dışlanarak değerlendirildi. Berberin, FLC ve AMB ile 24 saat inkübe edilen mayalardan alınan alikotlar, akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi. Deney başına toplam 10.000 olay değerlendirildi ( n = 2) ve hücresel kalıntı analizden çıkarıldı. Hücre floresansı, bir Guava EasyCyte minisystem sitometresi (Guava Technologies Inc., Hayward, CA, ABD) kullanılarak akış sitometrisi ile belirlendi ve sonuçlar CytoSoft (sürüm 4.1) yazılımı ( 29 , 30 ) kullanılarak analiz edildi .

Δψm ölçümü.
Um, 24 saatlik maruziyetten sonra maya hücrelerinin mitokondrileri tarafından rodamin 123 boya tutulmasının ölçülmesiyle belirlendi. Hücreler fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı, 5 mg / litre rodamin 123 ile 37 ° C'de karanlıkta 30 dakika süreyle inkübe edildi ve sonra iki kez PBS ile yıkandı. Floresans, akış sitometrisi (Guava EasyCyte minisystem) ile ölçüldü. Deney başına toplam 10.000 olay değerlendirildi ( n = 2) ve hücresel kalıntı analizden çıkarıldı ( 27 , 30 ).

Maya alkali kuyruklu yıldız deneyi.
Bir alkalin kuyruklu yıldız deneyi, esasen Miloshev et al. ( 31 ). Her lam üzerine 200 ul'ye kadar% 0.5 agaroz yayıldı ve bu destekleyici agaroz tabakası, hücre süspansiyonunun uygulanmasından önce havayla kurutuldu. C. albicans 2 hücreleri, 5 dakika boyunca bir Eppendorf mikrosantrifüjünde santrifüj yoluyla toplandı. Daha sonra, hücreler, damıtılmış su ile yıkanmış ve S tampon maddesi (1 M sorbitol, 25 mM KH içerisinde yeniden süspanse edildi ₂ PO ₄ , pH 6.5). Yaklaşık 5 alikotları x 10 ⁴hücreler, 2 mg / ml Zymolyase 20T (Seikagaku Corp., Japonya) içeren% 0.7 düşük erime noktalı agaroz ile karıştırıldı ve ardından hücreler, slaytlar üzerine yayıldı. Slaytlar daha sonra lameller ile kapatıldı ve 20 dakika 30 ° C'de inkübe edildi. Endojen hücre enzim aktivitesini en aza indirmek için, tüm diğer prosedürler soğuk bir odada 8 ila 10 ° C'de gerçekleştirildi. Lameller çıkarıldı ve sferoplastları lize etmek için lamlar 30 mM NaOH, 1 M NaCl,% 0.1 laurilsarkosin ve 50 mM EDTA (pH 12.3) içinde 1 saat inkübe edildi. Lamlar, DNA'yı çözmek için 30 mM NaOH ve 10 mM EDTA (pH 12.4) içinde her seferinde 20 dakika boyunca üç kez durulanmıştır. Daha sonra, slaytlar aynı tamponda elektroforeze tabi tutuldu. Elektroforez, 0.5 V / cm ve 24 mA'da 20 dakika süreyle yapıldı. Elektroforezden sonra, jeller, slaytların 10 dakika boyunca 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 içine daldırılmasıyla, ardından% 76 ve% 96 etanol içinde arka arkaya 10 dakikalık inkübasyonlar yoluyla nötralize edildi. Son olarak, slaytlar havada kurumaya bırakıldı, etidyum bromür (1 mg / ml) ile boyandı ve floresan mikroskobu (32 ). Ek DNA hasarını önlemek için yukarıda bahsedilen tüm adımlar karanlıkta gerçekleştirildi. Rastgele seçilen 100 hücrenin görüntüleri (iki kopya slaydın her birinden 50 hücre) her deney grubu için analiz edildi. Hücreler görsel olarak puanlandı ve kuyruk boyutuna göre beş sınıftan birine atandı (hasarsız [sınıf 0] 'dan azami hasarlı [sınıf 4]' e) ve her hücre örneği için bir hasar indeksi değeri hesaplandı. Bu nedenle hasar indeksi değerleri 0 (tamamen hasar görmemiş, 100 hücre × 0) ile 400 (maksimum hasar, 100 hücre × 4) ( 33 ) arasında değişiyordu . DNA hasarının bir göstergesi olarak kabul edilen kuyruklu hücrelerin sıklığı, kuyruklu hücre sayısı (DNA ipliği kopmaları) ve kuyruksuz hücre sayısı ( 28 ,29 ).

Maya DNA'sının oksitlenmiş pürin ve pirimidin bazlarının analizi.
Alkalin kuyruklu yıldız deneyi yukarıda tarif edildiği gibi yapıldı. Lamlar, liziz çözeltisinden çıkarıldı ve üç kez bir enzim tamponunda (40 mM HEPES, 100 mM KCl, 0.5 mM EDTA, 0.2 mg / ml bovin serum albümini, pH 8.0) yıkandı. Daha sonra drene edildiler ve 70 µl formamidopirimidin DNA-glikosilaz (FPG) ile 30 dakika 37 ° C'de inkübe edildi. Grup başına rastgele seçilen 100 hücrenin görüntüleri (iki kopya slaydın her birinden 50 hücre) görsel olarak analiz edildi. Oksitlenmiş pürinlerin (FPG'ye duyarlı bölgeler) sayısı, kontrol örneklerinde (sadece tamponla inkübe edilen örnekler) gözlenen iplik kopuşlarının miktarı, FPG inkübasyonundan sonra elde edilen toplam kırılma miktarından çıkarılarak belirlendi ( 27 , 29 ).

Annexin V boyama.
İşlemden geçirilmiş ve işlem görmemiş C. albicans hücreleri, santrifüjleme ile toplandı ve 2 mg / ml Zymolyase 20T (Seikagaku Corp., Japonya) ile potasyum fosfat tamponu (PPB) artı 1 M sorbitol (pH 6.0) ile 2 saat 30 ° C'de sindirildi. C. albicans protoplastları, bir FITC-anneksin V apoptoz saptama kiti (Guava Nexin kiti; Guava Technologies, Inc., Hayward, CA, ABD) kullanılarak floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli annexin V ve PI ile boyandı. Daha sonra hücreler, PPB ile yıkandı ve 5 ul / ml FITC-anneksin V ve 5 ul PI içeren bir anneksin bağlama tamponunda 20 dakika süreyle inkübe edildi. Hücreler daha sonra akış sitometrisi (Guava EasyCyte minisystem) ile analiz edildi. Her deney için ( n = 2), 10.000 olay değerlendirildi ve hücre döküntüsü analizden çıkarıldı (29 , 30 ).

Biyofilm canlılığı.
Biyofilm oluşumu, Pierce ve ark. ( 34 ), mikrotitre plakaları kullanarak modifikasyonlarla. Bu test için, Candida tropicalis suşu 2 (bkz.tablo 1) 20 ila 24 saat boyunca 35 ° C'de maya ekstraktı-pepton-dekstroz içinde inkübe edildi. Daha sonra hücreler, 3,000 x g'de 5 dakika süreyle santrifüjlenerek toplandı ve iki kez PBS tampon çözeltisi ile yıkandı. Peletler bir kez daha süspansiyon haline getirilmiş ve hücre yoğunluğu 1.0 x 10 'a ayarlanmıştır ⁶RPMI 1640 (Cultilab, São Paulo, Brezilya) içinde hücre / ml. 24 saat sonra oyuklar üç kez PBS ile yıkandı. Berberine, 4,68 ila 600 μg / ml arasındaki konsantrasyonlarda test edilmiştir. 24 saatlik canlı bir biyofilm içeren her kuyuya 200 ul ilaç solüsyonu eklenmiştir. Plakalar 24 saat 35 ° C'de inkübe edildi. Biyofilm hücrelerinin metabolik aktivitesinin ölçümü, 3- (4,5-dimetil-2-tiyazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromür (MTT; 1 mg / ml) kolorimetrik deney kullanılarak değerlendirildi. Sonuçların okunması bir mikroplaka okuyucusunda 540 nm'de ( 35 , 36 ) yapıldı.

TABLO 1

Berberinin, FLC'ye dirençli Candida spp. ve C. neoformans , Brezilya, Ceara'da izole edilmiştir.

Candida tropicalis 1	Kan	KJ740185	32	8
Candida tropicalis 2	Kan	KJ740181	16	8
Candida albicans 1	Kan	KJ740176	16	8
Candida albicans 2	Kan	KJ740174	32	8
Candida albicans 3	Kan	KJ740179	32	8
Candida parapsilosis 1	Kan	KJ740191	32	8
Candida parapsilosis 2	Kan	KJ740188	16	8
Cryptococcus neoformans 1	Kan	KJ740165	64	16
Cryptococcus neoformans 2	Kan	KJ740167	64	16
Cryptococcus neoformans 3	Kan	KJ740166	64	16
Cryptococcus neoformans 4	İdrar	KJ740168	64	16
Candida krusei ATCC 6258			16	4
Candida parapsilosis ATTC 22019			1	16

L929 hücre yetiştiriciliği.
L929 hücreleri, Earle tuzları ile minimum temel ortamda standart koşullar altında yetiştirildi. Tüm kültür ortamı,% 10 fetal bovin serumu, 2 mM glutamin, 100 ug / ml penisilin, ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş ve hücreler,% 5 CO ile 37 ° C 'de kültürlenmiştir ₂ . Sitotoksik etkilerin değerlendirilmesi için hücreler, test maddeleriyle tedaviden 2 gün önce büyütüldü. Daha sonra ortam, kontrol olarak test maddesini veya dimetil sülfoksit (DMSO) çözeltisini içeren taze ortam ile değiştirildi. Kültür ortamındaki nihai DMSO konsantrasyonu,% 0.1'den (hacim / hacim) daha düşük bir seviyede sabit tutuldu.

MTT testi kullanılarak L929 hücre proliferasyon inhibisyonu.
Hücre büyümesi, canlı hücrelerin sarı boya MTT'yi (Sigma-Aldrich) mor formazan ürününe indirgeme kapasitesi temelinde ölçüldü. V79 Hücreler, 96 gözlü levhalar (0.3 x 10 ekildi ⁶hücre / oyuk) ve% 0.1 DMSO içerisinde çözündürülmüş test bileşikleri (0.039 ila 25 ug / ml), her bir oyuğa ilave edildi, ardından standart yetiştirme koşulları altında 24 saat inkübasyon yapıldı. Daha sonra plakalar santrifüjlendi ve ortam 0.5 mg / ml MTT içeren taze ortam (150 ul) ile değiştirildi. Üç saat sonra, MTT formazan ürünü 150 ul DMSO içinde çözüldü ve absorbans, bir çoklu levha okuyucu (Spectra Count; Packard, Kanada) kullanılarak ölçüldü. Test maddelerinin etkileri, 595 nm'de indirgenmiş boyanın kontrol absorbans yüzdesi olarak ölçüldü. Deneyler ikili olarak yapıldı ve en az üç kez tekrarlandı ( 29 , 37 ).

İstatistiksel analiz.
In vitro duyarlılık deneyleri farklı günlerde en az üç kez tekrarlandı. MIC sonuçlarını karşılaştırmak için geometrik ortalamalar kullanıldı. Akış sitometrisi ve alkalin kuyruklu yıldız deneylerinden elde edilen veriler, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Newman-Keuls testi ( P <0.05) kullanılarak karşılaştırıldı. Biyofilm canlılığı testinden elde edilen ortalama değerler parametrik ANOVA ve ardından Tukey testi ile analiz edildi ( P <0.05).

Nükleotid dizisi erişim numaraları.
ITS / 5.8S dizileri, KJ740185 , KJ740181 , KJ740176 , KJ740174 , KJ740179 , KJ740191 , KJ740188 , KJ740165 , KJ740167 , KJ740166 ve KJ740168 erişim numaraları altında GenBank veritabanına kaydedildi .

SONUÇLAR
Moleküler tanımlama.
Maya suşlarından alınan nükleer ribozomal DNA'nın tüm ITS / 5.8S bölgesi (ITS1, 5.8S ve ITS2) amplifiye edildi ve sekanslandı ve sekanslar, GenBank veritabanında saklanan sekanslarla karşılaştırıldı (veriler gösterilmemiştir). BLAST araştırmaları, izolatlardan elde edilen sekansların, farklı izolatlar ve C. albicans ( n = 3), C. tropicalis ( n = 2), C. parapsilosis ( n = 2) ve Cryptococcus neoformans ( n = 4) suşları, gösterildiği gibitablo 1.

Berberin, FLC'ye dirençli Candida ve Cryptococcus neoformans suşlarının büyümesini inhibe eder .
Candida ve Cryptococcus neoformans suşlarının flukonazole duyarlılık profilleri , daha önce tarif edildiği gibi bir mikrodilüsyon tekniği ile değerlendirildi ( 23 ).tablo 1Candida suşları için 16 ila 32 μg / ml arasında değişen MIC'ler ve Cryptococcus neoformans suşları için 64 μg / ml olan MIC ile test edilen farklı suşların flukonazole duyarlılığındaki varyasyonu gösterir . İncelenen tüm suşlar berberin tarafından çeşitli derecelerde inhibe edildi.tablo 1berberinin, MIC'leri 8 ila 16 μg / ml arasında değişen klinik maya izolatlarına karşı potansiyel antifungal aktivitesini gösterir. Berberin için bu sonuçlar umut vericidir. Bu nedenle, berberinin Candida tropicalis suşları üzerindeki olası etki mekanizmasının akış sitometrik teknikler kullanılarak araştırılmasına karar verildi .

Berberin, C. albicans'ta hücre canlılığı kaybına ve plazma membran hasarına neden olur .
Berberin, konsantrasyona bağlı bir şekilde test edilen tüm konsantrasyonlarda canlı C. albicans hücrelerinin sayısını azaltmıştır (Şekil 1). Ayrıca bileşik, FLC'ye dirençli maya suşlarında (İncir. 2). Da gösterildiği gibiŞekil 1, flukonazole dirençli suşların azole maruz kalması, kontrol için olana kıyasla canlı hücrelerin sayısında bir azalmaya neden olmamıştır.

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı zac0061652290001.jpg'dir.

ŞEKİL 1
Berberinin C. albicans FLC'ye dirençli bir suşun canlı hücre sayısı üzerindeki etkisi . *, ANOVA ve ardından Newman-Keuls testi ile belirlenen kontrol sonuçlarına kıyasla P <0.05.

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı zac0061652290002.jpg'dir.

İNCİR. 2
MIC, 2 × MIC ve 4 × MIC'de berberinin, test edilen C. albicans FLC'ye dirençli suşların hücre membranlarının stabilitesi üzerindeki etkisi . *, ANOVA ve ardından Newman-Keuls testi ile belirlenen kontrol sonuçlarına kıyasla P <0.05.

Maya Δψm değişiklikleri berberin tarafından indüklenir.
Flukonazole 24 saat maruz kaldıktan sonra, flukonazole dirençli C. albicans 2 (Şek. 3). Bunun tersine, flukonazole dirençli bir C. albicans suşunda, çeşitli konsantrasyonlarda berberin ile tedaviden sonra mitokondriyal disfonksiyon gözlendi , bu da tedavinin mitokondriyal transmembran potansiyelinde bir azalmaya neden olduğunu düşündürüyor.Şek. 3).

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı zac0061652290003.jpg'dir.

ŞEK. 3
Flukonazole dirençli C. albicans suşlarının Δψm'sinin değerlendirilmesi . Hücreler rodamin 123 (50 nM) ile etiketlendi. Grafik, MIC, 2 × MIC ve 4 × MIC'de RPMI 1640 (kontrol), FLC (64 μg / ml), amfoterisin B (4 μg / ml) ve berberin ile 24 saat inkübe edilen suşların sonuçlarını göstermektedir. Mitokondriyal disfonksiyonu olan temsili FLC'ye dirençli Candida suşlarının hücrelerinin yüzdesi, 24 saat boyunca değerlendirildi. *, ANOVA ve ardından Newman-Keuls testi ile belirlenen kontrol sonuçlarına kıyasla P <0.05.

Maya hücresi fosfatidilserin dışsallaştırması.
24 saatlik maruziyetten sonra, flukonazol ile tek bir muameleden sonra haricileştirilmiş fosfatidilserinli hücrelerin yüzdesi, negatif kontrol kültürlerindekine çok yakındı (Şekil 4). 24 saatlik inkübasyondan sonra, MIC, 2 × MIC ve 4 × MIC'de berberin ile muamele edilen maya kültürleri , kontrol grubuna kıyasla apoptotik hücre yüzdesinde önemli artışlar ( P <0.05) gösterdi :% 22.64 ±% 7.52, Sırasıyla% 51,22 ±% 5,02 ve% 61,82 ±% 10,04.

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı zac0061652290004.jpg'dir.

ŞEKİL 4
Apoptozun erken bir aşamasında gözlenen fosfatidilserin eksternalizasyonu, anneksin V boyaması ile gösterilmiştir. Prob, fosfatidilserin lokalizasyonunun iç zardan dış zara doğru değişiminin tespit edilmesini sağladı. Floresans yoğunluğu, MIC, 2 × MIC ve 4 × MIC'de berberin ile tedavi edilen hücrelerdeki maruz kalan fosfatidilserin miktarını gösterir. Temsili FLC'ye dirençli C. albicans suşlarının anneksin V pozitif hücrelerinin yüzdesi, 24 saat boyunca değerlendirildi. *, ANOVA ve ardından Newman-Keuls testi ile belirlenen kontrol sonuçlarına kıyasla P <0.05.

DNA hasarı.
Şekil 5berberin ile indüklenen flukonazole dirençli C. albicans suşlarının DNA'sındaki hasar miktarını gösterir . DNA hasarı seviyeleri için tek hücrelerin analizi (Şekil 5), flukonazolün düşük seviyelerde DNA hasarına neden olduğunu gösterdi. Bunun aksine, 24 saat inkübasyondan sonra, maruz kalma C. albicans berberin önemli bir artış (sonuçlanmıştır P DNA şeridi kopma seviyeleri (<0.05)Şekil 5). 24 saat boyunca MIC, 2 × MIC ve 4 × MIC'de berberin ile tedavi edilen hücreler, sırasıyla 32 ± 5.68, 71 ± 5.8 ve 104 ± 14.11'lik hasar indeksi değerleri (keyfi birimler) sergilemiştir. Pozitif kontrol olarak kullanılan amfoterisin B, yüksek DNA ipliği kırılma seviyelerini indükledi. Ayrıca, bileşikler ayrıca oksitlenmiş pürin ve pirimidin miktarlarında önemli ( P <0.05) artışları teşvik etti (Şekil 6).

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı zac0061652290005.jpg'dir.

ŞEKİL 5
MIC, 2 × MIC ve 4 × MIC'de RPMI 1640 (kontrol), FLC (64 μg / ml), amfoterisin B (4 μg / ml) ve berberin ile 24 saatlik inkübasyonun DNA hasar indeksi üzerindeki etkisi. *, ANOVA ve ardından Newman-Keuls testi ile belirlenen kontrol sonuçlarına kıyasla P <0.05.

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı zac0061652290006.jpg'dir.

ŞEKİL 6
FLC'ye dirençli C. albicans suşlarında oksidatif DNA hasarının dağılımı üzerinde farklı işlemlerin etkileri , kuyruklu yıldız testinin modifiye alkalin versiyonu (FPG ile) kullanılarak belirlendi. Mayalar, MIC, 2 × MIC ve 4 × MIC'de RPMI 1640 (kontrol), FLC (64 μg / ml), amfoterisin B (4 μg / ml) ve berberine maruz bırakıldı. *, ANOVA ve ardından Newman-Keuls testi ile belirlenen kontrol sonuçlarına kıyasla P <0.05.

Berberinin oluşan biyofilm üzerine etkisi.
Sunulan sonuçlara göre Şekil 7C. tropicalis 2 izolatı için berberin MIC değeri 37,5 μg / ml'den azdır. Berberinin antifungal etkileri, biyofilm hücrelerinin hücresel aktivitesinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalmaya neden oldu ( P <0.05), MIC, planktonik büyüme modunda aynı hücrelerle elde edilen MIC'den yaklaşık dört kat daha yüksekti.

Resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı zac0061652290007.jpg'dir.

Ayrı bir pencerede aç
ŞEKİL 7
MTT indirgeme testi ile analiz edilen, farklı berberin (A) ve flukonazol (B) konsantrasyonlarının, büyüyen ve olgunlaşan C. tropicalis biyofilmlerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisi . *, ANOVA ve ardından Newman-Keuls testi ile belirlenen kontrol sonuçlarına kıyasla P <0.05.

Berberinin memeli L929 hücrelerine karşı sitotoksik aktivitesi.
Berberinin memeli L929 hücrelerine karşı sitotoksik aktivitesi değerlendirildi. MTT testi ile analiz edildiği üzere, tedavi edilmeyen hücreler için olana ( P <0.05) kıyasla MIC'in% 95 güven aralığı 100 ug / ml'nin üzerinde olduğu için berberinin düşük sitotoksisite gösterdiğini vurgulamak ilginçtir .

Şuraya gidin: TARTIŞMA
Bu çalışmanın sonuçları berberinin flukonazole dirençli Candida ve Cryptococcus neoformans suşlarına karşı antifungal aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir . Bazı çalışmalara göre berberin, Candida suşlarına karşı bu çalışmanın bulguları ile uyumlu olarak önemli antifungal aktivite göstermiştir ( 15 , 38 ). Flukonazole dirençli Cryptococcus neoformans suşları için 16 μg / ml'lik bir MIC elde edildi . Bazı çalışmalar, örneğin, kullanılan berberin türevleri, bir ₉ - O -butil-13- (4-izopropilbenzil) berberin, berberin karşı mantar önleyici aktiviteye sahip olduğu rapor etmiştir C neoformanssuşlar ve önemli MIC'ler elde etti ( 39 , 40 ).

Suşlar, sitoflorometrik işaretleyici propidyum iyodür (PI) varlığında berberine maruz bırakıldığında, tedavi için kullanılan konsantrasyonlarda (MIC, 2 × MIC ve 4 × MIC). Dolayısıyla bu bulgu, berberinin hücre zarı hasarına ve hücre fonksiyonunun olası bozulmasına neden olduğunu göstermektedir. Veriler, Dhamgaye ve ark. ( 15 ), berberinin zar bütünlüğünde bir kayba neden olabileceğini ve bunun sonucunda hücre zarı geçirgenliğinin artmasına neden olabileceğini gösterdi. Flukonazol dirençli artan PI emme Candida hücreleri (berberin bileşikleri bu işaretçi ölü hücrelerin nükleer DNA yalnızca bağlanabildiği dikkate alınarak, hücre ölümünü destekleyen bir göstergesidir 41).

Bu çalışmanın sonuçları aynı zamanda berberin ile tedavi edilen hücrelerin Δψm değişikliklerini desteklediğini ve berberinin mitokondriyal solunum fonksiyonunu etkileyebileceğini, Δψm parçalanmasına ve mitokondride rodamin 123 birikiminin olmamasına neden olabileceğini düşündürmektedir ( 42 ). Δψm'nin çökmesi, zarlarda geçici gözenek açıklıklarına ve mitokondriyal proapoptotik faktörlerin sitozole salınmasına neden olabilir ( 43 ). Xu vd. ( 44 ), flukonazol ve berberin ile tedavinin flukonazole dirençli Candida albicans'ta Δψm'de bir artışa neden olduğunu göstererek , bu artışın ATP sentaz aktivitesi inhibe edildiğinde düşük ATP seviyesi ile birleştiğini düşündürdü.

Apoptozun geç evresinde, DNA parçalanması gibi morfolojik değişiklikler, bu tip hücre ölümünün geç bir belirteci olarak kabul edilir ( 45 ). Böylelikle flukonazole dirençli Candida albicans hücrelerinde berberinin apoptotik mekanizmayı tetikleyip tetiklemediği araştırıldı.

Kuyruklu yıldız testinin alkalin versiyonu (standart protokol), tek ve çift iplikli kırılmalar dahil olmak üzere hücreye verilen farklı DNA hasarını ölçmek için kullanılan hassas bir prosedürdür ( 46 ). Bu çalışmanın sonuçları, MIC, 2 × MIC ve 4 × MIC'de berberin ile muamele edilen hücrelerin DNA zincirlerinin toplam kırılma gösterdiğini ve artan berberin konsantrasyonları ile DNA zincir kırılmalarının daha önemli olduğunu gösterdi. DNA'daki oksidatif hasarı daha fazla değerlendirmek için, kuyruklu yıldız testinin alkalin versiyonu FPG varlığında gerçekleştirildi ( 27 , 47). Bu çalışmanın sonuçları, negatif kontrol (işlenmemiş hücreler) ile karşılaştırıldığında FPG enzimi ile muameleden sonra DNA hasarı indeksi olarak ifade edilen önemli DNA hasarının berberin ile tedaviden kaynaklandığını doğrulamaktadır.

DNA hasarındaki artış, muhtemelen FPG enziminin DNA içindeki purin bazlarını (adenin ve guanin) tanıma kapasitesinden kaynaklanıyordu. Li vd. ( 14 ) berberinin, C. albicans üzerinde güçlü bir antifungal etkiye sahip olduğunu , hücre döngüsü durmasına ve DNA hasarına neden olduğunu gösterdi. Diğer çalışmalar da berberinin DNA'ya bağlanabileceğini, DNA replikasyonunu ve transkripsiyonunu ve hücre döngüsünü etkileyebileceğini ileri sürdü ( 48 , 49 ).

DNA yoğunlaşması ve parçalanması, hücre ölümünde geri dönüşü olmayan adımları temsil eder ( 43 ). Apoptozun erken bir aşamada saptanması annexin V kullanılarak belirlenebilir. Ca2 ⁺ varlığında , bu işaretleyici apoptotik hücre zarlarında fosfatidilserine yüksek bir afinite ile bağlanır ( 43 ). Bununla birlikte, FITC-konjuge anneksin V ve PI ile çift boyama, erken apoptoz ve nekroz arasında ayrım yapılmasına izin verir ( 50 ). Bu çalışmada elde edilen verilere göre berberin, flukonazole dirençli C. albicans hücrelerinin apoptoz ile ölümüne neden olmaktadır .

Hastanelerde biyofilm oluşumu önemli bir problemdir, çünkü konukçu dokuda biyokütle oluşturmanın yanı sıra, Candida türleri hastanede yatan hastalarda implante tıbbi cihazlarda da büyüyebilir ( 51 ). Candida biyofilmlerinin önemli bir özelliği, genetik materyalin biyofilm hücreleri arasında aktarılmasıyla elde edilebilen veya elde edilebilen antifungal ajanlara dirençtir ( 52 ), bu da yeni tedavileri gerekli kılar.

Bu çalışmanın sonuçları, hem planktonik hücreleri hem de önceden oluşturulmuş biyofilm hücrelerini inhibe etmek için gerekli berberin konsantrasyonunun benzer olduğunu gösterdi. Bu, berberinin planktonik hücrelerin büyümesini azaltabileceğini ve sırasıyla 8 μg / ml ve 37.5 μg / ml konsantrasyonlarda önceden oluşturulmuş biyofilmlerdeki hücrelerin canlılığını inhibe edebileceğini gösterir. Bu bulgu önemlidir, çünkü biyofilmler sıklıkla geleneksel antifungal ajanlara karşı azalmış duyarlılıkla ilişkilidir.

MTT testi kullanılarak gerçekleştirilen memeli L929 hücreleri için berberinin sitotoksisite testlerinde, berberin düşük seviyelerde sitotoksisite göstermiştir. Bu çalışmanın sonuçları Gu ve ark. ( 53 ): berberin, L929 hücrelerinin morfolojisini yalnızca 100 μg / ml'den yüksek konsantrasyonlarda daha da değiştirdi. Bu bağlamda, bu bileşiğin gösterdiği antimikrobiyal aktivite ve düşük sitotoksik potansiyel, yeni bir antimikrobiyal olarak geliştirilmesi için umut verici bir kimyasal bileşik olduğunu ortaya koymaktadır.

Sonuç.
Bitki ürünlerinin geliştirilmesiyle ilgili çalışmalar eksiktir, ancak bu çalışma, flukonazole dirençli suşların böyle bir fitop ürün olan berberin ile tedavisinin, plazma ve mitokondriyal zarların bütünlüğündeki değişiklikleri teşvik ettiğini ve muhtemelen hücre DNA'sına yakın belirli bölgelerde etkili olduğunu göstermiştir. apoptoz nedeniyle ölüme yol açar. Çalışma ayrıca berberinin, in vitro olarak yetiştirilen flukonazole dirençli Candida tropicalis hücrelerinin oluşturduğu biyofilmlerin canlılığını azaltabileceğini gösterdi . Bu nedenle, antimikrobiyal aktivitesi nedeniyle berberin, antifungal özelliklere sahip umut verici bir molekül kaynağıdır.

Şuraya gidin: FİNANSMAN BEYANI
Bu çalışma, Ulusal Teknolojik ve Bilimsel Gelişim Konseyi (CNPq), Yüksek Seviye veya Eğitim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES / Brezilya) ve Bilimsel ve Teknolojik Gelişim için Ceara Destek Vakfı (FUNCAP) tarafından sağlanan hibe ve burslarla desteklenmiştir / Ceara).

Şuraya gidin: REFERANSLAR
1. Storti LR, Pasquale G, Scomparim R, Galastri AL, Alterthum F, Gambale W, Rodrigues Paula C. 2012. Candida spp. Brezilya, São Paulo eyaleti, Jundiaí Tıp Fakültesi Üniversite Hastanesinin Pediatri Ünitesindeki yatan hastalardan, çevreden ve sağlık pratisyenlerinden izole edilmiştir . Rev Soc Bras Med Trop 45 : 225–231. doi: 10.1590 / S0037-86822012000200017. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
2. Sardi JCO, Scorzoni L, Bernardi T, Fusco-Almeida AM, Mendes MJSG. 2013. Candida türleri: mevcut epidemiyoloji, patojenite, biyofilm oluşumu, doğal antifungal ürünler ve yeni tedavi seçenekleri . J Med Microbiol 62 : 10-24. doi: 10.1099 / jmm.0.045054-0. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
3. Arnold HM, Micek ST, Shorr AF, Zilberberg MD, Labelle AJ, Kothari S. 2010. Hastane kaynak kullanımı ve kandideminin uygunsuz tedavisinin maliyetleri . Farmakoterapi 30 : 361–368. doi: 10.1592 / phco.30.4.361. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
4. Nucci M, Queiroz-Telles F, Alvarado-Matute T, Tiraboschi IN, Cortes J, Zurita J. 2013. Latin Amerika'da kandidemi epidemiyolojisi: laboratuar tabanlı bir anket . PLoS One 8 : e59373. doi: 10.1371 / journal.pone.0059373. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
5. Dünya Sağlık Örgütü. 2011. Hızlı tavsiye: HIV ile enfekte yetişkinler, ergenler ve çocuklarda kriptokokal hastalığın teşhisi, önlenmesi ve yönetimi . Dünya Sağlık Örgütü, Cenevre, İsviçre. [ Google Scholar ]
6. Park BJ, Wannemuehler KA, Marston BJ, Govender N, Pappas PG, Chiller TM. 2009. HIV / AIDS ile yaşayan kişiler arasında kriptokokal menenjitin mevcut küresel yükünün tahmini . AIDS 23 : 525–530. doi: 10.1097 / QAD.0b013e328322ffac. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
7. Pfaller MA. 2012. Antifungal ilaç direnci: mekanizmalar, epidemiyoloji ve tedavi için sonuçlar . Am J Med 125 : S3 – S13. doi: 10.1016 / j.amjmed.2011.11.001. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
8. Zhang H, Gao A, Li F, Zhang G, Ho HI, Liao W. 2009. Candida albicans ilaç akış pompalarının doğal bir inhibitörü olan tetrandrinin etki mekanizması . Yakugaku Zasshi 129 : 623–630. doi: 10.1248 / yakushi.129.623. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
9. Misik V, Bezakova L, Malekova L, Kostalova D. 1995. Mahonia aquifolium'dan izole edilen protoberberin ve aporfin alkaloidlerin lipoksijenaz inhibisyonu ve antiantitoksina özellikleri . Planta Med 61 : 372–373. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
10. Bezakova L, Misik V, Malekova L, Svajdlenka E, Kostalova D. 1996. Mahonia aquifolium'dan izole edilen bisbenzilizokunolin alkaloidlerin lipoksijenaz inhibisyonu ve antioksidan özellikleri . Pharmazie 51 : 758–761. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
11. Chen J, Zhao H, Wang X, Lee FS, Yang H, Zheng L. 2008. Rhizoma coptidis'teki başlıca alkaloidlerin, farklı arkaplan elektrolitleri ile uçuş kütle spektrometresinin kapiler elektroforez-elektrosprey zamanı ile analizi . Elektroforez 29 : 2135–2147. doi: 10.1002 / elps.200700797. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
12. Tan W, Li Y, Chen M, Wang Y. 2011. Berberin hidroklorür: antikanser aktivitesi ve nanopartikülat dağıtım sistemi . Int J Nanotıp 6 : 1773–1777. doi: 10.2147 / IJN.S22683. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
13. Iwazaki RS, Endo EH, Ueda-Nakamura T, Nakamura CV, Garcia LB, Filho BP. 2010. Berberinin in vitro antifungal aktivitesi ve flukonazol ile sinerjizmi . Antonie Van Leeuwenhoek 97 : 201–205. doi: 10.1007 / s10482-009-9394-8. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
14. Li DD, Xu Y, Zhang DZ, Quan H, Mylonakis E, Hu DD, Li MB, Zhao LX, Zhu LH, Wang Y, Jiang YY. 2013. Flukonazol, flukonazole dirençli Candida albicans'ı öldürmek için berberine yardımcı olur . Antimicrob Agents Chemother 57 : 6016–6027. doi: 10.1128 / AAC.00499-13. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
15. Dhamgaye S, Devaux F, Vandeputte P, Khandelwal NK, Sanglard D, Mukhopadhyay G, Prasad R. 2014. Candida albicans'ta bitkisel antifungal alkaloid berberinin moleküler etki mekanizmaları . PLoS One 9 : e104554. doi: 10.1371 / journal.pone.0104554. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
16. Warner SAJ. 1996. Genomik DNA izolasyonu ve lambda kitaplığı yapımı , s 51-73. Olarak Foster GD, Twell D (ed), Bitki geni izolasyonu: prensipler ve uygulama . John Wiley & Sons, West Sussex, Birleşik Krallık. [ Google Scholar ]
17. White T, Bruns T, Lee S, Taylor J. 1990. Filogenetik için mantar ribozomal RNA genlerinin amplifikasyonu ve doğrudan sekanslanması , s 315-322. Gelen Innis MA, Gefland DH, Sninsky JJ, beyaz TJ (ed), PCR protokollerine: yöntem ve uygulamalar için bir rehber . Academic Press, San Diego, CA. [ Google Scholar ]
18. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Moleküler klonlama: bir laboratuvar el kitabı , 2. baskı Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. [ Google Scholar ]
19. Ewing B, Green P. 1998. Phred kullanarak otomatik sıralayıcı izlerinin temel çağrısı. II. Hata olasılıkları . Genome Res 8 : 186–194. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
20. Ewing B, Hillier L, Wendl MC, Green P. 1998. Phred kullanarak otomatikleştirilmiş sıralayıcı izlerinin temel çağrısı. I. Doğruluk değerlendirmesi . Genome Res 8 : 175–185. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
21. Gordon D, Abajian C, Green P. 1998. Consed: sekans tamamlama için grafiksel bir araç . Genome Res 8 : 195–202. doi: 10.1101 / gr.8.3.195. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
22. Santamaria M, Fosso B, Consiglio A, De Caro G, Grillo G, Licciulli F, Liuni S, Marzano M, Alonso-Alemany D, Valiente G, Pesole G. 2012. Metagenomikte taksonomik atama için referans veritabanları . Kısa Biyoinform 13 : 682–695. doi: 10.1093 / bib / bbs036. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
23. Keller A, Schleicher T, Schultz J, Müller T, Dandekar T, Wolf M. 2009. 5.8S-28S rRNA etkileşimi ve HMM tabanlı ITS2 notasyonu . Gene 430 : 50-57. doi: 10.1016 / j.gene.2008.10.012. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
24. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. 1990. Temel yerel hizalama arama aracı . J Mol Biol 215 : 403–410. doi: 10.1016 / S0022-2836 (05) 80360-2. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
25. Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü. 2008. Mayaların et suyu seyreltme antifungal duyarlılık testi için referans yöntem . Onaylı standart M27-A3 . Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü, Wayne, PA. [ Google Scholar ]
26. Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü. 2012. Mayaların et suyu seyreltme antifungal duyarlılık testi için referans yöntem; 4. bilgilendirme eki . CLSI belgesi M27-S4 . Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü, Wayne, PA. [ Google Scholar ]
27. Da Silva CR, De Andrade Neto JB, Sidrim JJC, Ângelo MRF, Magalhães HIF, Cavalcanti BC, Brilhante RSN, Macedo DS, De Moraes MO, Pinto Lobo MD, Grangeiro TB, Nobre Junior HV. 2013. Amiodaron ve flukonazolün flukonazole dirençli Candida tropicalis üzerindeki sinerjistik etkileri . Antimicrob Agents Chemother 57 : 1691–1700. doi: 10.1128 / AAC.00966-12. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
28. Da Silva CR, de Andrade Neto JB, de Sousa Campos R, Figueiredo NS, Sampaio LS, Magalhães HI, Cavalcanti BC, Gaspar DM, de Andrade GM, Lima IS, de Barros Viana GS, de Moraes MO, Lobo MD, Grangeiro TB, Nobre Júnior HV. 2014. Flavonoid kateşin, kersetin veya epigallokateşin gallatın flukonazol ile sinerjik etkisi, flukonazole dirençli Candida tropicalis'te apoptozu indükler . Antimicrob Agents Chemother 58 : 1468-1478. doi: 10.1128 / AAC.00651-13. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
29. Andrade Neto JB, da Silva CR, Neta MAS, Campos RS, Siebra JT, Silva RA, Gaspar DM, Magalhães HI, de Moraes MO, Lobo MD, Grangeiro TB, Carvalho TS, Diogo EB, da Silva Júnior EN, Rodrigues FA, Cavalcanti BC, Júnior HV. 2014. Farklı Candida türlerinin flukonazole dirençli suşlarına karşı in vitro naftokuinoid bileşiklerin antifungal aktivitesi : Candida tropicalis üzerindeki etki mekanizmalarına özel bir vurgu . PLoS One 9 : e93698. doi: 10.1371 / journal.pone.0093698. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
30. Andrade Neto JB, Silva CR, Campos RS, Nascimento FBSA, Freitas DD, Josino MAA, Andrade LND, Gonçalves TB, Mesquita JRL, Magalhães HIF, Rodrigues FAR, Gaspar DM, Moraes MO, Lobo MDP, Moreno FBMB, Grangeiro TB , Gomes AOCV, Nascente LC, Romeiro LAS, Cavalcanti BC, Nobre Júnior HV. 2015. Piperonal nitro türevlerinin Candida türleri üzerindeki etkileri: flukonazole dirençli suşlara karşı antifungal aktivite, oksidatif DNA hasarı ile ilişkilidir . Int J Curr Microbiol Appl Sci 4 : 777–792. [ Google Scholar ]
31. Miloshev G, Mihaylov I, Anachkova B. 2002. Tek hücreli elektroforezin maya hücrelerine uygulanması . Mutat Res 513 : 69–74. doi: 10.1016 / S1383-5718 (01) 00286-8. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
32. Pinkerton DM, Banwell MG, Garson MJ, Kumar N, De Moraes MO, Cavalcanti BC, Barros FWA, Pessoa C. 2010. Sentetik olarak türetilmiş tambjamin C ve EJ, BE-18591 ve deniz bakterisi Pseudoalteromonas tunicate . Chem Biodivers 7 : 1311–1324. doi: 10.1002 / cbdv.201000030. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
33. Collins AR. 2004. DNA hasarı ve onarımı için kuyruklu yıldız testi: ilkeler, uygulamalar ve sınırlamalar . Mol Biotechnol 26 : 249–261. doi: 10.1385 / MB: 26: 3: 249. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
34. Pierce CG, Uppuluri P, Tristan AR, Wormley FL Jr, Mowat E, Ramage G, Lopez-Ribot JL. 2008. Mantar biyofilmlerinin oluşumu ve antifungal duyarlılık testine uygulanması için basit ve tekrarlanabilir 96 kuyulu plaka tabanlı bir yöntem . Nat Protoc 3 : 1494–1500. doi: 10.1038 / nprot.2008.141. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
35. Hawser SP, Douglas LJ. 1994. İn vitro kateter materyallerinin yüzeyinde Candida türleri tarafından biyofilm oluşumu . Infect Immun 62 : 915–921. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
36. Rajput SB, Karuppayil SM. 2013. Acorus calamus rizomunun aktif bir prensibi olan β-Asarone, Candida albicans'ta morfogenezi, biyofilm oluşumunu ve ergosterol biyosentezini inhibe eder . Phytomedicine 20 : 139-142. doi: 10.1016 / j.phymed.2012.09.029. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
37. Cavalcanti BC, Bezerra DP, Magalhães HI, Moraes MO, Lima MA, Silveira ER, Câmara CA, Rao VS, Pessoa C, Costa-Lotufo LV. 2009. Kauren-19-oik asit, DNA hasarını ve ardından insan lösemi hücrelerinde apoptozu indükledi . J Appl Toxicol 29 : 560–568. doi: 10.1002 / jat.1439. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
38. Zhao M, Zhou ZT, Zhang WD. 2006. Radyoterapi veya kemoterapi ile baş ve boyun kanseri hastalarından izole edilen oral Candida'nın antifungal duyarlılık testi ve antifungal geleneksel Çin ilaçları taraması . Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi 24 : 131–134. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
39. Park KD, Cho SJ, Moon JS, Kim SU. 2010. 13- (4-izopropilbenzil) berberin türevlerinin yeni bir serisinin sentezi ve antifungal aktivitesi . Bioorg Med Chem Lett 20 : 6551-6554. doi: 10.1016 / j.bmcl.2010.09.045. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
40. Bang S, Kwon H, Hwang HS, Park KD, Kim SU, Bahn YS. 2014. 9- O -Butil-13- (4-izopropilbenzil) berberin, KR-72, gen ekspresyonunu düzenleyerek Cryptococcus neoformans büyümesini inhibe eden güçlü bir antifungal ajandır . PLoS One 9 : e109863. doi: 10.1371 / journal.pone.0109863. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
41. Xu C, Wang J, Gao Y, Lin H, Du L, Yang S, Long S, She Z, Cai X, Zhou S, Lu Y. 2010. Anthracenedion bileşiği bostrycin, Saccharomyces cerevisiae mayasında mitokondri aracılı apoptozu indükler. . FEMS Yeast Res 10 : 297–308. doi: 10.1111 / j.1567-1364.2010.00615.x. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
42. Ludovico P, Sansonetty F, Côrte-Real M. 2001. Akış sitometrisi ile maya hücre popülasyonlarında mitokondriyal membran potansiyelinin değerlendirilmesi . Mikrobiyoloji 147 : 3335–3343. doi: 10.1099 / 00221287-147-12-3335. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
43. Hwang I, Lee J, Jin HG, Woo ER, Lee DG. 2012. Amentoflavone, mitokondriyal disfonksiyonu uyarır ve Candida albicans'ta apoptotik hücre ölümüne neden olur . Mycopathologia 173 : 207–218. doi: 10.1007 / s11046-011-9503-x. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
44. Xu Y, Wang Y, Yan L, Liang RM, Dai DD, Tang RJ, Gao PH, Jiang YY. 2009. Proteomik analiz, flukonazole dirençli Candida albicans'a karşı flukonazol ve berberinin sinerjik bir mekanizmasını ortaya koymaktadır: endojen ROS artışı . J Proteome Res 8 : 5296–5304. doi: 10.1021 / pr9005074. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
45. Schiller M, Blank N, Heyder P, Herrmann M, Gaipl US, Kalden JR, Lorenz HM. 2005. Primer insan kan hücrelerinde ve çeşitli tümör hücre dizilerinde spermin metabolitleri tarafından apoptoz indüksiyonu . Apoptoz 10 : 1151–1162. doi: 10.1007 / s10495-005-1188-5. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
46. Burlinson B, Tice RR, Speit G, Agurell E, Brendler-Schwaab SY, Collins AR, Escobar P, Honma M, Kumaravel TS, Nakajima M, Sasaki YF, Thybaud V, Uno Y, Vasquez M, Hartmann A. 2007 . Genotoksitisi Test Dördüncü Uluslararası çalışma Grubu: sonuçları in vivo kuyruklu yıldız tahlil çalışma grubu . Mutat Res 627 : 31–35. doi: 10.1016 / j.mrgentox.2006.08.011. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
47. Cavalcanti BC, Barros FW, Cabral IO, Ferreira JR, Magalhaes HI, Junior HV, Da Silva Junior EN, De Abreu FC, Costa CO, Goulart MO, Moraes MO, Pessoa C. 2011. Nor-betalapachonein insanının preklinik genotoksikolojisi kültürlenmiş lenfositler ve Çin hamsteri akciğer fibroblastları . Chem Res Toxicol 24 : 1560–1574. doi: 10.1021 / tx200180y. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
48. Bhadra K, Kumar GS. 2011. Nükleik asit bağlanma izokinolin alkaloidlerinin terapötik potansiyeli: ilaç tasarımı için bağlanma yönleri ve etkileri . Med Res Rev 31 : 821–862. doi: 10.1002 / med.20202. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
49. Yadav RC, Kumar GS, Bhadra K, Giri P, Sinha R, Pal S, Maiti M. 2005. Berberine, güçlü bir polirboadenilik asit bağlayıcı bitki alkaloidi: spektroskopik, viskometrik ve termodinamik çalışma . Bioorg Med Chem 13 : 165-174. doi: 10.1016 / j.bmc.2004.09.045. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
50. Kojic EM, Darouiche RO. 2004. Tıbbi cihazların Candida enfeksiyonları . Clin Microbiol Rev 17 : 255–267. doi: 10.1128 / CMR.17.2.255-267.2004. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
51. Eisenberg, T, Carmona-Gutierrez D Buttner, S, Tavernarakis N, Madeo F. 2010. mayada Nekroz . Apoptoz 15 : 257–268. doi: 10.1007 / s10495-009-0453-4. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
52. Fanning S, Mitchell AP. 2012. Mantar biyofilmleri . PLoS Pathog 8 : e1002585. doi: 10.1371 / journal.ppat.1002585. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
53. Gu M, Xu J, Han C, Kang Y, Liu T, He Y, Huang Y, Liu C. 2015. Berberinin L929 murin fibroblast hücrelerinde hücre döngüsü, DNA, reaktif oksijen türleri ve apoptoz üzerindeki etkileri . Kanıta Dayalı Tamamlayıcı Alternat Med 2015 : 796306. doi: 10.1155 / 2015/796306. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

***maturidi*** · 03 April 2021, 23:05

Botanik tıp goldenseal'den ( Hydrastis canadensis ) antimikrobiyal fungal endofitler

Joseph M. Egan , ¹Amninder Kaur , ¹Huzefa A. Raja , ¹Joshua J. Kellogg , ¹Nicholas H. Oberlies , ¹ ve Nadja B. Cech ^1,^*
Yazar bilgileri Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk reddi
Bu makalenin yayıncının son düzenlenmiş versiyonu Phytochem Lett adresinde mevcuttur.
PMC'de yayınlanan makaleden alıntı yapan diğer makalelere bakın. İlişkili Veriler

Tamamlayıcı Malzemeler
Şuraya gidin: Öz

Fungal endofitlerin bitki kimyasını ve biyolojisini değiştirme veya katkıda bulunma potansiyeli, son zamanlarda büyük bir ilgi konusu olmuştur. Tıbbi olarak kullanılan bitkiler için, endofitlerin biyolojik aktivitede önemli bir rol oynayabileceği öne sürülmüştür. Bu çalışma ile, geleneksel tıpta enfeksiyonu tedavi etmek için kullanılan bir bitki olan tıbbi bitki goldenseal'den ( Hydrastis canadensis L., Ranunculaceae) antimikrobiyal fungal endofitleri belirlemeye çalıştık . H. canadensis köklerinin, yapraklarının ve tohumlarının yüzey sterilize edilmiş örneklerinden toplam 23 mantar kültürü elde edildi . Bu fungal endofitlerden on bir ikincil metabolit izole edildi, bunlardan beşi antimikrobiyal aktivite rapor etti. Hydrastis canadensisbitki materyali daha sonra yüksek çözünürlüklü güç kütle spektrometrisine bağlı sıvı kromatografisi kullanılarak mantar metabolitlerinin varlığı açısından analiz edildi. Antimikrobiyal bileşik alternariol monometil eter, hem fungal endofit Alternaria spp. H. canadensis tohumlarından ve H. canadensis tohum materyalinden elde edilen bir ekstraktın bir bileşeni olarak izole edilmiştir . Özellikle, Alternaria cinsinin mantarları , H. canadensis'in üç ayrı girişinden izole edilmiştir.5 yıllık bir zaman diliminde toplanan bitki materyali. Alternariol monometil eterin konsantrasyonu (kuru tohum materyalinde 991 mg / kg), ekolojik olarak önemli mantar endofitlerinin metabolitleri için önceden bildirilene benzer bir aralıktaydı. Bununla birlikte, tohum özlerinin kendileri antimikrobiyal aktiviteye sahip değildi.

Anahtar Kelimeler: Hydrastis canadensis , Endofitler, Sekonder Metabolitler, Mantarlar, Alternariol monometil eter
Şuraya gidin: Grafiksel Özet

Şuraya gidin: 1. Giriş

Bu çalışma, bitki dokularında asemptomatik olarak yaşayan endofitik mantarlar ve biyosentezledikleri ikincil metabolitlere odaklanmaktadır. Son zamanlarda, doğal ürün ilaç keşfi için bir kaynak olarak endofitik mantarlara büyük bir ilgi olmuştur ( Strobel, 2003 ; Suryanarayanan ve diğerleri, 2009 ). Ayrıca endofitik mantarların, kuraklık toleransının iyileştirilmesi ve koruyucu bileşiklerin üretilmesi dahil olmak üzere konakçı bitkiler üzerinde olumlu etkileri olabileceği de gösterilmiştir ( Bush ve diğerleri, 1997 ). Endofitik mantarların belirli biyoaktif bileşenlerinin insan patojenlerine karşı bir dizi farklı aktiviteye sahip olduğu ve yeni sitotoksisite mekanizmalarına sahip olduğu gösterilmiştir ( Strobel, 2003). Ayrıca, bazı mantar endofitleri, yaşadıkları botaniklerde mevcut oldukları bilinenlerle aynı biyoaktif bileşenleri üretirler, bu da bir endofitin etkisinin temel korumanın ötesine geçebileceğini düşündürür ( El-Elimat ve diğerleri, 2014 ; Kusari ve diğerleri ., 2013 ; Nisa vd., 2015 ; Stierle vd., 1993 ).

Bitki dokularında endofitik mantarlar bulunduğundan, endofitlerden kaynaklanan bileşiklerin botanik ekstraktların biyolojik aktivitesinde rol oynayabileceği öne sürülmüştür. Bunun, Echinacea purpurea özütlerinin in vitro aktivitesini değiştiren endofitik bakteriler için doğru olduğu gösterilen birkaç vaka olmuştur ( Pugh ve diğerleri, 2013 ; Todd ve diğerleri, 2015). Mantar sekonder metabolitlerinin güçlü biyolojik etkiler gösterebildiği iyi bilinmektedir, bu da mantar simbiyotlarının botanik özütlerin biyolojik aktivitesine katkıda bulunabileceği veya bunları değiştirebileceği hipotezini destekler. Bu çalışmanın amacı, botanik tıp goldenseal Hydrastis canadensis L.'nin (Ranunculaceae) antimikrobiyal aktivitesindeki mantar endofitlerinin potansiyel rolünü araştırmaktı .

Daha önce, H. canadensis'in bir dizi bakteriyel patojene karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu gösterilmiş ve bu aktivite öncelikle alkaloid berberine atfedilmiştir ( Hwang ve diğerleri, 2003 ; Scazzocchio ve diğerleri, 2001 ). Bununla birlikte, birkaç çalışma, goldenseal ham özütlerinin antimikrobiyal aktivitesinin, izole edilmiş berberine göre daha belirgin olduğunu (yaklaşık 2 kat) göstermiştir, bu da diğer bileşiklerin de bir rol oynaması gerektiğini düşündürmektedir ( Cech ve diğerleri, 2012 ). Bu çalışma ile, mantar endofitlerini H. canadensis'ten izole etmeye ve tanımlamaya çalıştık. bitki materyali ve fungal metabolitlerin goldenseal botanik ekstraktlarının kimyasına ve antimikrobiyal aktivitesine katkıda bulunup bulunmadığını belirleyin.

Şuraya gidin: 2. Sonuçlar

2.1 Endofit kimlikleri ve faaliyetleri

Hydrastis canadensis'ten toplam 23 izolat olan endofitik mantarlar kültürlenmiş ve tanımlanmıştır . Mantarlar, tam ITSrDNA fragmanlarına göre tanımlandı; yaklaşık 600–650 bp. Beş izolat Alternaria spp., Altı Colletotrichum fioriniae , üçü Diaporthe eres , dördü Diaporthe spp., İkisi Sordariomycete spp., Biri Magnaporthales spp., Biri Phoma sp. Ve biri Pyrenocheta cava olarak tanımlandı (tablo 1). Bir dizi mantar özütü, Staphylococcus aureus'a karşı belirgin antimikrobiyal aktiviteye sahipti , en belirgin aktivite Alternaria sp. ( Tablo S1 ). tablo 1

Endofitik mantarların kimlikleri. Kurum içi kimlik için G numaraları atandı ve OTU tanımlaması, ITS rDNA sıralaması aracılığıyla gerçekleştirildi

G09	Diaporthe eres	KX110385	Diaporthe eres (= Diaporthe cotonesteri; NR_119726 )	Yaprak	( Udayanga ve diğerleri, 2014 )
G10	Diaporthe sp.	KX110386	Diaporthe terebinthifolii ( NR_111862 )	Yaprak	( Gomes vd., 2013 )
G11	Sordariomycete sp. (Xylariales)	KX110387	Sordariomycete sp. NC1024 ( JQ761762 )	Yaprak	( U'Ren ve diğerleri, 2012 )
G12	Colletotrichum fioriniae	KX110388	Colletotrichum fioriniae ( NR_117474 , EF464594 ) ( JN709486 )	Kök	( Damm ve diğerleri, 2012 ; Shivas ve Yu, 2009 )
G13	Alternaria sp.	KX110389	Alternaria alternata (CBS 916.96; GenBank: FJ196306 ; AF347031	Kök	( Pryor ve Michailides, 2002 ; Woudenberg ve diğerleri, 2013 )
G14	Diaporthe eres	KX110390	Diaporthe eres (= Diaporthe cotonesteri; NR_119726 )	Kök	( Udayanga ve diğerleri, 2014 )
G15	Diaporthe eres	KX110391	Diaporthe eres (= Diaporthe cotonesteri; NR_119726 )	Kök	( Udayanga ve diğerleri, 2014 )
G16	Diaporthe sp.	KX110392	Diaporthe eucalyptorum ( NR_120157 )	Kök	( Crous ve diğerleri, 2012 )
G17	Diaporthe sp.	KX110393	Diaporthe eucalyptorum ( NR_120157 )	Kök	( Crous ve diğerleri, 2012 )
G22	Phoma sp.	KX110394	Phoma bellidis ( GU237904 )	Yaprak	( Aveskamp ve diğerleri, 2010 )
G23	Magnaporthales sp.	KX110395	Mycoleptodiscus terrestris ( JN711860 )	Kök	( Koo ve diğerleri, 2012 )
G28	Alternaria sp.	KT825854	Alternaria alternata (CBS 916.96; GenBank: FJ196306 ; AF347031	Tohum	( Pryor ve Michailides, 2002 ; Woudenberg ve diğerleri, 2013 )
G29	Diaporthe sp.	KX110397	Diaporthe terebinthifolii ( NR_111862 )	Tohum	( Gomes vd., 2013 )
G30	Colletotrichum fioriniae	KX110397	Colletotrichum fioriniae ( NR_117474 , EF464594 ) ( JN709486 )	Tohum	( Damm ve diğerleri, 2012 ; Shivas ve Yu, 2009 )
G31	Alternaria alternata	KX110398	Alternaria alternata (CBS 916.96; GenBank: FJ196306 ; AF347031	Tohum	( Pryor ve Michailides, 2002 ; Woudenberg ve diğerleri, 2013 )
G33	Alternaria sp.	KX110399	Alternaria alternata (CBS 916.96; GenBank: FJ196306 ; AF347031	Tohum	( Pryor ve Michailides, 2002 ; Woudenberg ve diğerleri, 2013 )
G34	Colletotrichum fioriniae	KX110400	Colletotrichum fioriniae ( NR_117474 , EF464594 ) ( JN709486 )	Tohum	( Damm ve diğerleri, 2012 ; Shivas ve Yu, 2009 )
G35	Colletotrichum fioriniae	KX110401	Colletotrichum fioriniae ( NR_117474 , EF464594 ) ( JN709486 )	Tohum	( Damm ve diğerleri, 2012 ; Shivas ve Yu, 2009 )
G36	Alternaria sp.	KX110402	Alternaria alternata (CBS 916.96; GenBank: FJ196306 ; AF347031	Tohum	( Pryor ve Michailides, 2002 ; Woudenberg ve diğerleri, 2013 )
G38	Colletotrichum fioriniae	KX110403	Colletotrichum fioriniae ( NR_117474 , EF464594 ) ( JN709486 )	Tohum	( Damm ve diğerleri, 2012 ; Shivas ve Yu, 2009 )
G39	Colletotrichum fioriniae	KX110404	Colletotrichum fioriniae ( NR_117474 , EF464594 ) ( JN709486 )	Tohum	( Damm ve diğerleri, 2012 ; Shivas ve Yu, 2009 )
G41	Pyrenochaeta sp.	KT825855	Pyrenochaeta sp . ( EU885415 )	Yaprak	( Ferrer ve diğerleri, 2009 )
G42	Sordariomycete sp. (Xylariales)	KX110405	Sordariomycete sp . NC1024 ( JQ761762 )	Yaprak	( U'Ren ve diğerleri, 2012 )

Ayrı bir pencerede aç
^bir Fungal endofit OTU'ları, GenBank'taki en homolog sekansları BLAST araştırması ile eşleştirerek ya cinse ya da türe geçici olarak atandı. OTU'ları tercihen tip veya diğer otantik ve yüksek etki faktörlü mikoloji dergilerinde yayınlanan taksonomik uzman tarafından oluşturulan açıklamalı kültürlerden atamak için esas olarak özgün diziler kullanıldı. Birden fazla türün yüksek sekans benzerliğine sahip olduğu tespit edildiğinde veya bir kültürün halka açık bir kültür koleksiyonunda saklandığı yayınlanmış gerçek bir sekansla <% 97 sekans homolojisi bulunduğunda, daha muhafazakar bir yaklaşım benimsemeyi ve sadece cinsi kullanmayı seçiyoruz. OTU ödevi için aile, düzen, sınıf adı (bkz Raja ve diğerleri, 2015 ) 2.2. Mantar metabolitleri

Mantar izolatlarından tümü bilinen bileşikler olan toplam on bir sekonder metabolit tanımlanmıştır (Şekil 1, Tablo S2 ). Alternariol ( 1 ), alternariol monometil eter ( 2 ), 5′epi-equisetin ( 3 ) equisetin ( 4 ), 10-11 dehidrokurvularin ( 5 ), makrosphelide A ( 6 ) ve kordipiridon A ( 7 ) bileşikleri izole edildi kromatografik yöntemler ve spektroskopik veriler (doğru kütleye sahip olan ¹ * H NMR ve ¹³ ° C NMR) eşleşen literatür raporları ( Tablo S2 ). Kalan bileşikler, Sch 52901 ( 8 ), Sch 52900 ( 9 ), vertisilin A ( 10 ), aurofusarin ( 11), LC-MS verilerinin önceden izole edilmiş mantar metabolitlerinin bir kitaplığı ile karşılaştırılmasıyla belirlenmiştir ( El-Elimat ve diğerleri, 2013 ; Figueroa ve diğerleri, 2014 ).

Resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms808945f1.jpg'dir.

Şekil 1
Hydrastis canadensis'in endofitik mantarlarından elde edilen metabolitler . İzole metabolitler, Alternariol ( 1 ), Alternariol monometil eter ( 2 ), 5′-epiquisetin ( 3 ), equisetin ( 4 ), 10-11 didehidrokurvularin ( 5 ), Makrosphelide A ( 6 ), 8-Metil-piridoksatin ( 7 ) UV / Vis ile>% 95 Saf olduğu bulunmuştur. Metabolitler Sch 52901 ( 8 ), Sch 52900 ( 9 ), vertisilin A ( 10 ), Aurofusarin ( 11 ), UPLC-MS / MS verilerinin yayınlanmış bir veritabanıyla karşılaştırılmasıyla geçici olarak tanımlandı ( El-Elimat ve diğerleri, 2013 ). 2.3. Bitki materyalinde mantar metabolitlerinin varlığı

Mantar endofitlerinden tanımlanan on bir metabolitten bir bileşik, alternariol monometil eter ( 2 ), burada kullanılan yöntemlerle bir botanik ekstraktta tespit edildi. Tutma süresi ve doğru kütle ([M + H] ⁺ , 273,0754, C için hesaplanan ₁₅ , H ₁₃ O ₅⁺ , 273.0763) için, ve MS-MS fragmentasyon örneği, farazi alternariol monometil eter iyon izole alternariol monometil eşleştirilmiş ekstraktta eter (şekil 2). Alternariol monometil eter, H. canadensis'ten bir tohum ekstraktının iki bitişik normal faz kromatografi fraksiyonunda tespit edildi . Bu bileşik, aynı ekstraktın diğer fraksiyonlarında ve her analizden önce gerçekleştirilen boş enjeksiyonlarda yoktu. Ek olarak, H. canadensis'in diğer bitki kısımlarından elde edilen özütler, saptanabilir düzeylerde alternariol monometil eter içermiyordu.

Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms808945f2.jpg'dir.

Ayrı bir pencerede aç
şekil 2
H. canadensis tohumlarının bir ekstraktından (1 mg / mL'de analiz edildi) (A) konsantre bir fraksiyonda m / z 273.0755 için seçilen iyon kromatogramı ve Alternaria sp. 1 mg / mL (B) konsantrasyonda. M / z 273.0754'te öncü iyon için MS-MS fragmantasyon modelleri , bitki materyalinde (C) tespit edilen bileşik ve izole edilmiş alternariol monometil eter (D) arasında mükemmel uyum içindedir. NL, her bir spektrum veya kromatogramın normalleştirildiği kütle spektrometrik sinyal seviyesini gösterir.

Botanik tohum ekstraktında alternariol monometil eter mevcudiyeti ile tutarlı olarak, bu bileşik ayrıca iki H. canadensis sapından ve tohum endofitlerinden ( Alternaria sp., G13 ve G31,tablo 1). İlginçtir, Alternaria spp. Hem endofitler hem de bitki patojenleri olarak var oldukları bilinmektedir ( Woudenberg ve diğerleri, 2013 ) ve bu nedenle, bu mantarın , H. canadensis fidelerine bulaşmanın bir yolu olarak H. canadensis tohumlarında yaşaması mümkündür . Aynı zamanda mantar, antimikrobiyal bileşikler üreterek tohumlar üzerinde koruyucu bir etki sağlayabilir.

Alternaria sp. Tarafından kolonize edildiği bilinen H. canadensis tohumlarının ekstraktında alternariol monometil eterin varlığı . bu bileşik için mantar kökenli olduğunu oldukça düşündürmektedir. Alternariol monometil eterin bitkinin kendisi tarafından üretildiğine dair olası açıklama yine de göz ardı edilemez. Alternariol monometil eter, literatürde bir mantar metaboliti olarak geniş çapta rapor edilmiştir. Aly et. al. Alternaria sp. ile kolonize olan Polygonum senegalense bitkisinde de bu metaboliti tespit etmiş ve varlığını botanik değil mantara bağlamıştır (2008). Onocha ve arkadaşları, botanik bir Anthocleista djalonensis'te alternariol monometil eter tespit etti.. Bu yazarlar, botanik numunede görünür küf olmaması temelinde alternariol monometil eterin botanik kökenli olduğunu varsaydılar ( Onocha ve diğerleri, 1995 ). Bununla birlikte, başka bir açıklama, herhangi bir görünür enfeksiyon semptomu olmaksızın mevcut olabilen fungal endofitler tarafından üretilmesiydi. 2.4. Mantar metabolitlerinin ve botanik ekstraktların antimikrobiyal aktivitesi

Alternariol monometil eterin, H. canadensis'in biyolojik aktivitesiyle potansiyel ilgisini araştırmak için , Staphylococcus aureus'a karşı antimikrobiyal aktivite , tüm botanik ekstraktlar ve izole edilmiş alternariol monometil eter için ölçüldü. S. aureus , yaygın bir Gram-pozitif bakteriyel patojen olduğu için bu çalışma için bir test vakası olarak seçilmiştir ( Kaatz ve Seo, 1995 ). Gösterildiği gibiTablo 2, tohum özütü 200 μg / mL'lik minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) ile sadece zayıf antimikrobiyal aktivite ( Şekil S1 ) gösterdi . Ekstresi H. canadensis anten kısmı ekstresi 200 ml'lik bir MIC ug / ml ile (biraz daha aktif olduğunu Şekil S2 ). Bu ekstraktın antimikrobiyal aktivitesi muhtemelen H. canadensis yapraklarında bol olduğu bilinen bitki kaynaklı alkaloidlerden kaynaklanmaktadır (Ettefagh ve ark., Saflaştırılmış alternariol monometil eter, bir antimikrobiyal olarak botanik ekstraktlara göre daha aktiftir. 75 μg / mL MIC ( Şekil S3 ). Tablo 2

Ekstraktların, saflaştırılmış metabolitin ve kontrollerin antimikrobiyal aktiviteleri

hava özü (yapraklar ve gövdeler)	200 μg / mL ^b
tohum özü	> 200 μg / mL
berberin (+ kontrol) ^c	75 μg / mL
alternariol monometil eter	75 μg / mL

^bir MIC, OD _600'ün ≥% 95 oranında azalmasına neden olan konsantrasyon olarak tanımlanır .
^b Konsantrasyon, test kuyucuk hacminin mL'si başına μg / mL kurutulmuş bitki özütü olarak ifade edilir.
^c Berberine, pozitif bir kontrol görevi gördü ve önceki raporlarla tutarlı bir aktivite sergiledi ( Amin ve diğerleri, 1969 ; Čerňáková ve Košt'álová, 2002 ).
Botanik ekstraktlarda alternariol monometil eterin kantitatif analizi için sonuçlar, Tablo 2. Bu bileşik, yalnızca H. canadensis tohum ekstresinin saflaştırılmış bir fraksiyonunda bulundu ve bu ekstraktaki konsantrasyona bağlı olarak, orijinal ekstraktaki alternariol monometil eterin geri hesaplanan konsantrasyonu 991 ppm olarak bulundu (mg olarak ifade edilir). bir kg kuru tohum materyali başına alternariol monometil eter). Biyoanalizde test edilen tohum ekstresinin en yüksek konsantrasyonunda (200 μg / mL, mL test hacmi başına μg ekstraktı olarak ifade edilir), bu, yalnızca 0,198 μg / mL alternariol monometil eterlik bir test konsantrasyonuna eşittir; Bu bileşik için 75 μg / mL. Bu nedenle, tohum özütünün belirgin antimikrobiyal aktivite göstermemesi çok az şaşırtıcıdır (Tablo 2). Bununla birlikte, bu çalışmanın bir parçası olarak izole edilen mantar endofitlerinin çoğunun antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu ( Tablo S1 ) ve bu mantarlardan birkaç antimikrobiyal bileşiğin tanımlandığını belirtmek gerekir ( Tablo S2 ). Birden fazla düşük seviyeli antimikrobiyal mantar metabolitinin birleşik etkisinin, bir botanik özütün genel aktivitesine katkıda bulunması tamamen mümkündür. Ayrıca, burada araştırılan mantarların, bitkilerde endofit olarak büyürken izole kültürde olduğundan farklı metabolitler üretmesi muhtemeldir. Bu olasılıkları keşfetmek için daha ileri çalışmalar gerekli olacaktır.

H. canadensis tohumlarında alternariol monometil eterin saptanması , mantarın varlığının bitkiye bir miktar fayda sağlayabileceğini göstermektedir. H. canadensis tohumlarında ölçülen 991 ppm alternariol monometil eter miktarı, doğal otların mantar endofitleri tarafından üretilen ergot ve lolin alkaloidleri gibi ekolojik olarak önemli olduğu bilinen metabolitler için bildirilen konsantrasyon aralığındadır ( Jarmusch ve diğerleri, 2016 ; Shymanovich ve diğerleri, 2014 ). Ergot ve lolin alkaloit alkaloidleri, otları böcek otçullarından korumaya yardımcı olur ( Bush ve diğerleri, 1997 ). Benzer bir şekilde, H. canadensis'te antimikrobiyal fungal metabolitlerin varlığıtohumlar bitkinin bakteriyel patojenlerden korunmasına yardımcı olabilir. Bu hipotezin araştırılması, daha ileri çalışmalar için bir başka ilginç yol olacaktır.

Verilerimizin, Alternaria'nın H. canadensis'i kolonileştiren potansiyel bir ekolojik rolünü öne sürdüğü göz önüne alındığında , bu cinsten mantarların birçok Homo canadensis koleksiyonundan izole edilip edilemeyeceğini değerlendirmeye çalıştık . Nitekim, Alternaria cinsinin mantarları, beş yıllık bir süre boyunca aynı arsadan altınmühür koleksiyonlarında tanımlanmıştır. Alternaria sp. 11/7/2011 ve 6/28/2012 tarihlerinde hasat edilen H. canadensis tohumlarından izole edilmiştir (sırasıyla G31 ve G75 erişim numaraları verilmiştir). 6/11/2015 tarihinde yürütülen üçüncü bir koleksiyon için Alternaria sp. H. canadensis'ten izole edildiyaprak dokusu segmentleri (erişim numarası G657). Üç farklı koleksiyondan izole edilen endofitler , zincirlerde koyu renkli, kuru, phaeodictyospores (conidia) üretimi ve sivrilen apikal hücrelerin gagasını içeren Alternaria spp'nin morfolojik özelliklerini gösterdi ( Woudenberg ve diğerleri, 2013 ). Her üç izolat da ITS bölgesinde Alternaria alternata bölümü Alternata (CBS 916.96) ile>% 98 sekans benzerliği gösterdi ( Pryor ve Michailides, 2002 ; Woudenberg ve diğerleri, 2013 ). Bununla birlikte, Woudenberg ve ark. Alternaria bölüm Alternata'nın ITS bölgesinde düşük varyasyon gözlemledi, bu çalışmada Alternaria izolatları için tür sıfatını kullanmaktan kaçınıyoruz .

Özet olarak, burada, enfeksiyonu tedavi etmek için geleneksel tıpta kullanılan bir botanik tıbbın tohumlarında antimikrobiyal bileşik alternariol monometil eterin tespitini bildiriyoruz. Bu metabolitin konsantrasyonu karşı antimikrobiyal aktivitesi için esas olarak sorumlu olduğu çok düşük olduğu , Staphylococcus aureus ve H. canadensis bitkisel özler. Bununla birlikte, Alternaria spp. ekolojik öneme sahip olabilir. İzolasyonu Alternaria spp. H. canadensis'in birden fazla katılımından bu hipotezi desteklemektedir. Alternaria türlerinin varlığını araştırmak için gelecekteki çalışmalar . içinde H. canadensis farklı coğrafi yerlerden gelenler ilgi çekici olabilir.

Şuraya gidin: 3. Yöntemler

3.1. Bitki materyalinin satın alınması

Bitki materyali, 07/11/2011 tarihinde Hendersonville, NC'de (N35 ° 24.2770, W 082 ° 20.9930) ekili bir araziden hasat edildi ve North Carolina Üniversitesi Herbarium'a (erişim numarası NCU 583414) bir makbuz yatırıldı. Fungal endofitlerin daha fazla karakterizasyonu için aynı grafikten 6/28/2012 ve 6/11/2015 tarihlerinde ek koleksiyonlar yapılmıştır ( Tablo S3 ). 3.2. Mantar yetiştirme ve suş tanımlama

Taze bitki örnekleri, daha önce açıklandığı gibi yüzey sterilize edildi ( Raja ve diğerleri, 2015 ). 100 gövde segmenti dahil olmak üzere toplam 320 segment kaplandı; 100 yaprak segmenti; 70 kök segmenti; ve 50 tohum. Goldenseal bitki parçalarından çıkan tüm fungal endofit kültürleri Potato Dextrose Agar'da tutulur; Greensboro'daki North Carolina Üniversitesi'nde 9 ° C'de Difco (PDA) agar eğimleri, Kimya ve Biyokimya Bölümü, Fungal Kültür Koleksiyonu. Toplam 23 mantar, H. canadensis'in dokularından kültürlendi (11 Temmuz 2011'de toplandı) ve daha önce açıklandığı gibi katı hal pirinç fermantasyon ortamında büyütüldü ( Raja ve diğerleri, 2015 ). Kimyasal ekstraksiyondan önce tüm pirinç kültürlerinin 14-21 gün büyümesine izin verildi.

Goldenseal'den izole edilen mantar endofitlerinin moleküler tanımlanması için, ribozomal RNA geninin (ITS) dahili kopyalanmış ara bölgesi, daha önce özetlenen protokoller ( Raja ve diğerleri 2015 ; Kellogg ve diğerleri, 2016 ) ve operasyonel taksonomik birim (OTU) kullanılarak sıralandı . Tür tanımlamaları için vekiller olarak tanımlamalar,% 98 özdeşlik kullanılarak NCBI GenBank'ta yalnızca doğrulanmış, yayınlanmış diziler kullanılarak BLAST arama aracı ile yapılmıştır ( Raja ve diğerleri, 2015 ; Schoch ve diğerleri, 2014 ). Tüm suşların ITS sekansları GenBank'ta depolanmıştır ve aşağıda listelenmiştir.tablo 1ve Tablo S3 . 3.3. Ekstraksiyon ve hazırlık

Ekstraksiyon için, bitki materyalinin gevrekleşene kadar birkaç hafta havada kurumasına izin verildi. Yapraklar ve gövdeler, tohumlardan ayrıldı ve her bitki parçası, bir Thomas Wiley Mini-Mill kullanılarak ayrı ayrı ince bir toz halinde öğütüldü. Mantar pirinç kültürleri ve botanik özütleri (59,2 g hava kısımları, 2,54 g tohumlar) 1: 1 metanol: kloroformda ekstrakte edildi ve daha önce açıklanan yöntemler kullanılarak sıvı-sıvı bölümlemeye tabi tutuldu ( El-Elimat ve diğerleri, 2015 ; Kaur ve diğerleri. , 2016 ; Kellogg ve diğerleri, 2016 ; Raja ve diğerleri, 2015 ), bir kloroform, sulu ve heksan bölümleri ile sonuçlanır. Kloroform bölümleri birincil ilgi konusuydu ve daha ileri araştırmalar için kullanıldı. 3.4. Mantar metabolitlerinin tanımlanması

Mantar özütleri, daha önce yayınlanmış yöntemlerle ( El-Elimat ve diğerleri, 2013 ) yüksek çözünürlüklü güçlü tandem kütle spektrometrisine (LTQ Orbitrap XL, Thermo) (LC-MS-MS) bağlanmış ultra performanslı sıvı kromatografisi (Acquity UPLC, Waters) kullanılarak analiz edildi . ). Tespit edilen her iyon için tutma süresi, doğru kütle ve fragmantasyon spektrumu, bilinen bileşikleri tanımlamak için 262 fungal metabolit için bir LC-MS verileri kütüphanesi ile karşılaştırıldı ( El-Elimat ve diğerleri, 2013). Mevcut mantar kütüphanesinde temsil edilmeyen bileşikler, bir Combiflash Rf sistemi (Teledyne-ISCO, Lincoln, NE, ABD) üzerinde birkaç tur flaş kromatografisi ve Varian HPLC sistemi (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD). Saf bileşiklerin yapıları, NMR verilerine (Joel ECS 400MHz, Joel ECA 500MHz, Varian 700 MHz) ve daha önce açıklandığı gibi doğru kütle ölçümlerine ( Raja ve diğerleri, 2015 ) dayalı olarak çözüldü . İzole edilmiş her bir bileşik için, NMR ve doğru kütle verileri literatür raporlarıyla eşleşmiştir ( Tablo S2 ).

Mantar özlerinin LC-MS-MS verilerini toplamak için kullanılan aynı yöntem, H. canadensis'ten elde edilen botanik özütlere de uygulandı . Botanik özütlerde mantar metabolitlerinin saptanabilir olup olmadığını belirlemek için, elde edilen LC-MS verileri , [M + H] ^{+ '} nın m / z değeri için filtrelenmiştir.her bir mantar metabolitinin iyonu; 5 ppm izolasyon penceresi kullanıldı. Tanımlama için, hem botanik hem de fungal özütlerde bulunan herhangi bir iyonun tutulma süresi, doğru kütlesi ve parçalanma modeli arasında karşılaştırmalar yapıldı. Ekstrelerde tespit edilen herhangi bir mantar metabolitinin diğer mantar örneklerinden kazara bulaşmanın bir sonucu olmadığından emin olmak için özen gösterildi. Her numunenin analizi arasında çok sayıda boş enjeksiyon yapıldı ve bu boş enjeksiyonlar, taşınmayı ortadan kaldırmak için incelendi. 3.5. Alternariol monometil eterin kantitatif analizi

Alternariol monometil bir stok çözelti eter izole Alternaria sp. ( Tablo S2 ) 50:50 metanol: dioksan içinde 1 ug / mL konsantrasyonda hazırlandı. Bu bileşiğin kimliği NMR spektroskopisi ile doğrulandı ve saflığının UPLC'ye göre>% 95 olduğu belirlendi ( Kellogg ve diğerleri, 2016 ). Kalibrasyon çözeltileri, 0,2 mg / mL ila 2 ng / mL'lik bir konsantrasyon aralığında seri seyreltme yoluyla stok çözeltisinden hazırlandı. Bu çözeltiler, daha önce tarif edildiği gibi özütlere uygulanan aynı LC-MS-MS yöntemi kullanılarak analiz edildi ( El-Elimat ve diğerleri, 2013 ). Bir kalibrasyon eğrisi seçilmiş [M + H] için pik alanı olarak hesaplanmıştır ⁺ iyonu için alternariol monometil eter ( m / z 273.0755) karşı konsantrasyon ve alternariol monometil eter konsantrasyonu, bu kalibrasyon eğrisi için en uygun çizgiye dayalı olarak fungal ve botanik ekstraktlarda belirlendi. 3.6. Antimikrobiyal aktivitenin değerlendirilmesi

Et suyu mikrodilüsyon deneyleri için Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü ( Ferraro, 2000 ) yöntemleri, tüm fungal ve botanik ekstraktların yanı sıra izole edilmiş alternariol monometil eterin antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için kullanıldı. Aktivite, Staphylococcus aureus suşu SA1199'a karşı değerlendirildi ( Kaatz ve Seo, 1995 ). Bilinen antimikrobiyal bileşik berberin, bu deneyler için pozitif bir kontrol görevi gördü ( Junio ve diğerleri, 2011 ). Tüm numuneler, her bir oyukta% 2 nihai DMSO içeriği ile üç kez test edildi. Büyüme, 600 nm'de (OD ₆₀₀ ) absorbans ölçümlerine dayalı olarak ölçüldü . Minimum inhibitör konsantrasyon (MIC), ortalama OD ₆₀₀ Test kuyularının% 95'i azalmıştır. İncelenecek Önemli Noktalar

Hydrastis canadensis'in yüzey sterilize edilmiş örneklerinden toplam 23 mantar izolatı elde edilmiştir.
Mantar Alternaria sp. 5 yıllık 3 H. canadensis girişinden izole edilmiştir .
Alternariol monometil eter bir ekstraktta tanımlandı H. canadensis tohumları
Bu metabolit, antimikrobiyal aktiviteye katkıda bulunamayacak kadar düşük konsantrasyonlarda mevcuttu.
Bununla birlikte, alternariol monometil eter ekolojik olarak önemli olabilir.

Şuraya gidin: Ek materyal

1

Görmek için buraya tıklayın. ^{(423K, docx)} 2

Görmek için buraya tıklayın. ^{(67M, docx)}
Şuraya gidin: Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitülerinin bir bileşeni olan Ulusal Tamamlayıcı ve Bütünleştirici Sağlık Merkezi (Grant R01 AT006860) ve Kuzey Carolina Biyoteknoloji Merkezi (2011-BRG-1206) tarafından kısmen desteklenmiştir. William A. Birch, bu çalışma için bitki örnekleri sağladı. Kütle spektrometresi verileri, Triad Kütle Spektrometresi Tesisinde Dr. Daniel A. Todd'un yardımıyla toplandı. LC-MS dereplication ile ilgili teknik yardım için Tamam El-Elimat'a teşekkür ederiz.

Şuraya gidin: Ek A. Tamamlayıcı veriler

Botanik numuneler ve mantar ekstraktları hakkındaki antimikrobiyal tahlil bilgileri tamamlayıcı veriler olarak sağlanır .

Şuraya gidin: Dipnotlar

Yayıncının Sorumluluk Reddi: Bu, yayınlanmak üzere kabul edilmiş, düzenlenmemiş bir makalenin PDF dosyasıdır. Müşterilerimize bir hizmet olarak el yazmasının bu erken versiyonunu sağlıyoruz. Makale, nihai atıfta bulunulabilir formunda yayınlanmadan önce ortaya çıkan ispatın kopyalanmasına, dizgisine ve incelemesine tabi tutulacaktır. Lütfen üretim süreci sırasında içeriği etkileyebilecek hataların keşfedilebileceğini ve dergi için geçerli olan tüm yasal sorumluluk reddi beyanlarının bulunduğunu unutmayın.

Şuraya gidin: Referanslar

Aly AH Edrada-Ebel R Indriani İD, Wray V, Muller, Totzke K, Zirrgiebel U Schächtele C Kubbutat MH mantar endofit Lin W., sitotoksik metabolitleri Alternaria sp ve konak bitkide müteakip tespit Polygonum senegalense . J Nat Prod. 2008; 71 : 972–980. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Amin A, Subbaiah T, Abbasi K. Berberine sülfat: antimikrobiyal aktivite, biyoassay ve etki modu. Can J Microbiol. 1969; 15 : 1067–1076. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Aveskamp MM, De Gruyter J, Woudenberg J, Verkley G, Crous PW. Didymellaceae'nin Önemli Noktaları: Phoma ve ilgili Pleosporalean cinslerini karakterize etmek için çok fazlı bir yaklaşım . Stud Mycol. 2010; 65 : 1–60. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Bush LP, Wilkinson HH, Schardl CL. Çim-mantar endofit ortakyaşamlarının biyokoruyucu alkaloidleri. Plant Physiol. 1997; 114 : 1–7. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Cech NB, Junio HA, Ackermann LW, Kavanaugh JS, Horswill AR. Metisiline dirençli Staphyolococcus aureus'a karşı goldenseal'in ( Hydrastis canadensis ) çekirdek quenching ve antimikrobiyal aktivitesi . Planta Med. 2012; 78 : 1556–1561. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Čerňáková M, bir berberin-bir yapının Košt'álová D. Antimikrobiyal etki Mahonia aquifolium . Folia Microbiol (Praha) 2002; 47 : 375–378. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Crous P, Summerell B, Shivas R, Burgess T, Decock C, Dreyer L, Granke L, Guest D, Hardy GS, Hausbeck M. Fungal gezegen açıklama sayfaları: 107–127. Persoonia-Mol Phylogeny Evol Fungi. 2012; 28 : 138–182. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Damm U, Cannon P, Woudenberg J, Crous P. Colletotrichum acutatum tür kompleksi. Stud Mycol. 2012; 73 : 37–113. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
El-Elimat T, Figueroa M, Ehrmann BM, Cech NB, Pearce CJ, Oberlies NH. Biyoaktif doğal ürünler için bir dereplikasyon protokolü olarak ikincil mantar metabolitlerinin yüksek çözünürlüklü MS, MS / MS ve UV veritabanı. J Nat Prod. 2013; 76 : 1709–1716. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
El-Elimat T, Figueroa M, Raja HA, Graf TN, Swanson SM, Falkinham JO, Wani MC, Pearce CJ, Oberlies NH. Setophoma terrestris'ten biyosentetik olarak farklı sitotoksik poliketidler . Eur J Org Chem. 2015; 2015 : 109–121. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
El-Elimat T, Raja HA, Graf TN, Faeth SH, Cech NB, Oberlies NH. Süt devedikeni ( Silybum marianum ) mantar endofiti olan Aspergillus iizukae'den Flavonolignans J Nat Prod. 2014; 77 : 193–199. doi: 10.1021 / np400955q. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Ettefagh KA, Burns JT, Junio HA, Kaatz GW, Cech NB. Goldenseal ( Hydrastis canadensis L.) özleri, efluks pompası inhibisyonu yoluyla berberinin antibakteriyel aktivitesini sinerjik olarak arttırır. Planta Med. 2011; 77 : 835–840. doi: 10.1055 / s-0030-1250606. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
Ferraro M. Ulusal klinik laboratuvar standartları komitesi, aerobik olarak çoğalan bakteriler için seyreltme antimikrobiyal duyarlılık testleri için yöntemler: Onaylı standart 2012 M07-A9. Natl. Comm. Clin. Lab. Ayakta durmak; Wayne PA: 2000. s. 36. [ Google Scholar ]
Ferrer C, Pérez-Santonja JJ, Rodríguez AE, Colom MF, Gené J, Alio JL, Verkley GJ, Guarro J. Keratite neden olan yeni Pyrenochaeta türleri. J Clin Microbiol. 2009; 47 : 1596–1598. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Figueroa M, Jarmusch AK, Raja HA, El-Elimat T, Kavanaugh JS, Horswill AR, Aşçılar RG, Cech NB, Oberlies NH. Penicillium restrictum futtatlarından çekirdek algılama inhibitörleri olarak polihidroksianthraquinones ve desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi ile analizleri. J Nat Prod. 2014; 77 : 1351–1358. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Gomes R, Glienke C, Videira S, Lombard L, Groenewald J, Crous P. Diaporthe : endofitik, saprobik ve bitki patojenik mantarların bir cinsi. Persoonia-Mol Phylogeny Evol Fungi. 2013; 31 : 1–41. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Hwang BY, Roberts SK, Chadwick LR, Wu CD, Kinghorn AD. Goldenseal'den (Rhizomes of Hydrastis canadensis ) seçilen oral patojenlere karşı antimikrobiyal bileşenler . Planta Med. 2003; 69 : 623–627. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Jarmusch AK, Musso AM, Shymanovich T, Jarmusch SA, Weavil MJ, Lovin ME, Ehrmann BM, Saari S, Nichols DE, Faeth SH, Cech NB. Elektrosprey iyonizasyonunun ve atmosferik basınçta fotoiyonizasyon sıvı kromatografisi kütle spektrometresi yöntemlerinin karşılaştırılması, endofitle enfekte uyuyan otlardan ( Achnatherum robustum ) ergot alkaloidlerinin analizi için J Pharm Biomed Anal. 2016; 117 : 11–17. doi: 10.1016 / j.jpba.2015.08.031. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Junio HA, Sy-Cordero AA, Ettefagh KA, Burns JT, Micko KT, Graf TN, Richter SJ, Cannon RE, Oberlies NH, Cech NB. Botanik ilaçların sinerjiye yönelik fraksiyonasyonu: goldenseal ( Hydrastis canadensis ) J Nat Prod. 2011; 74 : 1621–1629. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Kaatz GW, Seo SM. Staphylococcus aureus'ta indüklenebilir NorA aracılı çoklu ilaç direnci . Antimicrob Agents Chemother. 1995; 39 : 2650–2655. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Kaur A, Raja HA, Derin G, Agarwal R, Oberlies NH. Pannorin B, Penicillium sp. Magn Reson Chem. 2016; 54 : 164–167. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Kellogg JJ, Todd DA, Egan JM, Raja HA, Oberlies NH, Kvalheim OM, Cech NB. Doğal ürün araştırmaları için biyokimometri: Veri analizi yaklaşımlarının karşılaştırılması ve biyoaktif bileşiklerin tanımlanmasına yönelik uygulama. J Nat Prod. 2016; 79 : 376–386. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Koo S, Sutton DA, Yeh WW, Thompson EH, Sigler L, Shearer JF, Hofstra DE, Wickes BL, Marty FM. İnvazif Mycoleptodiscus fungal selülit ve miyozit. Med Mycol. 2012; 50 : 740–745. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Kusari S, Pandey SP, Spiteller M. Konakçı bitkiyi ve benzer biyoaktif ikincil metabolitlerin endofitik mantar üretimini bağlayan kullanılmayan karşılıklı paradigmalar. Bitki kimyası. 2013; 91 : 81–87. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Nisa H, Kamili AN, Nawchoo IA, Shafi S, Shameem N, Bandh SA. Fitokimyasalların ve diğer biyoaktif doğal ürünlerin üretken kaynağı olarak mantar endofitleri: Bir inceleme. Microb Pathog. 2015; 82 : 50–59. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Onocha PA, Okorie DA, Connolly JD, Roycroft DS. Anthocleista djalonensis kaynaklı monoterpen diol, iridoid glukozit ve dibenzo-a- pirron . Bitki kimyası. 1995; 40 : 1183–1189. [ Google Scholar ]
Pryor BM, Michailides TJ. Alternaria geç fıstık yanıklığı ile ilişkili Alternaria izolatlarının morfolojik, patojenik ve moleküler karakterizasyonu . Fitopatoloji. 2002; 92 : 406–416. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Pugh ND, Jackson CR, Pasco DS. Yeni bir PCR tabanlı kantifikasyon yöntemi kullanılarak belirlenen Ekinezya purpurea içindeki toplam bakteri yükü , LPS seviyeleri ve in vitro makrofaj aktivitesi ile ilişkilidir. Planta Med. 2013; 79 : 9. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Raja HA, Kaur A, El-Elimat T, Figueroa M, Kumar R, Deep G, Agarwal R, Faeth SH, Cech NB, Oberlies NH. Silybum marianum (L) Gaertn (deve dikeni) Mycology'den izole edilen fungal endofitlerin filogenetik ve kimyasal çeşitliliği . 2015; 6 : 8–27. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Scazzocchio F, Cometa M, Tomassini L, Palmery M. Hydrastis canadensis özütünün antibakteriyel aktivitesi ve başlıca izole edilmiş alkaloidleri. Planta Med. 2001; 67 : 561–564. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Schoch CL, Robbertse B, Robert V, Vu D, Cardinali G, Irinyi L, Meyer W, Nilsson RH, Hughes K, Miller AN. Saman yığınlarında iğneleri bulmak: bilimsel isimleri, referans örnekleri ve mantarlar için moleküler verileri birbirine bağlamak. Veri tabanı. 2014; 2014 : bau061. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Shivas R, Yu Y bir taksonomik yeniden değerlendirme Colletotrichum acutatum sokulması, fioriniae C Combet istatistik kas ve Cı simmondsii sp Kasım Fungal Dalgıçlar. 2009; 39 : 111. [ Google Scholar ]
Shymanovich T, Saari S, Lovin ME, Jarmusch AK, Jarmusch SA, Musso AM, Charlton ND, Young CA, Cech NB, Faeth SH. Uykulu otların ( Achnatherum robustum ) epikloid endofitleri arasında alkaloid varyasyonu ve böcek otçullarına karşı direnç için sonuçları. J Chem Ecol. 2014; 41 : 93–104. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxomyces andreanae tarafından taksol ve taksan üretimi , pasifik porsuk ağacının endofitik bir mantarı. Bilim. 1993; 260 : 214–216. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Strobel GA. Biyoaktif ürünlerin kaynağı olarak endofitler. Microbes Infect. 2003; 5 : 535–544. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Suryanarayanan T, Thirunavukkarasu N, Govindarajulu M, Sasse F, Jansen R, Murali T. Fungal endofitler ve biyoprospecting. Fungal Biol Rev. 2009; 23 : 9–19. [ Google Scholar ]
Todd DA, Gulledge TV, Britton ER, Oberhofer M, Leyte-Lugo M, Moody AN, Shymanovich T, Grubbs LF, Juzumaite M, Graf TN. Ethanolic Echinacea purpurea özütleri, bazıları endofitik bakterilerden kaynaklananlar da dahil olmak üzere, sitokin baskılayıcı ve sitokin indükleyen bileşiklerin bir karışımını içerir. PloS Bir. 2015; 10 : e0124276. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Udayanga D, Castlebury LA, Rossman AY, Chukeatirote E, Hyde KD. Diaporthe cinsine ilişkin içgörüler : D. eres tür kompleksinde filogenetik türlerin sınırlandırılması . Fungal Dalgıçlar. 2014; 67 : 203–229. [ Google Scholar ]
U'Ren JM, Lutzoni F, Miadlikowska J, Laetsch AD, Arnold AE. Kıtasal ölçekte endofitik ve endolichenik mantarların konakçı ve coğrafi yapısı. J Bot benim. 2012; 99 : 898–914. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Woudenberg J, Groenewald J, Binder M, Crous P. Alternaria yeniden tanımlandı. Stud Mycol. 2013; 75 : 171–212. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]

**mert** · 05 April 2021, 17:17

Botanik Tıp Goldenseal'den (Hydrastis) Antimikrobiyal Fungal Endofitler canadensis)
Yazan: Joseph M.Egan, Amninder Kaur, Huzefa A. Raja, Joshua J.Kellogg, Nicholas H.Oberlies, ve Nadja B. Cech
Botanik Tıp Goldenseal'den (Hydrastis) Antimikrobiyal Fungal Endofitler canadensis). " Joseph M.Egan, Amninder Kaur, Huzefa A. Raja, Joshua J. Kellogg, Nicholas H.Oberlies ve Nadja B. Cech. Fitokimya Mektupları, 2016, 17, 219-225. doi: 10.1016 / j.phytol.2016.07.031

Öz:
Mantar endofitlerinin bitki kimyasını ve biyolojisini değiştirme veya katkıda bulunma potansiyeli son zamanlarda büyük ilgi gören konu. Tıbbi olarak kullanılan bitkiler için endofitlerin biyolojik aktivitede önemli bir rol oynayabileceğini öne sürdü. Bu çalışma ile biz tıbbi bitki goldenseal'den antimikrobiyal fungal endofitleri tanımlamaya çalıştı (Hydrastis canadensis L., Ranunculaceae), geleneksel tıpta enfeksiyonu tedavi etmek için kullanılan bir bitki. Yüzey sterilize edilmiş H. canadensis kökleri, yaprakları ve tohumları. Bunlardan on bir ikincil metabolit izole edildi beşi antimikrobiyal aktivite bildirmiş olan fungal endofitler. Hydrastis canadensis bitki malzeme daha sonra sıvı kromatografi kullanılarak mantar metabolitlerinin varlığı için analiz edildi yüksek çözünürlüklü güç kütle spektrometresi ile birleşti. Antimikrobiyal bileşik alternariol monometil eter, hem fungal endofit Alternaria spp. H. canadensis tohumlarından izole edilmiştir ve H. canadensis tohumundan elde edilen ekstrenin bir bileşeni olarak malzeme. Özellikle, Alternaria cinsinin mantarları üç ayrı girişten izole edilmiştir. 5 yıllık bir zaman diliminde toplanan H. canadensis bitki materyalinden. Konsantrasyonu alternariol monometil eter (kuru tohum materyalinde 991 mg / kg), buna benzer bir aralıktaydı. daha önce ekolojik olarak önemli fungal endofitlerin metabolitleri için bildirilmiştir. Tohum Ancak özlerin kendileri antimikrobiyal aktiviteye sahip değildi.

Anahtar Kelimeler: Hydrastis canadensis | Endofitler | İkincil metabolitler | Mantarlar | Alternariol monometil eter

1. Giriş

Bu çalışma, bitki dokularında asemptomatik olarak yaşayan endofitik mantarlara ve biyosentezledikleri ikincil metabolitler. Son zamanlarda büyük ilgi vardı doğal ürün ilaç keşfi için bir kaynak olarak endofitik mantarlarda (Strobel, 2003, Suryanarayanan ve diğerleri, 2009). Ayrıca endofitik mantarların pozitif olabileceği de gösterilmiştir. kuraklık toleransının iyileştirilmesi ve koruyucu üretim dahil olmak üzere ev sahibi bitkiler üzerindeki etkileri bileşikler (Bush ve diğerleri, 1997). Endofitik mantarların belirli biyoaktif bileşenleri,
insan patojenlerine karşı bir dizi farklı aktiviteye sahip olduğu ve yeni sitotoksisite mekanizmaları (Strobel, 2003). Ayrıca, bazı fungal endofitler, Botaniklerde yaşadıkları bilinenlerle aynı biyoaktif bileşenler. bir endofitin etkisinin temel korumanın ötesine geçebileceğini düşündürmektedir (El-Elimat et al. ark., 2014, Kusari vd., 2013, Nisa vd., 2015, Stierle vd., 1993).
Bitki dokularında endofitik mantarlar bulunduğundan, bileşiklerin endofitlerden kaynaklanan botanik ekstraktların biyolojik aktivitesinde rol oynayabilir. Bunun endofitik bakteriler için doğru olduğu gösterilen birkaç vaka olmuştur. Echinacea purpurea özütlerinin in vitro aktivitesini değiştirir (Pugh ve diğerleri, 2013, Todd ve diğerleri, 2015). O Fungal sekonder metabolitlerin güçlü biyolojik etkiler gösterebileceği iyi bilinmektedir. mantar ortakyaşlarının biyolojik etkiye katkıda bulunabileceği veya bunları değiştirebileceği hipotezini destekler.
botanik ekstraktların faaliyeti. Bu çalışmanın amacı mantarların potansiyel rolünü keşfetmekti. botanik tıp goldenseal, Hydrastis antimikrobiyal aktivitesindeki endofitler canadensis L. (Ranunculaceae). Daha önce, H. canadensis'in bir dizi antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. bakteriyel patojenler ve bu aktivite öncelikle alkaloid berberine atfedilmiştir. (Hwang ve diğerleri, 2003, Scazzocchio ve diğerleri, 2001). Bununla birlikte, birkaç çalışma şunu göstermiştir: goldenseal ham özütlerinin antimikrobiyal aktivitesi daha belirgindir (yaklaşık olarak 2- kat), izole edilmiş berberinden daha fazla, diğer bileşiklerin de bir rol oynaması gerektiğini düşündürmektedir (Cech vd., 2012). Bu çalışma ile, mantar endofitlerini H. canadensis bitki materyali ve mantar metabolitlerinin kimyaya katkıda bulunup bulunmadığını belirler ve goldenseal botanik ekstrelerinin antimikrobiyal aktivitesi.

Tablo 1.
Endofitik mantarların kimlikleri. Kurum içi kimlik için G numaraları atandı ve OTU tanımlaması, ITS rDNA sıralaması yoluyla gerçekleştirildi.a Fungal endofit OTU'lar, en homolog olanı eşleştirerek cins veya türe geçici olarak atandı. BLAST aramasına göre GenBank dizileri OTU'ları tercihli olarak atamak için esas olarak otantik diziler kullanıldı türden veya diğer özgün ve açıklamalı kültürlerden, taksonomik uzman tarafından oluşturulan yüksek etkiyle yayınlanmıştır faktör mikoloji dergileri. Birden fazla türün yüksek dizi benzerliğine sahip olduğu tespit edildiğinde veya <% 97 olduğunda dizi homolojisi, bir kültürün kamuya açık bir yerde saklandığı yayınlanmış otantik bir dizi ile bulundu.kültür koleksiyonu, daha muhafazakar bir yaklaşım benimsemeyi ve sadece cins, aile, düzen, sınıf adını kullanmayı seçiyoruz OTU ataması için (bkz Raja ve diğerleri, 2015)

2. Sonuçlar
2.1. Endofit kimlikleri ve sözleri
Hydrastis canadensis'ten toplam 23 izolat olan endofitik mantarlar kültürlenmiş ve tanımlanmıştır. Mantarlar, tam ITSrDNA fragmanlarına göre tanımlandı; yaklaşık 600- 650 bp. Beş izolat Alternaria spp., Altısı Colletotrichum fioriniae, üçü ise Diaporthe eres, dördü Diaporthe spp., İkisi Sordariomycete spp., Biri Magnaporthales olarak spp., biri Phoma sp. Pyrenocheta cava (Tablo 1). Bir dizi mantar özü Staphylococcus aureus'a karşı belirgin antimikrobiyal aktiviteye sahipti, en çok Alternaria sp için gözlenen belirgin aktivite. (Tablo S1

Şekil 1. Hydrastis canadensis'in endofitik mantarlarından elde edilen metabolitler. İzole metabolitler, Alternariol (1), Alternariol monometil eter (2), 5′-epiquisetin (3), equisetin (4), 10-11 didehidrokurvularin (5), Macrosphelide A (6), 8-Metil-piridoksatin (7),>% 95 olarak bulundu UV / Vis ile saf. Metabolitler Sch 52901 (8), Sch 52900 (9), vertisilin A (10), Aurofusarin (11)
UPLC-MS / MS verilerinin yayınlanmış bir veritabanıyla karşılaştırılmasıyla geçici olarak tanımlanmıştır (El-Elimat ve diğerleri, 2013). 2.2. Mantar metabolitleriHepsi bilinen bileşikler olan toplam on bir ikincil metabolit tanımlanmıştır. mantar izolatlarından (Şekil 1, Tablo S2). Alternariol (1), alternariol bileşikleri monometil eter (2), 5′epi-equisetin (3) equisetin (4), 10-11 dehidrokurvularin (5), makrosphelide A (6) ve kordipiridon A (7), kromatografik yöntemlerle izole edildi ve spektroskopik verileri (doğru kütle, 1 H NMR ve 13C NMR) uyumlu literatür raporları (Tablo S2). Kalan bileşikler, Sch 52901 (8), Sch 52900 (9), vertisilin A (10), aurofusarin (11), LC-MS verilerinin önceki bir kütüphane ile karşılaştırılmasıyla belirlenmiştir. izole edilmiş mantar metabolitleri (El-Elimat ve diğerleri, 2013, Figueroa ve diğerleri, 2014).

2.2. Mantar metabolitleri
Hepsi bilinen bileşikler olan toplam on bir sekonder metabolit tanımlanmıştır. mantar izolatlarından (Şekil 1, Tablo S2). Alternariol (1), alternariol bileşikleri monometil eter (2), 5′epi-equisetin (3) equisetin (4), 10-11 dehidrokurvularin (5), makrosphelide A (6) ve kordipiridon A (7), kromatografik yöntemlerle izole edildi ve spektroskopik verileri (doğru kütle, 1 H NMR ve 13C NMR) uyumlu literatür raporları (Tablo S2). Kalan bileşikler, Sch 52901 (8), Sch 52900 (9), vertisilin A (10), aurofusarin (11), LC-MS verilerinin önceki bir kütüphane ile karşılaştırılmasıyla belirlenmiştir.
izole edilmiş mantar metabolitleri (El-Elimat ve diğerleri, 2013, Figueroa ve diğerleri, 2014).

2.3. Bitki materyalinde mantar metabolitlerinin varlığı
Mantar endofitlerinden tanımlanan on bir metabolitten bir bileşik, alternariol monometil eter (2), burada kullanılan yöntemlerle botanik bir ekstraktta tespit edilmiştir. Tutulma süresi, doğru kütle ([M + H] +, 273.0754, C15H13O5 için hesaplanan +, 273.0763) ve MS-MS Ekstraktaki varsayılan alternariol monometil eter iyonu için parçalanma modeli eşleşti izole edilmiş alternariol monometil eterinki (Şekil 2). Alternariol monometil eter, H'den elde edilen bir tohum ekstraktının iki bitişik normal faz kromatografi fraksiyonunda tespit edildi. canadensis. Bu bileşik, aynı ekstraktın diğer fraksiyonlarında ve boşta her analizden önce yapılan enjeksiyonlar. Ek olarak, H. canadensis, saptanabilir seviyelerde alternariol monometil eter içermemiştir. Botanik tohum ekstraktında alternariol monometil eter mevcudiyeti ile tutarlı olarak, bu bileşik ayrıca iki H. canadensis sapından ve tohum endofitlerinden (Alternaria sp., G13 ve G31, Tablo 1). İlginçtir, Alternaria spp. hem endofit olarak var olduğu bilinmektedir hem de bitki patojenleri (Woudenberg ve diğerleri, 2013) ve bu nedenle bu mantarın H canadensis tohumları, H. canadensis fidelerine bulaşma aracıdır. Aynı zamanda mantar, antimikrobiyal bileşikler üreterek tohumlar üzerinde koruyucu bir etki sağlayabilir.

Şekil 2. Bir ekstrakttan konsantre bir fraksiyonda m / z 273.0755 için seçilen iyon kromatogramı H. canadensis tohumları (1 mg / mL'de analiz edildi) (A) ve izole alternariol monometil eter Alternaria sp. 1 mg / mL (B) konsantrasyonda. MS-MS parçalanma kalıpları m / z 273.0754'teki öncü iyon, burada tespit edilen bileşik arasında mükemmel uyum içindedir. bitki materyali (C) ve izole edilmiş alternariol monometil eter (D). NL, kütle seviyesini gösterir her bir spektrum veya kromatogramın normalleştirildiği spektrometrik sinyal. H. canadensis tohumlarının ekstraktında alternariol monometil eterin varlığı biliniyor. Alternaria sp tarafından kolonize edilmiştir. bu bileşik için mantar kökenli olduğunu oldukça düşündürmektedir. Mümkün Alternariol monometil eterin bitkinin kendisi tarafından üretildiğinin açıklaması, bununla birlikte, dışladı. Alternariol monometil eter, literatürde bir mantar türü olarak geniş çapta rapor edilmiştir. metabolit. Aly vd. (2008), Polygonum senegalense bitkisinde de bu metaboliti tespit etti, Alternaria sp. ile kolonize olan ve varlığını mantara değil, botanik. Onocha vd. botanik bir Anthocleista'da alternariol monometil eter tespit edildi djalonensis. Bu yazarlar, alternariol monometil eterin botanik kökenli olduğunu varsaydılar. botanik numunede görünür küf olmamasının temeli (Onocha ve diğerleri, 1995). Ancak, başka açıklama, mantar endofitleri tarafından üretilmesiydi ve bunlar olmadan da mevcut olabilirdi. herhangi bir görünür enfeksiyon semptomu.

2.4. Mantar metabolitlerinin ve botanik ekstraktların antimikrobiyal aktivitesi
Alternariol monometil eterin, H. canadensis, Staphylococcus aureus'a karşı antimikrobiyal aktivite, botanik özler ve izole edilmiş alternariol monometil eter için. S. aureus test olarak seçildi
bu çalışma için durum, çünkü yaygın bir Gram-pozitif bakteriyel patojen (Kaatz ve Seo, 1995). Tablo 2'de gösterildiği gibi, tohum ekstresi sadece zayıf antimikrobiyal aktivite göstermiştir. (Şekil S1), minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) ≥200 μg / mL'dir. H. canadensis hava kısmı ekstresi, 200 μg / mL'lik bir MIC ile biraz daha aktifti (Şekil S2). Bu ekstraktın antimikrobiyal aktivitesi muhtemelen bitki kaynaklı alkaloidlerden kaynaklanmaktadır. H. canadensis yapraklarında bol olduğu bilinmektedir (Ettefagh ve diğerleri, 2011 Saflaştırılmış alternariol monometil eter, bir MIC ile botanik ekstraktlardan daha antimikrobiyal olarak daha aktifti. 75 μg / mL (Şekil S3)

MIC, OD600'ün ≥% 95 oranında azalmasına neden olan konsantrasyon olarak tanımlanır. b Konsantrasyon, test kuyucuk hacminin mL'si başına μg / mL kurutulmuş bitki özütü olarak ifade edilir. c Berberine, pozitif bir kontrol olarak hizmet etti ve önceki raporlarla tutarlı aktivite gösterdi (Amin ve ark., 1969, Ŀerſáková ve Košťálová, 2002). Botanik ekstraktlarda alternariol monometil eterin kantitatif analizi için sonuçlar Tablo 2'deki bulgular için bazı bağlamlar sağlayın. Bu bileşik yalnızca saflaştırılmış H. canadensis tohum ekstresinin fraksiyonu ve bu ekstraktaki konsantrasyona bağlı olarak, orijinal ekstraktta geriye doğru hesaplanan alternariol monometil eter konsantrasyonu bulundu 991 ppm (kg kuru tohum materyali başına mg alternariol monometil eter olarak ifade edilir). Şurada: biyoanalizde test edilen en yüksek tohum özütü konsantrasyonu (200 μg / mL, μg olarak ifade edilir) mL tahlil hacmi başına ekstrakt), bu yalnızca 0,198 μg / mL tahlil konsantrasyonuna eşittir alternariol monometil eter, bunun için gözlenen 75 μg / mL MIC değerinin oldukça altında bileşik. Bu nedenle, tohum özütünün belirgin antimikrobiyal göstermemiş olması şaşırtıcı değildir. aktivite (Tablo 2). Bununla birlikte, mantar endofitlerinin çoğunun izole edildiğini belirtmek gerekir. Bu çalışmanın bir kısmı antimikrobiyal aktiviteye sahipti (Tablo S1) ve birkaç antimikrobiyal bu mantarlardan bileşikler belirlendi (Tablo S2). Kombine edilmiş olması tamamen mümkündür çoklu düşük seviyeli antimikrobiyal fungal metabolitlerin etkisi, genel botanik bir ekstraktın aktivitesi. Ayrıca, burada araştırılan mantarlar da muhtemelen Bitkilerde endofit olarak büyürken izole edilmişlerden farklı metabolitler üretirler. kültür. Bu olasılıkları keşfetmek için daha ileri çalışmalar gerekli olacaktır.H. canadensis tohumlarında alternariol monometil eterin tespiti, fungus bitkiye bir miktar fayda sağlayabilir. 991 ppm ölçülen miktar H. canadensis tohumlarındaki alternariol monometil eter, bildirilen konsantrasyon aralığındadır. ergot ve lolin alkaloidleri gibi ekolojik olarak önemli olduğu bilinen metabolitler için yerli otların mantar endofitleri tarafından üretilir (Jarmusch ve diğerleri, 2016, Shymanovich ve diğerleri, 2014). Ergot ve lolin alkaloit alkaloidleri otları böcek otçullarından korumaya yardımcı olur (Bush ve diğerleri al., 1997). Benzer bir şekilde, H. canadensis tohumları bitkinin bakteriyel patojenlerden korunmasına yardımcı olabilir. Bunun keşfi hipotez, daha ileri çalışmalar için bir başka ilginç yol olacaktır. Verilerimizin, Alternaria'nın H. canadensis'i kolonileştirmesinin potansiyel bir ekolojik rolüne işaret ettiği göz önüne alındığında, Bu cinsten mantarların birden fazla koleksiyondan izole edilip edilemeyeceğini değerlendirmeye çalıştık H. canadensis. Nitekim, Alternaria cinsinin mantarları, beş yıllık bir süre boyunca aynı arsadan goldenseal. Alternaria sp. izole edilmiştir H. canadensis tohumları 11/7/2011 ve 6/28/2012 tarihlerinde hasat edilmiştir (atanan G31 erişim numaraları ve G75, sırasıyla). 6/11/2015 tarihinde yürütülen üçüncü bir koleksiyon için Alternaria sp. oldu H. canadensis yaprak dokusu segmentlerinden izole edilmiştir (erişim numarası G657). Endofitler Üç farklı koleksiyondan izole edilen Alternaria türlerinin morfolojik karakteristiğini göstermiş, zincirlerde koyu renkli, kuru, fayodiktiosporların (conidia) üretimini içeren sivrilen apikal hücrelerin gagası (Woudenberg ve diğerleri, 2013). Üç izolatın tümü>% 98 gösterdi Alternaria alternata bölümü Alternata (CBS 916.96) ile ITS bölgesinde dizi benzerliği (Pryor ve Michailides, 2002, Woudenberg ve diğerleri, 2013). Bununla birlikte, Woudenberg ve ark. Alternaria bölüm Alternata'nın ITS bölgesinde düşük varyasyon gözlemledik, kullanmaktan kaçınıyoruz Bu çalışmada Alternaria izolatları için tür epiteti. Özet olarak, burada antimikrobiyal bileşik alternariolün tespiti hakkında rapor veriyoruz. geleneksel tıpta tedavi etmek için kullanılan bir botanik tıbbın tohumlarındaki monometil eter enfeksiyon. Bu metabolitin konsantrasyonu, başlıca sorumlu olamayacak kadar düşüktü. H. canadensis botanik ekstraktlarının Staphylococcus aureus'a karşı antimikrobiyal aktivite. Bununla birlikte, Alternaria spp. ekolojik öneme sahip olabilir. Alternaria spp. H. canadensis'in birden fazla katılımından bu hipotezi desteklemektedir. Alternaria türlerinin varlığını araştırmak için gelecekteki çalışmalar. H. canadensis'te farklı coğrafi konumlar ilgi çekici olabilir.

3. Yöntemler
3.1. Bitki materyalinin satın alınması
Bitki materyali, Hendersonville, NC (N35 ° 24.2770, W 07/11/2011 tarihinde 082 ° 20.9930) ve North Carolina Üniversitesi'ne bir kupon yatırıldı Herbaryum (erişim numarası NCU 583414). 6/28/2012 tarihinde ek koleksiyonlar yapıldı ve fungal endofitlerin daha fazla karakterizasyonu için aynı grafikten 6/11/2015 (Tablo S3).
3.2. Mantar yetiştirme ve suş tanımlama
Taze bitki örnekleri, daha önce açıklandığı gibi yüzey sterilize edildi (Raja ve diğerleri, 2015). Toplamda 100 gövde segmenti içeren 320 segment kaplandı; 100 yaprak segmenti; 70 kök segmentler; ve 50 tohum. Goldenseal bitki parçalarından ortaya çıkan tüm fungal endofit kültürleri Potato Dextrose Agar'da muhafaza edilir; Üniversitede 9 ° C'de Difco (PDA) agar eğimli
Greensboro'da Kuzey Carolina, Kimya ve Biyokimya Fungal Kültürü Bölümü Toplamak. H. canadensis'in dokularından toplam 23 mantar kültürü yapılmıştır (11 Temmuz'da toplanmıştır. 2011) ve daha önce açıklandığı gibi (Raja vd., 2015). Kimyasal ekstraksiyondan önce tüm pirinç kültürlerinin 14-21 gün büyümesine izin verildi. Goldenseal'den izole edilen fungal endofitlerin moleküler tanımlanması için, dahili ribozomal RNA geninin (ITS) kopyalanmış aralayıcı bölgesi, protokoller kullanılarak sıralandı daha önce özetlenen (Raja ve diğerleri, 2015, Kellogg ve diğerleri, 2016) ve operasyonel taksonomik birim Tür tanımlamaları için vekil olarak (OTU) tanımlamaları BLAST arama aracı ile yapılmıştır. % 98 özdeşlik kullanarak NCBI GenBank'ta yalnızca doğrulanmış, yayınlanmış dizileri kullanarak (Raja ve diğerleri, 2015, Schoch ve diğerleri, 2014). Tüm suşların ITS dizileri GenBank'ta depolanmıştır ve Tablo 1 ve Tablo S3'te listelenmiştir.
3.3. Ekstraksiyon ve hazırlık
Ekstraksiyon için, bitki materyalinin gevrekleşene kadar birkaç hafta havada kurumasına izin verildi. Yapraklar ve saplar tohumlardan ayrıldı ve her bitki parçası ayrı ayrı ince bir toz haline getirildi Thomas Wiley Mini-Mill kullanarak. Mantar pirinç kültürleri ve botanik ekstraktları (59,2 gr toprak üstü kısımlar, 2.54 g tohumlar) 1: 1 metanol: kloroform içinde ekstrakte edildi ve sıvı-sıvıya tabi tutuldu daha önce açıklanan yöntemler kullanılarak bölümleme (El-Elimat ve diğerleri, 2015, Kaur ve diğerleri, 2016, Kellogg ve diğerleri, 2016, Raja ve diğerleri, 2015), bir kloroform, sulu ve heksan ile sonuçlanır bölümler. Kloroform bölümleri birincil ilgi konusuydu ve daha ileri araştırmalar için kullanıldı.
3.4. Mantar metabolitlerinin tanımlanması
Mantar özütleri, ultra performanslı sıvı kromatografisi (Acquity UPLC, Waters) yüksek çözünürlüklü güç tandem kütle spektrometrisine (LTQ Orbitrap XL, Thermo) (LC — MS-MS) önceden yayınlanmış yöntemlerle (El-Elimat ve diğerleri, 2013). tespit edilen her iyon için tutma süresi, doğru kütle ve fragmantasyon spektrumu karşılaştırıldı bilinen bileşikleri tanımlamak için 262 fungal metabolit için bir LC-MS verileri kütüphanesine (El-Elimat vd., 2013). Mevcut mantar kütüphanesinde temsil edilmeyen bileşikler izole edildi ve bir Combiflash Rf sisteminde birkaç tur flaş kromatografi ile karakterize edilir (Teledyne-ISCO, Lincoln, NE, USA) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi Varian HPLC sistemi (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD). Saf yapıları bileşikler NMR verilerine göre çözüldü (Joel ECS 400 MHz, Joel ECA 500 MHz, Varian 700 MHz) ve daha önce açıklandığı gibi doğru kütle ölçümleri (Raja ve diğerleri, 2015). Her biri için
izole edilmiş bileşik, NMR ve doğru kütle verileri literatür raporlarıyla eşleşmiştir (Tablo S2) Mantar özütlerinin LC-MS-MS verilerini toplamak için kullanılan aynı yöntem, H. canadensis'ten botanik özler. Fungal metabolitlerin, botanik ekstraktlar, elde edilen LC-MS verileri [M + H] + iyonunun m / z değeri için filtrelenmiştir. her bir mantar metabolitinin; 5 ppm izolasyon penceresi kullanıldı. Tanımlama için karşılaştırmalar tutma süresi, doğru kütle ve mevcut herhangi bir iyonun parçalanma modeli arasında yapılmıştır. hem botanik hem de mantar özlerinde. Herhangi bir mantar metabolitinin Ekstrelerde tespit edilen diğer mantar örneklerinden kazara kontaminasyonun bir sonucu değildir. Her numunenin analizi arasında birden fazla boş enjeksiyon yapıldı ve bu boş enjeksiyonlar, taşınmayı dışlamak için dikkatle incelendi.
3.5. Alternariol monometil eterin kantitatif analizi Alternaria sp. (Tablo S2)
50:50 metanol: dioksan içinde 1 μg / mL konsantrasyonda hazırlandı. Bunun kimliği bileşik NMR spektroskopi ile doğrulandı ve saflığının>% 95 olduğu belirlendi. UPLC'de (Kellogg ve diğerleri, 2016). Stok çözümünden kalibrasyon çözümleri, 0.2 mg / mL ila 2 ng / mL konsantrasyon aralığında seri seyreltme. Bu çözümler Daha önce tarif edildiği gibi özütlere uygulanan aynı LC-MS-MS yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir (ElElimat ve diğerleri, 2013). Seçilen [M + H] + iyonu için tepe alanı olarak bir kalibrasyon eğrisi hesaplandı
alternariol monometil eter (m / z 273.0755) ve alternariol için fungal ve botanik ekstraktlarda monometil eter konsantrasyonu esas alınarak belirlenmiştir. bu kalibrasyon eğrisi için en uygun çizgi.
3.6. Antimikrobiyal aktivitenin değerlendirilmesi
Broth mikrodilüsyon testleri için Klinik Laboratuvar Standartları Enstitüsü (Ferraro, 2000) yöntemleri tüm fungal ve botanik ekstraktların antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için kullanıldı
izole edilmiş alternariol monometil eter olarak. Aktivite Staphylococcus'a karşı değerlendirildi aureus suşu SA1199 (Kaatz ve Seo, 1995). Bilinen antimikrobiyal bileşik berberin bu deneyler için pozitif bir kontrol görevi gördü (Junio ve diğerleri, 2011). Tüm numuneler test edildi her bir oyukta% 2 nihai DMSO içeriği ile üç kopya. Büyüme aşağıdakilere göre ölçülmüştür: 600 nm'de (OD600) absorbans ölçümleri. Minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) test oyuklarının ortalama OD600'ünün -% 95 oranında azaldığı konsantrasyon olarak tanımlanır.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Tamamlayıcı ve Bütünleştirici Merkezi tarafından kısmen desteklenmiştir. Ulusal Sağlık Enstitülerinin bir bileşeni olan Sağlık (Grant R01 AT006860) ve Kuzey Carolina Biyoteknoloji Merkezi (2011-BRG-1206). William A. Birch bitki sağladı Bu çalışma için örnekler. Kütle spektrometresi verileri Triad Kütle Spektrometresinde toplandı Dr. Daniel A. Todd'un yardımıyla tesis. Teknik için Tamam El-Elimat'a teşekkür ederiz. LC-MS dereplication ile yardım.

Kaynak: https://libres.uncg.edu/ir/uncg/f/N_...obial_2016.pdf

**mert** · 05 April 2021, 17:18

Goldenseal'in ( Hydrastis canadensis ) Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus'a (MRSA) karşı Quorum Quenching ve Antimikrobiyal Aktivitesi
Nadja B. Cech , 1, * Hiyas A. Junio , 1 Laynez W. Ackermann , 2 Jeffrey S. Kavanaugh , 2 ve Alexander R. Horswill 2

Öz
Popüler bitkisel ilaç goldenseal ( Hydrastis canadensis L.) geleneksel olarak cilt enfeksiyonlarını tedavi etmek için kullanılır. Bu çalışma ile, H. canadensis ekstraktlarının metisiline dirençli Staphylococcus aureus'a (MRSA) karşı in vitro aktivitesini gösterdik . H. canadensis yapraklarından elde edilen bir ekstrakt, tek başına alkaloid berberinden daha güçlü antimikrobiyal aktivite gösterdi (sırasıyla 75 ug / mL ve 150 ug / mL MIC'ler). LC-MS, ekstraktta alkaloidler ve efluks pompası inhibe edici flavonoidler tespit etti ve ikincisi, tek başına berberine kıyasla ekstraktın artan etkinliğini açıklayabilir. Ayrıca, anti-virülans aktivitesinin, H. canadensis'in buna karşı hareket ettiği ikinci bir mekanizma olduğuna dair kanıt gösteriyoruzS. aureus . H. canadensis çeşitli klinik olarak ilgili MRSA izolatları karşı yaprak ekstresi (ancak izole alkaloidler berberin, hydrastine ve canadine) göstermiştir çekirdek söndürme etkinliği (USA300 suş). Verilerimiz, bunun AgrCA iki bileşenli sistem aracılığıyla sinyal iletiminin zayıflatılmasıyla gerçekleştiğini göstermektedir. Bu gözlemle tutarlı olarak, özüt, MRSA tarafından toksin üretimini inhibe etti ve MRSA'nın in vitro keratinosit hücrelerine zarar vermesini önledi . Toplu olarak, sonuçlarımız, H. canadensis yaprak özlerinin, birkaç farklı mekanizma yoluyla MRSA'ya karşı etki eden bir bileşen karışımına sahip olduğunu göstermektedir . Bu bulgular, ham H. canadensis'in geleneksel uygulamasını desteklemektedir. enfeksiyonun önlenmesi tedavisinde özler.

Anahtar Kelimeler: Hydrastis canadensis , Ranunculaceae, quorum quenching, berberine, metisiline dirençli Staphylococcus aureus , anti-virülans

Giriş
Avrupa Antimikrobiyal Gözetim Sistemleri, dünya çapında 52 milyon kadar insanın çoklu ilaca dirençli bakterilerle kolonileştiğini tahmin ediyor. Bunların en yaygın ve ölümcül olanları arasında metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), şu anda ABD'de HIV / AIDS'ten daha fazla yıllık ölüme neden oluyor [ 1 ]. Toplum ve sağlık bakımı ortamlarında artan MRSA seviyeleri oranları ve ilaca dirençli bakteriyel enfeksiyonlarla ilişkili artan hastalık yükü ve daha yüksek tedavi maliyetleri [ 2 ] ile, MRSA gibi sorunlu patojenlerle mücadele etmek için yeni stratejiler geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır. İlaca dirençli bakteriyel patojenleri etkisiz hale getirmek için virülans temelli yaklaşımlar giderek daha fazla geliştirilmektedir [ 3 ]. Bu ajanlar, mevcut antibiyotiklerden daha patojene özgü olacaktır, ancak tüm cilt ve yumuşak doku enfeksiyonlarının tahmini% 76'sını içeren S. aureus ve MRSA'nın neden olduğu hastalık yükünün çokluğu [ 4 ], MRSA hedefli terapötikler geliştirmenin değerini vurgulamaktadır. . Bu tür ajanların özgüllüğü ve virülans önleyici doğası, yaygın ilaç direncinin gelişimini sınırlayabilir, sonraki enfeksiyonu önleyecek immün yanıtların gelişimini kolaylaştırabilir ve normal mikrobiyal flora üzerindeki olumsuz etkilerden kaçınabilir [ 3 ]. MRSA virülans önleme stratejisi olarak çekici bir hedef, yetersayı algılama sistemidir [5 , 6 ]. S. aureus quorum-sensing, yardımcı gen düzenleyici veya " agr " sistemi olarak da adlandırılır (Şekil 1), birçok konakçıya zarar veren ajanın veya "virülans faktörünün" üretimini kontrol eden hücre yoğunluğuna bağlı bir düzenleyici sistemdir. Bu sistem, S. aureus tarafından biyosentezlenen ve salgılanan, oto indükleyici peptid (AIP) adı verilen salgılanan bir peptid sinyaline yanıt verir . S. aureus suşuna bağlı olarak, salgılanan AIP'nin yapısı dört tipten herhangi biri olabilir (AIP-1, AIP-2, AIP-3 veya AIP-4). AIP sinyalinin hücre dışı konsantrasyonu yeterince yüksek olduğunda, AgrC adı verilen bir yüzey reseptörüne bağlanarak bir sinyal iletim kaskadını etkinleştirir. Bu kademenin temel bileşenleri AgrCA iki bileşenli düzenleyici çifttir ve aktive edildiğinde hücre dışı virülans faktörlerinin üretimini tetiklerler. Mutasyonlar tarsisteminin, hayvan enfeksiyon modellerinde patogenezi azalttığı bilinmektedir [ 5 ] ve çok sayıda çalışma, agr sisteminin küçük moleküllü inhibisyonunun, hayvan modellerinde deri ve yumuşak doku enfeksiyonlarını hafiflettiğini göstermiştir [ 5 , 7 , 8 ].

Amacımız , popüler [ 9 ] bitkisel ilaç goldenseal'in (Hydrastis canadensis L.), MRSA'nın çeşitli klinik izolatlarına karşı in vitro etkinliğini araştırmaktı . H. canadensis , en bol olanı berberin olan bir dizi alkaloid içerir [ 10 ]. Daha önce, H. canadensis , çeşitli Gram pozitif bakterilere [karşı antimikrobiyal aktivite göstermiştir 10 - 13 ] ve berberin MRSA büyümesini [inhibe ettiği gösterilmiştir 14 ]. Bununla birlikte, ham H. canadensis'in antimikrobiyal aktivitesiMRSA'ya karşı özütler hiçbir zaman rapor edilmedi ve bunların yetersayı su verme etkinliği araştırılmadı. Bu çalışmalarla, H. canadensis yaprak ekstraktlarının antimikrobiyal etkilerinin, farklı mekanizmalar yoluyla hareket eden çoklu bileşenlerin birleşik etkisinden kaynaklandığına dair merkezi hipotezi test ettik . Bu hipotez, kısmen Stermitz ve. al, berberinin antimikrobiyal aktivitesinin diğer bitki bileşenleri tarafından güçlendirildiği gösterilmiştir [ 15 , 16 ]. Bu deneylerde özellikle H. canadensis yaprak özütlerine odaklandık , çünkü önceki çalışmalarımız yaprak özütlerinin berberinin antimikrobiyal aktivitesine sinerjist olarak kök özlerinden daha etkili olduğunu gösterdi [ 17]. H. canadensis kök ekstraktlarının en yaygın olarak geleneksel tıp uygulamalarında kullanılmasına rağmen [ 18 ], enfeksiyona karşı altınmühür yaprak ekstrelerinin topikal kullanımı için emsal vardır [ 19 ]. Bu çalışmadaki hedeflerimiz, bir H. canadensis yaprağı ekstraktını bir antimikrobiyal ajan ve MRSA için çekirdek çoğaltıcı olarak değerlendirmek ve ham ekstraktın aktivitesini ana alkaloid berberin ile karşılaştırmaktı. Özellikle, toplum kökenli yumuşak doku enfeksiyonlarında gözlenen en yaygın MRSA suşu olarak ortaya çıkan USA300 MRSA izolatlarına karşı aktiviteyi araştırdık [ 4 , 20 ].

Bakterileri, Kimyasalları ve Biyokimyasalları Test Edin
Bu çalışmada kullanılan yabani tip S. aureus suşları CA-MRSA USA300 TCH1516 [ 21 ], LAC [ 22 ], AH1263 (LAC * olarak da adlandırılır) [ 23 ] ve SA502A'dır [ 24 ]. Plazmid pDB59 içeren S. aureus quorum-sensing raportör suşları da kullanıldı ve agr grup I (CA-MRSA USA300 LAC), agr grup II (SA502A) ve agr grup III (CA-MRSA MW2) temsilcilerini içeriyordu [ 25 ] . Söndürmeyi araştırmak için ek çalışmalar, S. aureus lux muhabir suşu ROJ143'ten yararlanılmıştır [ 26 , 27]. Epitel toksisite testleri için USA300 suşu AH1263'ün (LAC *) alfa toksini ( Δhla :: Erm) [ 28 ] veya agr ( Δagr :: Tet) [ 29 ] mutantları kullanıldı. Triptik soya suyu (TSB), Mueller Hinton suyu, karbonil siyanür m-kloro-fenilhidrazon (CCCP, TLC'ye göre saflık>% 98), berberin (HPLC'ye göre saflık>% 98), (1R, 9S) - (-) - β -hidrastin (HPLC'ye göre>% 98 saflık) ve DMSO, Sigma Aldrich'ten (Saint Louis, MO, ABD) ve kanadin (tetrahidroberberin, HPLC ile saflık>% 98, stereokimya onaylanmamış) Chromadex'ten (Irvine, CA, ABD) satın alındı. Sideroksilin, 8-desmetil-sideroksilin ve 6-desmetil-sideroksilin daha önce H. canadensis yapraklarından izole edilmiştir [ 30]>% 98 saflıkta. Asetik asit, Fisher Chemical'dan (Pittsburgh, PA, ABD) satın alındı. Etanol (% 95), HPLC dereceli asetonitril ve HPLC dereceli metanol, Pharmaco-AAPER'den (Shelbyville, KY, ABD) elde edildi. Su, bir nanodiamond sistemi (Barnstead, Dubuque, IA, ABD) ile saflaştırıldı.

Bitki materyali
Yetiştirilen Hydrastis canadensis L . (Ranunculaceae) Eylül 2008'de: K 35 ° 24.277 ', B 082 ° 20.993', 702.4 m yükseklikten hasat edildi. Bir kupon örneği, North Carolina Herbarium Üniversitesi'nde (NCU583414) saklanır ve kimlik Dr. Alan S. Weakly tarafından onaylanır.

Ekstraksiyon ve LC-MS
Ekstreler, hidroetanolik Hydrastis canadensis takviyelerinin [ 31 ] imalatında kullanılan standart prosedürlere göre , başka bir yerde [ 17 ] tarif edildiği gibi hazırlandı . 1: 5 (g bitki materyali: mL çözücü) oranında% 50 etanol:% 50 su içeren bir çözücü kullanılmıştır. Çözücü (500 mL), H. canadensis bitkilerinin (100 g) tüm hava (yer üstü) kısmı ile harmanlandı ve 24 saat yumuşatıldı, sonra vakum altında süzüldü. Bu kağıt boyunca H. canadensis yaprak özütü olarak anılacak olan elde edilen özüt, oda sıcaklığında amber bir şişede saklandı. Biyolojik aktivite ve HPLC profili, üç yıllık bir süre boyunca bu ekstrakt için tutarlıydı. Ekstrakt, alkaloid ve flavonoid miktarını ve kimliğini belirlemek için sıvı kromatografi - kütle spektrometrisi (LC-MS) ile profillendirildi. Alkaloidlerin ve flavonoidlerin kantitatif analizi ( Tablo 1, Ek Bilgiler ) yerleşik bir yöntem kullanılarak gerçekleştirildi [ 17 , 30 ]. Bileşen kimlikleri, bir ultra performanslı sıvı kromatografına (UPLC) (Waters, Alliance) bağlanan bir LTQ-Orbitrap yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinde (Thermo, San Jose, CA, ABD) doğrulandı. daha önce rapor edildiği gibi, doğrulanmış standartlara ait olanlar [ 30 ]. Aşağıdaki gradyan kullanıldı, burada A = HPLC dereceli asetonitril ve B =% 0.1 sulu formik asit: 0 ila 5.0 dakika arasında% 90 -% 70 B; % 70 ila% 50 B, 5 ila 7.0 dak; 7.0 ila 7.5 dak arasında% 50 ila% 45, 7.5 ila 8.0 dak arasında% 45 ila% 0 B,% 0 B'de 8.0 ila 8.5 dak ve% 0 ila% 90 8.5 ila 9.0 dak. 100-1000 m / z kütle aralığı ile alkaloidler için pozitif iyon modunda ve flavonoidler için negatif iyon modunda MS analizi yapılmıştır . Kapiler sıcaklık 300 ° C, kılıf gaz basıncı 28 (keyfi birimler) ve kaynak, kılcal ve tüp lens voltajları sırasıyla 4.30 kV, 29 V ve 110 V idi.

Broth Mikrodilüsyon MIC Testleri
Minimum inhibitör konsantrasyon (MIC), Klinik Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) standart prosedürlerine göre ölçülmüştür [ 32 ]. Kısaca özütler veya saflaştırılmış berberin (+ kontrol), Mueller Hinton Broth içinde 4,7 ila 300 ug / mL arasında değişen konsantrasyonlarda üç kopya halinde 96 oyuklu plakalara ilave edildi. Araç (% 2 DMSO), negatif kontroldü ve DMSO içeriği, tüm oyuklarda% 2 olarak sabitlendi. Tek bir koloni izolatı 24 saatlik kültür , S. aureus AH1263, TCH1516, LAC, Mueller Hinton suyu içinde log fazında büyütülmüştür ve 1.0 x 10 bir son yoğunlukta ilave edildi 5CFU / mL. 600 nm'de abzorbans, bir POLARstar Optima mikroplaka okuyucusu (BMG Labtech, Inc) kullanılarak 24 saat sonra ölçüldü. MIC, tedavi ile araç kontrolü arasında istatistiksel olarak önemli bir farkın olmadığı konsantrasyon olarak tanımlandı. Bakteriler hariç tüm analiz bileşenlerini içeren kopya oyuklar için absorbans, analiz oyuklarının absorbansından çıkarıldı.

Floresan raportörlerle quorum quenching assays
PDB59 içeren S. aureus quorum-sensing raportör suşları, çalkalanarak 37 ° C'de 10 ug / mL'de kloramfenikol ile takviye edilmiş TSB içerisinde gece boyunca büyütüldü. Özleri veya numunelerin test edilmesi için, kültürler (yaklaşık 4-10 x 10 ila 500-kat TSB seyreltildi 6 seyreltildikten sonra CFU / mL) ve 180 uL bir mikrotiter plakası içine dağıtılmıştır. Uygun konsantrasyona ulaşmak için numune veya araç kontrolü eklendi (20 uL) ve plakalar çalkalanarak (200 rpm) 37 ° C'de inkübe edildi. Belirlenen zaman noktalarında, bir Tecan Infinite M200 plaka okuyucusunda absorbans (600 nM) ve floresans (eksitasyon 485 nm, emisyon 530 nm) ölçüldü. Bildirilen değerler 30 saatlik büyüme içindir.

Lux muhabiriyle quorum quenching assay
AIP-1 ve AIP-2 , sırasıyla AH1263 ve SA502A S. aureus suşlarının gece TSB kültürlerinin filtre sterilizasyonuyla elde edildi [ 24 ]. Lux raportör suşu ROJ143'ün bir gecelik kültürü, kloramfenikol (10 ug / mL) içeren TSB'de 1:50 alt kültürlendi ve 0,8'lik OD 600'e çalkalanarak 37 ° C'de büyütüldü . Lux raportör suşunun alikotları (164 µL), 20 µL AH1263 koşullu ortam (yani AIP-1) ve H. canadensis içeren dörtlü mikrotitre plaka oyuklarına eklenmiştir.çeşitli alt inhibitör konsantrasyonlarda ekstrakte edildi, öyle ki tüm oyuklar% 0.8'lik bir nihai DMSO konsantrasyonu içeriyordu. Çalkalama (200 rpm) ile 37 ° C'de 90 dakika inkübasyonun ardından, biyolüminesans bir Tecan Infinite M20 plaka okuyucuda ölçülmüştür. Karşılaştırma için, lüks muhabir, H. canadensis'i SA502A koşullu ortamla (ayrıca% 0.8 DMSO'da) değiştirerek AIP-2 ile inhibe edildi .

İnsan derisi epitel toksisite analizi
USA300 suşu AH1263 (LAC *) ve bir alfa-toksin mutasyonu veya bir agr delesyonuna sahip türevler , TSB içerisinde gece boyunca büyütüldü. 10 mL TSB ve bir dizi alt inhibe edici H. canadensis konsantrasyonları (sabit% 0.8 DMSO ile ) içeren kültür şişeleri (50 mL) , AH1263 gece boyunca kültür ile 1: 500 aşılandı. Yalnızca DMSO aracı içeren TSB alikotları agr ve hla mutantları ile aşılanmıştır . 37 ° C'de çalkalama (225 rpm) ile 11 saatlik büyümenin ardından, kültürler SpinX filtrelerinden (0.22 µm, Corning) süzüldü ve ortamın α-toksin içeriği daha önce açıklandığı gibi immünoblotlama ile ölçüldü [ 28]. İnsan keratinositleri (HaCaT), penisilin / streptomisin ile% 10 fetal buzağı serumu ile RPMI içinde kültürlendi [ 33 ]. Harcanan ortam, filtre ile sterilize edildi ve HaCaT ortamında 5 kat seyreltildi. Bu harcanan ortamın (0.5 mL) alikotları, 24 oyuklu plakalarda birleşen HaCaT'ye ilave edildi ve 24 saat inkübe edildi. Toksisiteyi değerlendirmek için laktat dehidrojenaz salımı, ticari olarak temin edilebilen bir kit (Promega CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay) ile ölçüldü.

İstatistik
Ortalamaların kontrollere kıyasla önemi, iki örneklemli eşit varyans, 2 kuyruklu öğrenci t-testleri ile hesaplandı.

Şuraya gidin:
Sonuçlar ve tartışma
Bu çalışmanın amaçlarından biri, bir H. canadensis ekstresinin MRSA'ya karşı antimikrobiyal aktivitesini , majör alkaloid berberininki ile karşılaştırmaktı. Bir H. canadensis yaprak özütü ( Şekil 1S'deki, Destekleyici Bilgiler'deki kromatograma bakınız ) berberin içeriğine standardize edildi ve antimikrobiyal aktivitesi, tek başına aynı berberin konsantrasyonları ile MRSA suşu USA300 AH1263 (LAC *) [ 22 ] ile yan yana değerlendirildi (şekil 2). Ekstrakt, saf berberine (150 µg / mL) kıyasla daha düşük bir MIC değeri (75 µg / mL, µg berberin / mL test hacmi olarak rapor edilir) göstererek, berberin dışındaki bileşenlerin buna karşı aktivitesinde rol oynadığını gösterir. MRSA. Berberinin bu testte pozitif kontrolde görev yaptığını ve gözlemlediğimiz MIC'in, bu alkaloidin S. aureus'a karşı aktivitesi ile ilgili önceki sayısız raporla tutarlı olduğunu unutmayın [ 10 , 34 , 35 ]. Ekstrelerin tek başına berberine kıyasla artmış aktivitesinin sideroksilin, 8-desmetil-sideroksilin ve 6-desmetil-sideroksilin (Figür 3), daha önce H. canadensis'in bileşenlerinde bildirilen [ 30 , 36 ]. H. canadensis flavonoidlerinin, efluks pompası inhibisyonu yoluyla berberinin antimikrobiyal aktivitesini artırdığı gösterilmiştir [ 30 ] ve burada araştırılan H. canadensis ekstrelerinde tespit edilmiştir ( Tablo 1S, Destekleyici Bilgiler ).

İncir. 2
Goldenseal ( Hydrastis canadensis ) yaprak ekstresi ve berberinin antimikrobiyal aktivitesinin MRSA suşu USA300 AH1263'e karşı karşılaştırılması [ 22 ]. Ekstrakt, x ekseninde gösterilen berberin içeriğine standardize edildi. Her iki test numunesi için iki kat seri seyreltme yoluyla farklı konsantrasyonlar hazırlandı. Yaprak özütü, 150 µg / mL'de izole edilmiş berberinin MIC'sinden üç kat daha düşük olan 38 µg / mL'de (µg berberin / mL test hacmi olarak ifade edilir) bir MIC değeri gösterdi. Hata çubukları , üçlü deney kuyularının OD 600'ü için standart sapmayı temsil eder

Şek. 3
Başlıca alkaloidlerin yapıları, berberin ( 1 ), (1R, 9S) - (-) - β-hidrastin ( 2 ) ve kanadin (tetrahidroberberin) ( 3 ) ve flavonoidler, sideroksilin ( 4) , 8-desmetil-sideroksilin ( 5) ) ve Hydrastis canadensis'te bulunan 6-desmetil-sideroksilin ( 6 ) .

Sonuçlarımız, H. canadensis yaprak özlerinin antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir . Bu aktivite büyük olasılıkla, üç farklı MRSA suşuna karşı 150 µg / mL ila 300 µg / mL arasında değişen MIC değerleri gösteren alkaloid berberinin etkisinden kaynaklanmaktadır ( Tablo 2S, Destekleyici Bilgiler ). Özellikle, diğer iki altınmühür alkaloid [ 10 ], kanadin ve hidrastin (Figür 3), değerlendirilen üç MRSA suşuna karşı herhangi bir antimikrobiyal aktivite göstermedi ( Tablo 2S ). Mevcut çalışma, antimikrobiyal aktivite elde etmek için nispeten yüksek konsantrasyonlarda H. canadensis yaprak özleri veya saflaştırılmış berberin gerektiğini göstermektedir; ancak, bu botanikin çeşitli enfeksiyonlar için oldukça etkili bir tedavi olduğuna dair birçok anekdot raporu vardır [ 18 ]. S. aureus agr çoğunluğu algılama sistemi cilt enfeksiyonları önemli bir rol oynar. Bu nedenle, çekirdek yoğunlaştırma aktivitesinin, H. canadensis ekstraktlarının MRSA'ya karşı aktivitesini kısmen açıklayabileceğini varsaydık . Daha önce diğer çekirdek quenching ajanlarını karakterize etmek için kullanılan bir muhabir deneyi kullanıldı [ 37]. Alt inhibitör konsantrasyonlardaki özütler raportör suşlarla inkübe edildiğinde, agr tip I, II ve III habercilerle tutarlı ve sağlam doza bağlı bir söndürme etkisi gözlemledik (Şekil 4). Bu üç agr sınıfı, tüm S. aureus suşlarının büyük çoğunluğunu temsil eder [ 38 ], bu da H. canadensis yaprak ekstraktlarının genel bir quorum quenching maddesi içerdiğini gösterir. Bu yetersayı yumuşatma etkisi, majör H. canadensis alkaloid berberine (Şekil 4D), agr sistemini 75 µg / mL'de bile inhibe etmedi . Ayrıca diğer alkaloidler, hidrastin veya kanadin ile su verme aktivitesini gözlemleyemedik (veriler gösterilmemiştir).

Şekil 4
S. aureus agr P3-GFP muhabir suşlarında H. canadensis yaprak ekstresi ve berberin ile quorum quenching . Haberci suşlar ( agr tip I, panel A ; agr tip II, panel B ; agr tip III, panel C ) triptik soya suyu içinde büyütüldü ve özüt (berberine standardize edilmiş) 25 ve 50 ug / mL'de test edildi. Bu konsantrasyonlar, bu testin koşulları altında alt inhibitör oldukları için seçildi. Haberci suşlar, ekstrakt ile 30 saat süreyle inkübe edildi ve GFP floresansı ölçüldü. Karşılaştırma için, AIP reseptörünün rekabetçi bir inhibitörü ~% 95'e kadar söndürülür (gösterilmemiştir). Panel D'de , her biriagr raportör suşu büyütüldü ve aynı şekilde ölçüldü ve berberin (Berb) 75 ug / mL'ye eklendi ve araç kontrolü (Veh) olarak steril su ile karşılaştırıldı. * A , B panellerindeki araca (DMSO) kıyasla p <0.01'i gösterir . ve Cı . p- değerleri, iki kuyruklu bir öğrencinin t-testi ile hesaplandı ve hata çubukları, üçlü ölçümler için ortalamanın standart sapmasını temsil eder. Panel D' de araç ve berberin arasındaki sonuçlardaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi.Yetersayı algılayan kontrollü lüks destekleyici içeren bir S. aureus muhabir suşu kullanılarak , H. canadensis yaprak ekstresi mekanizmasının çekirdek quenching mekanizması hakkında fikir edinmek için daha fazla deney yapılmıştır [ 27 ]. Bu lux muhabir suşu, agrBD genlerindeki bir delesyon nedeniyle kendi AIP'sini yapmaz . Ortama AIP-1 eklendiğinde, lüks haberci açılır ve biyolüminesans oluşturur. Bu muhabir türü, AgrCA iki bileşenli sistemin (Şekil 1) söndürme eyleminin hedefi olabilir. Sabit düzeyde AIP-1 içeren numuneler oluşturduk, bunları çeşitli alt inhibitör konsantrasyonlarda H. canadensis (0-75 µg / mL, berberine standardize edilmiş) ile birleştirdik, bu karışımları muhabir suşlara maruz bıraktık ve biyolüminesansı ölçtük (Şekil 5). AgrCA'nın ekstraktın bazı bileşenlerinin olası bir hedefi olduğunu düşündüren doza bağlı inhibisyon gözlemledik. Bu hipotezi desteklemek için, özüt, bir AgrC rekabetçi antagonisti AIP-2 (Şekil 5). En belirgin inhibisyon mekanizması, hücre dışı ortama maruz kalan ve eksojen ajanlara karşı savunmasız olan AgrC üzerindeki AIP reseptörüdür [ 5 ]. Bu reseptöre bağlanma, lux muhabiri tarafından biyolüminesansın gözlenen baskılanmasına neden olur . Bununla birlikte, gözlemlenen etki için alternatif bir açıklama, aktif bileşiğin, yeni bir etkileşim yoluyla AIP'yi sekestre etmesi veya inaktive etmesi veya muhtemelen agr P3 promotörünü farklı bir düzenleyici mekanizma yoluyla bastırmasıdır .

Şekil 5
S. aureus agr lux muhabirinin H. canadensis yaprak ekstresi ile inhibisyonu . Eksojen AIP-1'e yanıt veren bir S. aureus lux muhabir suşu kullanıldı. Sabit bir AIP-1 seviyesi ekstrakt ile karıştırıldı, lux raportör ile inkübe edildi ve biyolüminesans ölçüldü. Ekstrakt, berberine standardize edildi ve 10–80 µg / mL konsantrasyon aralığına eklendi. Pozitif kontrol olarak bilinen bir inhibitör olan AIP-2 kullanıldı. Bildirilen değerler, ortalamanın standart sapmasını temsil eden hata çubukları ile dörtlü test kuyularının ortalamasını temsil eder ve * araca kıyasla p <0.0001'i gösterir (iki kuyruklu bir öğrencinin t-testi ile hesaplanmıştır).H. canadensis yaprak özütünün gözlemlenen yeteri çoğaltma aktivitesinin alaka düzeyinin başka bir kanıtı olarak, S. aureus tarafından alfa toksin üretimi üzerindeki etkisini araştırdık . Alfa toksin, deri apsesi dermonekrozunun birincil nedenidir [ 26 ] ve bu nedenle, potansiyel olarak H. canadensis biyoaktivitesi ile ilgilidir. Bu toksin hla geni tarafından kodlanır ve agr çekirdek algılama sisteminin doğrudan kontrolü altındadır [ 5 ]. USA300 suşu AH1263, artan özüt konsantrasyonları ile inkübe edildiğinde, alfa-toksin seviyeleri immünoblot ile değerlendirildiği gibi uyum içinde azaldı (Şekil 6A). Bu bulgular, transkripsiyonel raportör tahlil sonuçlarını doğrular (Şekiller 4 ve ve5).5). Beklendiği gibi, immünoblot için bir kontrol olarak dahil edilen USA300 Δ hla mutantı alfa toksin üretmedi.

Şekil 6
Bir H. canadensis özütü, MRSA toksin üretimini inhibe eder ve insan keratinosit (HaCaT) hücrelerine zarar verir. MRSA (OD 600 = 0.1) özüt veya araç kontrolünün berberin ile normalize edilmiş konsantrasyonlarında (10, 20, 40, 60 ve 80 ug / mL) özütlenmeye maruz bırakıldı ve 11 saat süreyle inkübe edildi. Harcanan ortam toplandı ve alfa-toksin immünoblotları gerçekleştirildi ( A ). Konfluent HaCaT hücreleri katmanları oluşturuldu ve aynı ekstraktla işleme tabi tutulan örnekler, bir laktat dehidrojenaz testi ( B ) ile hasarı değerlendirmek için hücrelerle inkübe edildi . Kontroller olarak alfa toksin ( hla ) ve agrçekirdek algılayıcı mutantlar kullanıldı. % Liziz için bildirilen değerler, üçlü test kuyularının ortalamalarıdır (ortalamanın standart sapmasını temsil eden hata çubukları ile) ve p- değerleri, iki kuyruklu bir öğrenci t-testi ile hesaplanmıştır.İlişkilendirmek için H. canadensis deri enfeksiyonları için yaprak ekstresi çekirdek söndürme gözlemler, kültürlü insan keratinosit hücreleri (HaCaT) MRSA etkileşimleri değerlendirmek için bir test kullanılabilir. Agr sisteminin inhibisyonunun veya alfa toksinindeki mutasyonların, cilt apse oluşumunu azalttığı [ 5 , 28 ] emsaline dayanarak, kontroller olarak MRSA yabani tip ve mutant suşları test ettik. USA300 suşu AH1263'ten harcanan ortam veya Δ agr veya Δ hla mutasyonuna sahip türevler, HaCaT hücrelerine maruz bırakıldı ve hücre canlılığı, bir laktat dehidrojenaz (LDH) salım deneyi kullanılarak değerlendirildi (Şekil 6B). Beklendiği gibi, vahşi tip USA300 önemli hasara neden olurken (% 83 öldürme), Δ agr ve Δ hla mutantlarının HaCaT hücre bütünlüğü üzerinde neredeyse hiçbir etkisi yoktu. USA300 suşunun bir H. canadensis ekstraktına (80 µg / mL) maruz bırakılmasından sonra, HaCaT hücrelerinde USA300 hasarı belirgin bir şekilde% 38'e düştü. Bu sonuçlar, H. canadensis'in agr sisteminin inhibisyonunun, alfa toksin üretiminin azalmasına neden olduğunu ve bunun da insan derisi keratinositlerine verilen zararı azalttığını göstermektedir.

Sonuç olarak, verilerimiz, H. canadensis'in deri enfeksiyonlarını tedavi etmek için geleneksel kullanımına destek vermektedir . H. canadensis yaprak özleri, kısmen alkaloid berberine bağlı, ancak kanadin veya hidrastine bağlı olmayan doğrudan antimikrobiyal aktiviteye sahiptir. Önemlisi, antimikrobiyal aktivite, H. canadensis'in MRSA'ya karşı etki ettiği görülen birkaç mekanizmadan sadece biridir . Biz göstermektedir H. canadensis söndürmek alt inhibitör konsantrasyonlarında yaprağı özü AGRçekirdek algılama sistemi ve bu aktivitenin başlıca alkaloidler berberin, hidrastin veya kanadin nedeniyle olmadığı. Bu çekirdek söndürme etkisinin ortaya çıktığı en olası mekanizma, AgrCA iki bileşenli sistem aracılığıyla sinyal iletiminin zayıflatılmasıdır. Bu tür bir zayıflama, MRSA'ya maruz kalan H. canadensis tarafından toksin üretiminde gözlenen azalmaya neden olacaktır . Toplu olarak, sonuçlarımız, H. canadensis yaprak özlerinin, farklı mekanizmalarla MRSA'ya karşı etki eden birkaç bileşen sınıfı içerdiğini göstermektedir . Bu tür bir karışımın, patojeni çoklu yollarla hedefleme yeteneği sayesinde, MRSA enfeksiyonlarının tedavisinde veya önlenmesinde tek başına bileşenlerinden daha iyi etkinlik göstermesi beklenir. Bu tahmin gelecek ile değerlendirilebilirin vivo araştırmalar.

Referanslar: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4527992/

**mert** · 05 April 2021, 17:18

Goldenseal (Hydrastis canadensis L.) özleri, efluks pompası inhibisyonu yoluyla berberinin antibakteriyel aktivitesini sinerjik olarak arttırır.
Keivan A. Ettefagh,1 Johnna T. Burns,1 Hiyas A. Junio,1 Glenn W. Kaatz,2 and Nadja B. Cech1,*

Öz
Goldenseal (Hydrastis canadensis L.), iltihaplanma ve enfeksiyonla mücadele etmek için kullanılır. İn vitro antibakteriyel aktivitesi, en bol olanı berberin olan alkaloidlerine atfedilmiştir. Bu çalışmaların amacı, H. canadensis'in köklerinden ve havai kısımlarından hazırlanan etanolik ekstraktların bileşimini, antibakteriyel aktivitesini ve efluks pompası inhibitör aktivitesini karşılaştırmaktı. Etanolik özler, altı H. canadensis bitkisinin köklerinden ve hava kısımlarından ayrı olarak hazırlandı. Özler, LC-MS kullanılarak alkaloid konsantrasyonu açısından analiz edildi ve Staphylococcus aureus'a (NCTC 8325-4) karşı antimikrobiyal aktivite ve etidyum bromür dışa akımının inhibisyonu açısından test edildi. Havadan özüt (FIC 0.375) ve daha az ölçüde kök özütü (FIC 0.750) ve berberin arasında sinerjistik antibakteriyel aktivite gözlendi. Havadan özüt, vahşi tip S. aureus'tan etidyum bromür akışını inhibe etti, ancak bu bileşiğin norA için silinmiş bir izojenik türevden çıkarılması üzerinde hiçbir etkiye sahip değildi. Çalışmalarımız, H. canadensis'in köklerinin hava kısımlarından daha yüksek düzeyde alkaloid içerdiğini, ancak hava kısımlarının berberin ile köklerden daha önemli bir şekilde sinerji oluşturduğunu göstermektedir. Ayrıca, H. canadensis'in havai kısımlarından elde edilen özütler, dışarı akış pompası inhibitörleri içerirken, kök ekstresi için dışarı akış pompası önleyici aktivite gözlenmedi. En bol bulunan üç H. canadensis alkaloidleri, berberin, hidrastin ve kanadin, H. canadensis'in toprak üstü kısımlarından elde edilen ekstraktların dışarı akış pompası inhibe edici aktivitesinden sorumlu değildir.

Keywords: Hydrastis canadensis, Ranunculaceae, synergy, alkaloid, berberine, Staphylococcus aureus

Giriş
Çoklu ilaca dirençli bakterilerden kaynaklanan enfeksiyonlardaki artış, dünya çapında büyük bir sağlık krizi olarak kabul edilmektedir. Avrupa Antimikrobiyal Direnç Sürveyans Sistemine göre, dünya nüfusunun 52 milyonu çok ilaca dirençli bakteri taşıyabilir. Böyle bir dirençli suş olan metisiline dirençli Staphylococcus aureus'un (MRSA) sadece ABD'de 18.000'den fazla yıllık ölümden [ 1 ] sorumlu olduğu tahmin edilmektedir . Dirençli bakterilerden enfeksiyonları tedavi etmek için daha iyi yöntemlere ihtiyaç vardır. İltihaplanma ve enfeksiyonu tedavi etmek için botanik ilaçların kullanımının uzun bir geçmişi vardır. Sinerjik etkileşimlere yol açabilen bu tür müstahzarların içsel karmaşıklığının, onları farmasötik muadillerinden daha etkili hale getirebileceği sıklıkla tartışılmaktadır [ 2, 3 ]. Dahası, bu tür botanik ilaçların birden fazla farklı yoldan etki etmesi, direncin gelişmesini daha da zorlaştırabilir. Bu nedenlerden dolayı, bakteriyel enfeksiyonlarla savaşmak için botanik ilaçların kullanımına ilişkin daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Botanik tıp goldenseal ( Hydrastis canadensis L.) bu araştırmanın konusudur. Goldenseal preparatları uluslararası pazarda popülerdir [ 4 , 5 ] ve ABD'de en çok satan 20 botanik diyet takviyesi arasındadır [ 6 ]. Goldenseal'den elde edilen ham özler ve izole edilmiş bileşikler, in vitro ve klinik çalışmalarda antibakteriyel aktivite göstermiştir [ 7 - 11 ]. Goldenseal'in antibakteriyel aktivitesi tipik olarak alkaloidlere, özellikle MRSA dahil olmak üzere çeşitli Gram-pozitif bakterilere karşı aktivite gösteren berberine [ 11 , 12 ] atfedilmiştir [ 13].]. Bununla birlikte, karmaşık altınmühür preparatlarında bulunan diğer bileşiklerin berberinin antimikrobiyal aktivitesini artırabileceği yönünde bazı öneriler vardır [ 7 , 14 ]. Tek başına berberine atfedilemeyen, goldenseal'in havadan kısımlarından ekstraktların belirgin antimikrobiyal aktivitesini gözlemledik. Bu özütlerin, berberinin antimikrobiyal aktivitesini sinerjik olarak artıran efluks pompası inhibitörleri içerdiğini varsayıyoruz. Bakteriyel dışa akım pompaları, bakteriyel hücrelerden toksinleri pompalayan membrana bağlı proteinlerdir [ 15 ]. Dışa akış pompalarının aşırı ekspresyonu, S. aureus dahil olmak üzere bakterilerde direnç gelişimine katkıda bulunur [ 16]. Efluks pompalarının inhibisyonu, bu pompalar için substrat olan antimikrobiyal ajanların etkinliğini artırabilir ve antimikrobiyaller için minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) azaltabilir [ 17 ].Bu çalışmaların amaçları, (1) H. canadensis'in yer altı (kökler ve rizomlar) ve yer üstü (yapraklar ve saplar) kısımlarından hazırlanan özütlerdeki alkaloid içeriğini karşılaştırmak , (2) H. canadensis'in antibakteriyel aktivitesini değerlendirmektir. antibakteriyel madde berberin ile kombinasyon halinde özütler ve (3) H. canadensis özlerinin , başlıca kromozomal S. aureus eflux pompası norA'nın inhibitörleri olarak işlev görüp görmediğini belirlemek için . Nihayetinde amacımız, H. canadensis'te bilinen başlıca alkaloidler dışındaki sinerjistlerin mevcut olup olmadığını göstermekti.ve bitkinin hangi bölümünün bu tür sinerjistlerin daha yüksek seviyelere sahip olacağının belirlenmesi. Bu sorular, H. canadensis'ten diyet takviyelerinin üretiminde ve kalite kontrolünde önemlidir . Daha geniş olarak, bu çalışmalar, botanik ilaçların ham özlerinde sinerjik aktivitenin ileriye dönük olarak araştırılabileceği analitik bir yaklaşım gösterdiğimiz için önemlidir.

Malzemeler ve yöntemler
Hücre hatları, kimyasallar ve biyokimyasallar
Staphyloccus aureus NCTC 8325-4 [ 18 ] ve izojenik norA delesyon mutantı K1758 [ 19] kullanılmış. Müeller Hinton broth, karbonil siyanür m-kloro-fenilhidrazon (CCCP, TLC'ye göre saflık>% 98), berberin (HPLC'ye göre saflık>% 98), (1R, 9S) - (-) - β-hidrastin (saflık>% 98 HPLC) ve DMSO Sigma Aldrich'ten (Saint Louis, MO, ABD) satın alındı ve kanadin (tetrahidroberberin, HPLC ile saflık>% 98, stereokimya doğrulanmamış) Sequoia Research'ten (Pangbourne, İngiltere) alındı. Asetik asit, Fisher Chemical'dan (Pittsburgh, PA, ABD) satın alındı. Etanol (% 95), HPLC dereceli asetonitril ve HPLC dereceli metanol, Pharmaco-AAPER'den (Shelbyville, KY, ABD) elde edildi. Nanopure su, Barnstead'den (Dubuque, IA, ABD) bir nanodiamond su arıtma sistemi ile hazırlandı.

Bitki materyali
Hydrastis canadensis L. (Ranunculaceae) kendi doğal habitatında (Hendersonville, NC, N 35 ° 24.277 ′, W 082 ° 20.993 ′, 702.4 m yükseklikte bir sert ağaç ormanı) yetiştirildi ve Eylül 2008'de hasat edildi. Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Herbaryumunda (NCU583414) ve Dr. Alan S. Weakly tarafından tanımlandı. Bireysel H. canadensis bitkileri hasat edilmiş ve numaralandırılmıştır (tablo 1).

tablo 1
6 ayrı H. canadensis bitkisinin ve 2 "havuzlanmış numunenin" kök ve rizomundan veya yaprak ve gövde (havai) kısımlarından elde edilen ekstraktlardaki alkaloidlerin miktarı . Pozitif iyon modunda LC-MS ile analiz edilen her alkaloidin standartları için kalibrasyon eğrilerinden konsantrasyonlar hesaplandı. "Havuzlanmış kök" ve "havuzlanmış yaprak" özütleri, daha büyük bitki materyali yığınlarından (çok sayıda ayrı bitki dahil) hazırlanmış ve antimikrobiyal test için kullanılmıştır.

Ekstraksiyon ve LC-MS
Ekstreler (% 50 etanol:% 50 nanopure su), ABD diyet takviyeleri endüstrisindeki standart prosedürlere göre 5 mL çözücü (1: 5 w: v) başına 1 g toz yaprak ve saplar veya kökler ve rizomlar kullanılarak hazırlandı. [ 20]. Bundan sonra, kök ve köksap özütü "kök" olarak adlandırılacak ve yaprak ve gövde özütü "hava" olarak adlandırılacaktır. Bitki materyali çözücü ile karıştırıldı, 24 saat yumuşatıldı ve vakum altında süzüldü. Özler, oda sıcaklığında amber şişelerde saklandı. Biyolojik aktivite ve HPLC profili, bu saklama koşullarında> 1 yıl süreyle muhafaza edildi. Altı ayrı bitkinin toprak altı kısmının tamamı (kökler ve köksap) ve buna karşılık gelen hava kısımları (yapraklar ve gövdeler) ayrı ayrı ekstrakte edildi. Ekstreler numaralandırıldı, böylece her durumda, tek bir bitkinin kök ve topraktan ekstraktı sayısı eşleşti. Biri 100 gr kök / rizom materyali ve diğeri 100 gr hava kısımları kullanılarak iki büyük "havuzlanmış ekstrakt" da hazırlandı. Burada sunulan tüm biyoanaliz verileri, bu "havuzlanmış özler" kullanılarak toplanmıştır. Alkaloid içeriğinin analizi, ters fazlı HPLC'ye (HP1100, Agilent, Santa Clara, CA, ABD). Bir C-18 kolon (50 mm × 2,1 mm, 3 μm partikül boyutu, 110 Å gözenek boyutu, Prevail paketleme, Grace, Deerfield, IL, ABD ve 0,5 μm ön kolon filtresi, MacMod Analytical, Chadds Ford, PA, ABD) kullanıldı 0.2 mL / dak akış hızı ve 10 μL enjeksiyon hacmi kullanılarak tüm ekstraktların analizi için. Örnekler aşağıdaki gradyan kullanılarak analiz edildi, burada A = nanopure suda% 1 asetik asit ve B = HPLC dereceli asetonitril: 0 ila 5 dakika arasında% 100 -% 68 A; 5 ila 20 dakika arasında% 68 -% 0 A; 20 ile 25 dakika arasında% 0 A, 25-40 dakika arasında% 100 B.m / z . Kapiler sıcaklık 275 ° C, kılıf gaz basıncı 20 (keyfi birimler) ve sprey, kapiler ve tüp lens voltajları sırasıyla 4.5 kV, 3 V ve 60 V idi. Alkaloidler berberin, hidrastin ve kanadin standartları metanol içinde 1 mg / mL'lik stok konsantrasyonlarında hazırlandı. 0.05 ila 100 μM konsantrasyon aralığı üzerindeki kalibrasyon eğrileri, konsantrasyona karşı ilgili seçilen iyon izinin pik alanı olarak işaretlenmiştir. Kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığı içinde alkaloid konsantrasyonları sağlamak için ekstraktlar gerektiği gibi 50:50 etanol: su içinde seyreltildi. Alkaloidler, alıkonma süresi ve parçalanma kalıpları ilgili standartlar ile eşleştirilerek ekstraktlarda tanımlanmıştır.

Staphyloccus aureus NCTC 8325-4 ile Dama Tahtası Testi
Ekstraktlar nitrojen altında kurutuldu ve% 10 DMSO içeren Müeller Hinton çorbasında yeniden çözüldü ve 0.45 um PVDF filtreden süzüldü. Sıvı mikrodilüsyon MIC testleri Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) yönergelerine göre yapılmıştır [ 21 ]. Ekstraktlar berberine standardize edildi ve 5 ila 300.00 μg / mL'lik bir konsantrasyon aralığında (burada bunlar standart veya ekstraktaki berberin konsantrasyonunu temsil eder) bir dama tahtası tahliliyle [ 22 ] berberin ile kombinasyon halinde test edildi . İyi belgelenmiş antimikrobiyal aktiviteye sahip olan saflaştırılmış bir berberin standardı [ 23 - 25 ], pozitif kontrol görevi gördü. Deney 1 x 10, 96 oyuklu plakalarda üç kere gerçekleştirilmiştir 5CFU / mL S. aureus ,% 2 nihai DMSO içeriği ve 250 μL'lik son kuyu hacmi. Negatif (araç) kontrol, et suyunda% 2 DMSO'dan oluşmuştur. MIC değerleri, OD arasında anlamlı bir fark yoktu noktadan belirlendi 600 araç kontrolü ve tedavisi. Sadece özütleri veya berberini (bakteri içermeyen) içeren oyuklar için OD 600 , etkileşimi en aza indirmek için ilgili deney oyuklarından çıkarıldı. FIC endeksleri, denklem 1'e göre hesaplandı ; burada A ve B, kombinasyon halinde test edilen bileşikler (veya özler), MIC A , tek başına A'nın minimum inhibitör konsantrasyonu, MIC B tek başına B'nin minimum inhibitör konsantrasyonu olarak tanımlanır ve [B], bir A varlığında B'nin MIC'si olarak tanımlanır ve [A], B'nin varlığında A'nın MIC'si olarak tanımlanır.

Çıkış pompası deneyi
Yabani tip S. aureus ve izojenik norA delesyon mutantı (sırasıyla NCTC 8325-4 ve K1758), Müeller Hinton çorbasında OD 600 = 0.740'a büyütüldü . Sırasıyla 25 μM ve 100 μM'lik nihai konsantrasyonlara etidyum bromür ve CCCP ilave edildi ve çözelti, 20 dakika boyunca çalkalama (300 RPM) ile 20 ° C'de inkübe edildi. Bu çözelti OD 600'e seyreltildi= 0.400, 10 μg / mL etidyum bromür ve 100 μM CCCP içeren taze Müeller Hinton broth ile. Çözelti, bir Spectrafuge 24D santrifüjde (Labnet, Woodbridge NJ, ABD) 13,000 x g'de 5 dakika boyunca 20 ° C'de 1 mL alikotlar halinde döndürüldü. Süpernatan atıldı ve kırmızı topaklar buz üzerine yerleştirildi. Ölçüm sırasında, bu topaklar 5 dakika süreyle eritildi ve inhibitörlü veya inhibitörsüz% 2 DMSO içeren 1 mL taze Müeller Hinton çorbası ile yeniden süspanse edildi. Floresans ölçümleri, 300 saniye boyunca her saniye Spex FluoroMax-2 spektroflorometre (Instruments SA, Inc, Edison, NJ, ABD) kullanılarak, λ ex = 530, λ emiss = 600 ve 5 mm yarık genişlikleri kullanılarak yapıldı.

İstatistik
Ortalamaların kontrole karşı istatistiksel önemi, tek faktörlü ANOVA (Microsoft Excel sürüm 2007 ile hesaplanan) kullanılarak değerlendirildi ve p <0.05 anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar
Alkaloidler berberin, hidrastin ve kanadin (Şekil 1), standart bileşiklerle eşleşen tutma süreleri, moleküler ağırlıklar ve CID fragmantasyon modellerine dayalı olarak teyit edildiği üzere tüm ekstrelerde tespit edildi ( Şekil 2, Destekleyici Bilgiler ). Hidrastin konfigürasyonu,Şekil 1standart için rapor edilen, ancak kanadin standardının konfigürasyonu doğrulanmadı. H. canadensis'ten +/- kanadin karışımının izolasyonu daha önce bildirilmiştir [ 26 ], ancak hidrastin veya kanadinin stereoizomerlerini ayırt etmek için kullanılan LC-MS yöntemiyle mümkün olmamıştır.

Alkaloidler, yaprak özlerine göre kökte daha yüksek konsantrasyonlarda bulunmuştur (tablo 1). Bu, tek tek kök ve yaprak numunelerinin her biri için geçerliydi ve 6 kök ve 6 hava bölümü numunesi arasındaki ortalama değerler. Berberin için, kök ekstraktları ortalama 5 kat daha fazla berberin (köklerde 36,45 ± 0,47 mM'ye karşı havai kısımlarda 7,77 ± 0,10 mM, p = 0,002), 3 kat daha fazla hidrastin (köklerde 3,145 ± 0,058 mM'ye karşı 1,123 ± 0,021) içeriyordu. Havai kısımlarda mM, p = 0,002) ve havadan ekstraktlara göre 1,5 kat daha fazla kanadin (köklerde 0,069 ± 0,011 mM'ye karşı havai kısımlarda 0,045 ± 0,007, p = 0,001). Önceki raporlarla tutarlı olarak [ 27 ], berberin alkaloidlerin en bol olanıydı (ortalama% 6,12 köklerde,% 1,31 havai kısımlarda), ardından hidrastin (köklerde% 0,60, havai kısımlarda% 0,22) ve son olarak , kanadin (köklerde% 0,11, havai kısımlarda% 0,008).

0.375 FIC değeriyle gösterildiği gibi (Tablo 2) ve izobologramın dışbükey şekline göre (Figür 3), H. canadensis'in havuzlanmış bir örneğinden hazırlanan ekstrakt sinerjik olarak berberinin antimikrobiyal aktivitesini arttırdı. Kök ekstraktının bir sinerjik güçlenme önerisi de gözlemlendi (Figür 3), ancak sonuçlar sinerjiyi gösteren bir FIC <0.5'in katı kurallarına uymadı [ 28 ]. Doğrulama amacıyla berberin, kendisi ile kombinasyon halinde test edilmiştir (Figür 3) ve etki toplamadır (FIC 1.00, doğrusal izobologram). Berberin standardı ayrıca antimikrobiyal testler için pozitif kontrol görevi gördü ve literatür değerleri ile tutarlı olarak 150 µg / mL'lik bir MIC verdi [ 29 - 32 ].

Figür 3
H. canadensis özleri tarafından bakteri büyümesinin inhibe edildiğini gösteren izobologramlar ve berberin eklendi. Tek başına Berberin de doğrulama ve pozitif kontrol olarak hizmet etmek için teste dahil edildi. Ekstreler Müeller Hinton çorbasında% 2 DMSO içinde çözüldü. Deneyler 5 x 10 ile 96 oyuklu bir plaka içerisinde, üç kopya halinde gerçekleştirildi 5 CFU / ml , S. aureus .

Tablo 2
Hydrastis canadensis özlerinin MİK ve FIC endeksleri veya berberin ile kombinasyon halinde izole edilmiş alkaloidler. MIC, tek başına bileşiğin minimum inhibe edici konsantrasyonunu gösterirken, FIC ( denklem 1 ile hesaplanır ), verilen bileşik veya ekstrakt ile berberin arasındaki etkileşim derecesini gösterir.

MIC (μg / mL)FIC EndeksiBerberin1501.00Hidrastin> 3000Kanadin> 3000Kök Ekstresi1500.750Havadan Özü750.375

H. canadensis'in havuzlanmış hava kısımlarından hazırlanan ekstraktın , yabani tip S. aureus'tan (Şekil 4), ancak norA-silinmiş türevi değil (Şekil 5). Yabani tip S. aureus için , 3 dakika sonra etidum bromür floresan yüzdesi, tek başına et suyundaki bakteriler için ilk okuma ile karşılaştırıldığında, kök ekstresi (50 μg / mL) için% 66,7 ±% 5,5, kök ekstresi için% 79,2 ±% 1,2 idi. hava özütü (50 μg / mL) ve pozitif kontrol için% 84,73 ±% 1,29 (20 μg / mL'de CCCP). CCCP ve hava özütü için sonuçlar, sırasıyla 0.002 ve 0.02 p değerleri ile negatif kontrolden (% 2 DMSO ile Müeller Hinton çorbasında etidyum bromür yüklü bakteriler) önemli ölçüde farklıydı. 3 dakika sonra kök ekstresi ile negatif kontrol arasında floresan yüzdesi açısından önemli bir fark yoktu. İçin Nora -silinmesi , S. aureus3 dakika sonra ( H. canadensis hava özütü, H. canadensis kökü özütü veya CCCP) işlemlerin hiçbirinde etidyum bromür akışının önemli bir inhibisyonu gözlenmedi.Şekil 5).

Şekil 4
S. aureus (NCTC 8325-4) için etidyum bromür yüklü ve çeşitli ekstraktlar ve kontrollerle işlenmiş zaman içinde floresan yüzdesi . Tedaviler, bilinen efluks pompası inhibitörü CCCP'yi (pozitif kontrol) ve H. canadensis'in köklerinden ve hava kısımlarından ekstraktları içeriyordu . Tüm ekstreler ve CCCP,% 2 DMSO içeren Müeller Hinton çorbasında çözüldü. Veri noktaları, üç ayrı deneyin ortalamasını temsil eder (3 farklı S. aureus peleti kullanılarak ). Hata çubukları, +/− standart hatadır.

Şekil 5
Zaman içinde yüzde floresan Nora -silinmesi S. aureus (K1758). Farklı bir bakteri türünün kullanımının yanı sıra, koşullar için kullanılanlarla aynıydı

Tartışma
Altınmühür kökleri (havai kısımlardan ziyade) daha yüksek alkaloid içerikleri nedeniyle tıbbi olarak daha sık kullanılmaktadır [ 27 ]. Sonuçlarımız, kök özütlerinde daha yüksek alkaloid içeriği gösterir, ancak özütler berberin içeriğine göre standardize edildiğinde, bitkilerin hava kısımlarından elde edilen özütlerin, berberinin antimikrobiyal aktivitesini sinerji oluşturduğunu gösteriyoruz (Figür 3). Bu bulgu, H. canadensis hava kısımlarından elde edilen ekstredeki berberin dışındaki bazı bileşen (ler) in, berberinin antimikrobiyal aktivitesini sinerjik olarak arttırdığını göstermektedir. Bu sinerjik artış, yaprak özlerindeki hidrastin veya kanadin nedeniyle değildir. Bu bileşiklerin saflaştırılmış standartları, önemli bir antimikrobiyal aktivite sergilememiştir (MIC değerleri> 300 μg / mL,Tablo 2) ve berberinin antimikrobiyal aktivitesini artırmadı (FIC = 0, Tablo 2). Berberin içeren bitkilerde [ 33 ] efluks pompası inhibitörlerinin varlığını bildiren literatüre dayanarak, H. canadensis'in hava kısımlarının ekstraktlarında bulunan sinerjistlerin , ana kromozomal efluks pompası norA eflux pompasının inhibitörleri olarak hareket edebileceğini varsaydık. S. aureus tarafından ifade edilmiştir . Nitekim verilerimiz (Rakamlar(Şekiller44 ve ve5)5) H. canadensis'in hava kısımlarından elde edilen özütlerin norA dışarı akma pompası inhibitörleri içermediğini göstermektedir . Etidyum bromür, norA'nın bilinen bir substratıdır ve bakteri hücrelerinin içindeyken güçlü bir şekilde (DNA ile interkalasyona bağlı olarak) floresan olur [ 33 ]. Etidyum bromür dışa akış testi ile hücreler, etidyum bromür ile yüklenir ve zaman içinde floresan izlenir. Floresanstaki bir azalma, hücrelerden etidyum bromürün dışarı aktığını gösterir ve bir efluks pompası inhibitörü varlığında, floresan daha yavaş azalmalıdır. Bu etki, bilinen bir dışa akma pompası inhibitörü olan CCCP ile ve H. canadensis'in (Şekil 4). CCCP ve H. canadensis özütlerinin varlığında yabani tip S. aureus'un değişen davranışından norA'nın inhibisyonu sorumluysa , norA ile silinmiş bir suşla hiçbir etki gözlenmemelidir . Aslında durum buydu (Şekil 5). Gözlenen akış pompası inhibitör aktivitesi, daha yüksek alkaloid konsantrasyonuna sahip olan kök ekstraktının testte aktivite göstermemesiyle kanıtlandığı gibi berberin, hidrastin veya kanadinin varlığından kaynaklanmadı (Şekil 4). Bunu doğrulamak için, alkaloidlerin her biri ayrı ayrı test edildi ve etidyum bromür akışında önemli bir inhibisyon göstermedi ( Şekil 6, Ek Bilgi ). Botanik diyet takviyelerinin kullanımının savunucuları, çoğu zaman, karmaşıklıklarının, birden çok bileşen arasındaki sinerjik etkileşimler nedeniyle artırılmış etkinliğe yol açtığını savunurlar. Burada Hydrastis canadensis'in havadan kısımlarından elde edilen özlerin hem bilinen antimikrobiyal madde berberini hem de berberinin antimikrobiyal aktivitesini sinerjik olarak artıran diğer bileşikleri (şimdiye kadar tanımlanmamış) içerdiğini gösteriyoruz. Ayrıca, antimikrobiyal aktivitenin bu artışının norA dışarı akış pompasının inhibisyonu yoluyla meydana gelebileceğini de gösteriyoruz . Bu bulgu, Hydrastis canadensis'indoğal habitatının çoğunda CITES tarafından tehlike altında olarak listelenmiştir. Sonuçlarımız, bu bitkinin sürdürülebilir bir şekilde hasat edilebilen hava kısımlarının iyi bir antibakteriyel bileşik kaynağı olduğunu göstermektedir. Ayrıca, berberinin, bitkinin hava kısımlarının karmaşık fitokimyasal matrisinde kök kısımlarına göre daha düşük dozajlarda in vitro olarak etkili olduğunu da gösteriyoruz . H. canadensis'in havadan kısımlarına karşı köklerden hazırlanan özütlerin toksisitesini değerlendirmek ve in vivo antibakteriyel aktivitesini test etmek için takip çalışmaları garanti edilir.

Teşekkürler
Bu yayın, Ulusal Sağlık Enstitülerinin (NIH) bir bileşeni olan Ulusal Tamamlayıcı ve Alternatif Tıp Merkezi'nden (NCCAM) Hibe Numarası 1 R15 AT005005-01 ile mümkün olmuştur. Bu çalışma için altınmühür bitki materyali sağladığı için William Burch'a ve yararlı tavsiyeler için Dr. Robert Cannon, Dr. Joseph Falkinham ve Dr. Nicholas Oberlies'e teşekkür ederiz.

Referanslar: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3100400/

***maturidi*** · 15 April 2021, 20:02

Altın mühür kökünün faydaları nelerdir?

Bu küçük bitki güçlü görünmeyebilir, ancak sinüs hastalıklarının tedavisi, bağırsak düzensizliği, mide bulantısı, cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar, iltihaplanma, alerjiler ve ateş yüksekliği de dahil olmak üzere birçok sağlık yararı vardır. Altın Mühür Nedir?

Bu uzun ömürlü ot, bilimsel olarak Hydrastis canadensis olarak bilinir ve düğün çiçeği ailesine aittir. Kanada’da ve Amerika’nın doğusundaki bölgelerde bulunur ancak aynı zamanda Avrupa’nın bazı bölgelerine de yayılmıştır. Sıklıkla pürüzlü yaprakları ve sarı kökü ile bilinen bu bitki, binlerce yıldır halk arasındaki geleneksel tıbbın önemli bir parçası olmuştur. Ot, ekşi tadı ile bilinir, ancak pek çok kişi tarafından “süper bitki” olarak kabul edilir ve toz haline getirilmiş kökü lezzetlidir. Amerikan yerlileri hem kültürel olarak hem de şifa bulmak için altın mühür kökü kullandı ve ayrıca yapraklarını ve çiçeklerini de kullanmıştır. Modern araştırmalar, vücudun işlevini doğrudan etkileyen ve birçok alkaloid içeren zengin kimyasal bileşimi göz önüne alındığında, bu bitkinin birçok hastalık için kullanılmasını mantıklı bulmuştur.

Çok amaçlı bir yardımcı olarak, tablet, tentür şeklinde ve çay olarak birçok farklı biçimde kullanabilirsiniz. Bitkisel veya doğal tıbbın tüm önerilerini dikkate almanız önemlidir. Çoğu tedavi için sadece az miktarda toz veya konsantre altın mühür kökü gereklidir ve aşırı kullanım sinir sistemini olumsuz şekilde etkiler, hatta havale veya nöbete neden olabilir. Bağırsak Düzensizliğinin İyileşmesine Yardım Eder

Altın mühür ihtiva eden en yaygın ilaçlar bağırsak ve gastrointestinal sistemler için kullanılmaktadır. Ülserden veya bağırsak düzensizliğinden şikayetçiyseniz, bu otun antienflamatuvar kapasitesi, sindirim sistemini tekrar yoluna sokmanıza yardımcı olabilir. Ülser, kabızlık, şişkinlik ve kramplar rahatsız edici olmakla kalmıyor, aynı zamanda ciddi sağlık koşullarına neden olabilir. Ancak altın mühür, bağırsağınızın sağlıklı ve güçlü olmasına yardımcı olabilir. Sinüs Sıkıntılarını Azaltır

Toz haline getirilmiş kök kısmı geleneksel olarak enfiye şeklinde kullanıldığında, sinüs boşluklarındaki iltihaplanmayı ve enfeksiyonu azaltmak için yararlıdır. Altın mühür kökünün güçlü antimikrobiyal özellikleri, sinüs sorunlarının hızla hafifletilmesine ve devam eden sağlık sorunlarının önlenmesine yardımcı olmuştur. Artık enfiye şeklinde değil de kapsül şeklinde kullanılmaktadır. Antienflamatuvar Özellikler Barındırır

Bölgesel olarak iltihaplanma sorununuz varsa veya eklem ağrısından şikayetçiyseniz, altın mühür kökünü suyla kıvamlandırarak bir macun haline getirip, topikal olarak etkilenen bölgeye sürebilirsiniz. Hızlı ve etkili bir çözüm olabilir. Bu tozun küçük bir miktarı bile, tek ihtiyacınız olan doğal tedavi yöntemidir. Kapsül ve takviyeler, kan basıncını düşürmek ve bağırsak hareketini rahatlatmak da dahil olmak üzere, içten iltihaplanmaya yardımcı olabilir. Cilt Bakımına Destek Verir

Altın mühürün antimikrobiyal ve antioksidan özellikleri sedef hastalığı, egzama, akne veya kuru cilt gibi cilt sorunlarından şikayetçi kişiler için çok etkili olmasını sağlar. Cilt enfeksiyonları, bakteriyel, viral ve fungal olmak üzere birçok şekil ve boyutta oluşabilir, ancak bölgesel olarak merhem şeklinde veya tentür kullanarak, bu sorunları çabucak yok edebilir ve enfeksiyonu etkisiz hale getirebilirsiniz. Antiviral Aktiviteler Sergiler

Zayıf bir bağışıklık sisteminden şikayetçiyseniz, günlük ya da haftalık sağlık rutininize altın mühür eklemek, bağışıklığınızı artırabilir ve solunum ve bağırsak sisteminizi temiz tutabilir. Prostat ve vajinal enfeksiyonlar tedavi etmek özellikle zor ve ağrılı olabilir, ayrıca gonore gibi cinsel yolla bulaşan enfeksiyonları tedavi etmek için uzun zamandır kullanılmaktadır. Parazit Sorunlarını Gidermektedir

Bağırsak parazitleri, temiz suya erişimin kolay olmadığı yerlerde büyük bir tehdit unsurudur; altın mühür otunun antihelmintik özellikleri, bağırsak parazitlerini açlıktan ölmeye zorlar ve normal yollarla sistemden geçirerek de öldürebilir. Ayrıca müshil olarak da işlev görür ve bu kurtulmayı daha da kolaylaştırır. İştahınızı Artırır

İştahınızın artırması, aynı zamanda metabolizmanızda da bir artış olacak demektir, vücudunuz daha hızlı kalori yakmaya başlar. Ayrıca, bir hastalık, yaralanma veya travmanın ardından kişinin iştahı sıklıkla kesilebilir. Altın mühür nesiller boyunca iştahı artırmak için kullanılmıştır. Alerjiyi Önler

Yoğun alerjik reaksiyonlardan şikayetçi olanlar ya da bahar geldiğinde kolayca hapşıran kişiler, altın mühürün anti-alerjik özelliklerinden fayda görebilirler. Mukus zarlarının iltihaplanmasını azaltabilir ve sinir sistemini yatıştırarak şiddetli alerjik reaksiyonları önleyebilir. Ateş Yüksekliğini Düşürür

Ateşinizin yükselmesi, vücudunuzun bir enfeksiyonla mücadele ettiğini gösterir, ancak devam eden ateş yükselmesi sizi halsizleştirebilir, aşırı susuzluğa neden olabilir ve aşırı durumlarda beynin zarar görmesine neden olabilir. Altın mühür uzun süreli hastalık sırasında ateşi etkili bir şekilde düşürebilir ve vücudun zorlanmasını azaltabilir. Detoks Edici Etkileri Vardır

Pek çok durumda altın mühür otu, müshil olarak davranmakla kalmaz aynı zamanda hepatik bir maddedir; bu da kanı temizlemeye ve vücudu zehirden arındırmaya yardımcı olduğu anlamına gelir. Karaciğer ve böbrek, isan sağlığı için büyük bir önem taşır ve bu organların işlerini biraz daha kolaylaştırmak için kullanılır. Altın mühürün hepatik yapısı dolaşıma yardımcı olabilir ve kan yoluyla bulaşan kronik hastalıklara yakalanma riskini azaltabilir. Dozaj ve Yan Etkileri Nelerdir?

Saf formda altın mühür tozu çok güçlüdür ve çok küçük miktarlarda kullanıldığında da etkili olacaktır. Fazla kullanımı, sinir sistemi sorunları, havale, nöbet ve zihinsel sorunlara neden olabilir. Her zaman doktorunuza veya bir bitki uzmanının kullanım talimatlarına uyun ve sağlık rejimine yeni, güçlü bitkisel ilaçlar eklemeden önce bir hekime danışın.

***maturidi*** · 15 April 2021, 20:07

Altın mühür kökü Nedir?
Yaygın İsimler: goldenseal, sarı kök
Latin isim: Hydrastis canadensis

Altın mühür otu, Kuzey Amerika’ya özgü bir bitkidir. Aşırı hasat ve habitat kaybı altın mühür mevcudiyetini azaltmıştır ancak bitki şimdi Amerika Birleşik Devletleri’nde, özellikle Blue Ridge Dağları’nda ticari olarak yetiştirilmektedir.
Tarihsel olarak, Yerli Amerikalılar cilt hastalıkları, ülserler, ateşler ve diğer durumlar için altın sarmal kullandılar. Avrupalı yerleşimciler, onu çeşitli koşullar için kullanan bir tıbbi bitki olarak kabul ettiler.
Şu anda, altın mühür köküsoğuk algınlığı ve diğer solunum yolu enfeksiyonları, alerjik rinit (saman nezlesi), ülserler ve ishal ve kabızlık gibi sindirim rahatsızlıkları için bir besin takviyesi olarak kullanılmaktadır. Ayrıca ağrılı diş etleri için bir gargara ve göz iltihabı için bir göz yıkama olarak kullanılır ve döküntüler ve diğer cilt problemleri için cilde uygulanır.
Altın mühür otunun kökleri kurutulur ve çaylar, özler, tabletler veya kapsüller yapmak için kullanılır. Altın mühür genellikle ticari ürünlerde ekinezya ile birleştirilir.

Altın mühür kökü Hakkında Ne Biliyoruz?

Altın mühür otunda bulunan bir madde olan berberin; kalp yetmezliği, ishal, enfeksiyonlar ve diğer sağlık durumları için incelenmiştir. Bununla birlikte, insanlar ağızdan (oral) aldıklarında, çok az berberin vücut tarafından emilebilir veya kan dolaşımına girebilir. Bu nedenle berberin ile ilgili çalışma sonuçları altın mühür için geçerli olmayabilir.
Tamamlayıcı ve Bütünleştirici Sağlık Ulusal Merkezi (NCCIH), altın mühürün otunun bakterilere karşı nasıl hareket edebileceğini araştırmak ve insan çalışmalarında kullanılmak üzere araştırma sınıfı geliştirmek için araştırmaya fon sağlamaktadır.

Özet
Kullandığınız tamamlayıcı veya alternatif sağlık yaklaşımlarını tüm sağlık uzmanlarınıza bildirmelisiniz. Onlara sağlığınızı yönetmek için ne yaptığınızı tam olarak açıklamalısınız. Bu durum koordineli ve güvenli bakım sağlanmasına yardımcı olacaktır.
Medlineplu
Referanslar

Goldenseal. Doğal İlaçlar Web sitesi. 16 Nisan 2015 tarihinde naturalmedicines.therapeutresearch.com/ adresinden erişildi. [Veritabanı aboneliği].
Gurley BJ, Fifer EK, Gardner Z. Farmakokinetik bitki-ilaç etkileşimleri (bölüm 2): popüler botanik diyet takviyelerini içeren ilaç etkileşimleri ve bunların klinik önemi . Planta Medica. 2012; (13) 78: 1490-1514.
McKenna DJ, Plotnikoff GA. Goldenseal. In: Coates PM, Betz JM, Blackman MR ve diğerleri, eds. Diyet Takviyeleri Ansiklopedisi. 2. baskı. New York, NY: Informa Healthcare; 2010: 379-390.

**nguven** · 22 April 2021, 08:37

LYME HASTALIĞI NEDİR? LYME HASTALIĞI NASIL TEDAVİ EDİLİR? LYME HASTALIĞI BELİRTİLERİ NELEDİR?

Lyme hastalığı Borrelia burgdorferi adlı spiroketin yol açtığı, kenelerle geçen, multisistemik tutulumları olan bir zoonozdur. Lyme hastalığı 1972-1977 yılları arasında ABD'de Connecticut eyaleti Lyme kasabasında çocuklar arasında daha önce juvenil romatoid artrit (JRA) olarak düşünülen epidemi şeklinde gözlenmiş ve olgular Lyme artriti olarak adlandırılmıştır. Vakaların kırsal bölgelerde yoğunlaşması, hastalığın özelliği olarak E. migrans saptanması bir arthropod tarafından taşındığını göstermiştir. Daha sonra hastalığın multisistemik olduğu ve özellikle deri, santral sinir sistemi, kalp ve eklemleri etkilediği görülmüştür. E.migransli hastalarda yapılan çalışmalarda bazı ixodes türü kenelerin hastalığın vektörleri oldukları saptanmıştır. Hastalık daha önceden Avrupada kısmen tanımlanmış ve erythema chronicum migrans, Bannwarth sendromu ve acrodermatitis chronica atrophicans gibi isimler verilmiştir. 1982'de Burgdorfer ve Barbour I. dammini kenelerinde şimdi B.burgdorferi olarak isimlendirilmiş olan spiroketi izole etmişlerdir. Bölgesel varyasyonlar olmakla birlikte tüm dünyada hastalık kabaca birbirine benzer. Klinik olarak multisistemik tutulumu, evreler halinde görülmesi ve diğer hastalıkları taklit etmesi nedeni ile sifilize benzer. Insidansının artması ve gittikçe yayılmasından dolayı Lyme hastalığı önemlidir. Tanımlanmasından sonra 20 yıl geçmesine rağmen Lyme hastalığının tanısında, tedavisinde kullanılacak ilaçlar ve tedavi süresi açısından cevaplanmamış sorular vardır.

B.burgdorferi, Spirochaetales takımı, Spirocethaetaceae familyasının Borrelia genusuna aittir. Gram negatif, hareketli, flagellalı, 0.2 um kalınlığında, 20- 30 um uzunluğundadır. Karanlık alan ve faz kontrast mikroskoplarla görülebilir. En içte protoplazmik silindir, bunu saran hücre membrani ve 7-11 arasında değişen flagellası, en dışta da plazmidlerce kodlanan dış memrandan ibarettir.

Borrelia türleri nazlı (12-24 saatte) üreyen ve mikroaerofilik ve Barbour-Stoenner-Kelly besiyerinde 33.C'de üretilebilen narin bir bakteridir. Birçok bakteri ile karşılaştırıldığında borrelia daha yavaş ürer. Kültürde genellikle 10-15 pasajdan sonra patojenitesini yitirir ve bu zamandan sonra artık enfeksiyöz değildir.

Borrelia burgdorferi çeşitli molekül ağırlıkları ile belirlenen membran lipoproteinlerine sahiptir. Bu proteinler, sirküler ekstrakromozomal ve lineer tipte plazmidlerce kodlanmaktadır. 4 değişik özgül dış yüzey lipoproteinleri (A, B, C, D, E, F), 41 KD flagellar antijen, 60, 66,ve 73 KD isi şok proteinleri ve protoplazmik silindiri içermektedir. Endotoxine benzer özellikleri olan lipopolisakkarite benzer materyal mevcuttur.

Tüm B. Burgdorferi izolatlarında 4-9 arasında ekstrakromozomal plazmid DNA'. vardır. Bunlar süperkoiled özelliği olan plazmidler ve diğer prokaryotik organizmalarda bulunmayan lineer plazmidleri içerirler.

3 genotipe sahiptir. Bunlar Bb. sensu stricto, B. garinii ve B.afzelii olarak adlandırılır. Bb sensu stricto Kuzey Amerika ve kısmen Avrupada , B. garinii ve B. afzelii Avrupa ve Asya'da görülür. Bu üç tip Bb sensu lato'yu oluştururlar. Lyme hasta infeksiyona yol açan türlerle ilişkilidir. Avrupa ve ABD'deki Lyme hastalığı kliniğindeki farklar patojendeki farka ve infekte olan popülasyonun genetik özelliklerine bağlıdır. Bb sensu stricto siklıkla artrit, B. garinii nöroborelyoz, B. afzelii artrit ve deri lezyonları ile karakterli gibi görünmektedir. Tanımlanan türlere uymayan izolatlar da görülmektedir. B. lonestari olarak isimlendirilen yeni bir tür Amblyomma americanum kenelerinde moleküler tekniklerle saptanmıştır. İnsanlarda bu atipik türler saptanmamıştır.

EPİDEMİYOLOJİ

Lyme Hastalığı, Kuzey Amerikada bildirilen vektörlere bağlı hastalıkların %90'ını oluşturur. ABD'de 1982-1996 yılları arasında bildirilen vaka sayısı 32 kat artmıştır. ABD'de ilk vakalar 25 yıl önce Cape Cod ve Connecticutta bildirilmiştir. Kuzeydoğu ve batı ABD'de I.scapularis, batı ABD'de I. pacificus, Kanadanın bazı bölgelerinde I. scapularis bulunur. Avrupada da Lyme hastalığı bildirilmiştir. Özellikle Almanya, Avusturya, İsviçre, Fransa, İsveç ve Rusya da I.ricinus ve I. persulgatus vektör olarak bildirilmiştir. Japonya, Kore ve Çinde de görülür. Vektör olarak 1. persulgatus bildirilmiştir. Avusturalyadaki vektör bilinmemektedir. Yurdumuzda yapılan çalışmalarda I. ricinus türü kenelerin varlığı gösterilmiştir. İspanya'da yapılan bir çalışmada %7 seropozitiflik saptanmış ve bunların muhtemelen %2’inde Lyme hastalığı mevcutmuş. İsveç'te %10 seropozitiflik saptanmış. Kayseri'de seropozitiflik %10, Yüksek riskli bölgelerde %26 (%4.6’ında klinik olarak Lyme hastalığı mevcut.), %44- %33 oranında seropozitiflik saptanmış.Kliniğimizde yapılmış bir çalışmada Lyme şüphesi olan hastalarda %13, riskli bölgelerde %6, sağlıklılarda ise %4 oranında seropozitiflik saptanmış.

Avrupadaki Lyme hastalığı ABD'deki Lyme hastalığından nörolojik hastalığın prevalansının fazla olması ve artritin daha az oranda görülmesi ile ayrılır. Bu farklar infekte eden organizmanın türündeki değişikliklere bağlıdır.

Tüm yaş grupları ve her iki cinsiyette infeksiyona duyarlıdır.

VEKTÖR VE KONAKÇILARI

Lyme hastalığının spiroketi Bb I. ricinus kompleksinin bir parçası olan ixodes keneleri ile taşınırlar. Bunlar I. scapularis, I. pacificus, I. ricinus ve I. persulgatusu içerirler. Bb kenelerin diğer türlerinden, sivrisineklerden ve geyik sineklerinden izole edilmiştir. Spiroketi insana bulaştırmada I. ricinus kompleksinin keneleri önemli görünmektedir. Keneler yaşam siklusunu tamamlamak için 2 yıla ihtiyaç duyarlar. Bu süre boyunca 3 dönem geçirirler. Erişkin, larva ve nimf . Sonbaharın son dönemleri ve ilkbaharın ilk dönemlerinde erişkin keneler büyük hayvanların özellikle beyaz kuyruklu geyiklerin üzerinde beslenir ve çiftleşirler. Dişi keneler yumurtalarını toprağın üzerine yayarlar ve yazın yumurtadan çıkarak larvaya dönüşürler. Kenelerin larva ve nimf formları için beyaz ayaklı fareler en fazla tercih edilen konakçılardır. Fare Bb ile infekte olunca hayat boyu infekte kalabilir. Böyle infekte fare üzerinde beslenen immatür keneler Lyme hastalığının potansiyel vektörleri haline gelebilirler. Tipik olarak larva formundaki keneler yazın geç dönemlerinde kan emerler ve nymphlere dönüştükleri ilkbahara kadar inaktiflerdir. İlkbahar ve yazları beslenen nimfler genelde Lyme hastalığının insanlara bulaştırılmasında önemli bir ajandır. Erişkin keneler de sonbaharın geç dönemleri ve ilkbaharın erken dönemlerinde hastalığı bulaştırabilirler. Nimfler sonbaharda erişkin kenelere dönüştüklerinde 2 yıllık hayat siklusu tamamlanır. Nimfler infeksiyonun insanlara geçişinde önemlidir ve ilkbaharın geç dönemlerinde veya yazın beslendiğinden insanların çoğunda hastalık mayıstan ağustos ayına kadar olan dönemde başlar. Vektörle temas tipik olarak nimfler için ideal bir ortam olan yapraklarla kaplanmış nemli alanlarda gerçekleşir. Lyme hastalığının insandan insana veya kontamine kan ürünleri ile geçişi mümkün olmasına rağmen hastalığın bu yollardan geçişi ile ilgili vakalar bildirilmemiştir.

Bb infekte ixodeslerin tükrüğünde saptanmış ve insanlara direkt olarak isırıkla geçtiği gösterilmiştir. Deneysel çalışmalarda kenelerin spiroketleri etkili bir şekilde geçirebilmesi için en az 24 saat boyunca yapışması gerektiği gösterilmiştir. 24 saat sonra infekte kenelerin yarısı, 4 gün sonra hemen hepsi borreliayı geçirirler. Eğer geyikler saptanan fokustan alınırlarsa keneler diğer vektörlere adapte olabilirler.

Keneler en az 30 çeşit vahşi hayvanda ve 48 kuş türünde saptanmıştır. Bb endemik alanlarda geniş çapta bulunmasına rağmen vahşi hayvanlarda hastalığa yol açtığı gösterilememiştir. Buna ters şekilde lyme hastalığı köpek, at ve sığırları içeren evcil hayvanlarda gösterilmiştir.

PATOGENEZ

Kene tarafından Bb enjekte edildikten sonra lokal olarak deride E.migrans oluşur ve kan veya lenfle herhangi bir bölgeye yayılabilir. Hastalığın erken dönemlerinde E.migrans deri lezyonlarından, kan ve BOS' dan izole edilmiştir ve myokard, retina, kas, kemik, dalak, karaciğer, meninksler ve beyinde de az sayıda saptanmıştır. İnvitro olarak virulan Bb suşlarının fagositik hücrelerle elimine edilemediği gösterilmiştir. Çok çeşitli tipte memeli hücresine yapışabilir. TNF-alfa, IL-1b'ı indükler.

Lyme hastalığında immun cevap başlangıçta suprese olur. Bu da spiroketin yayılmasında önemli olabilir. Haftalar içinde periferik kan MNL Bb antijenleri veya mitojenlerine karşı aşırı cevap gösterirler. Spesifik lg M cevabı 3. veya 6. haftalarda peak

yapar ve sıklıkla poliklonal B hücre aktivasyonu ile ilgilidir. Total serum Ig M düzeyleri, sirküle immün kompleksler, kriyoglobulinler artar. Spesifik lg G cevabı aylar sonra yavaş yavaş artar.

Histolojik olarak tüm etkilenen dokularda lenfosit ve plazma hücreleri infiltrasyonu vardır. Bb eklemlerde, santral sinir sisteminde, deride belli odaklarda bulunabilir. Bu bölgelerde nasıl sekestre olduğu bilinmemektedir.

KLİNİK BELİRTİLER

Lyme hastalığının kuluçka süresi 1-36 gündür ortalama 7-10 gün) genelikle sifilizdeki gibi evreler halindedir ve her evrede değişik klinik belirtiler görülür.Erken ve geç olarak da ikiye ayrılmıştır.Erken infeksiyon (evre 1, lokalize E.migrans); bunu günler, haftalar sonra evre 2 ( dissemine infeksiyon); bir yıl veya daha sonra geç infeksiyon (evre 3, persistan infeksiyon ) izler. Hastalar bu evrelerin birini veya tümünü geçirebilirler ve hastalık evre 2 veya 3'e kadar semptomatik olmayabilir.

ERKEN İNFEKSİYON (EVRE 1-LOKALİZE ERİTEMA MİGRANS)

Kene tarafından enjekte edildikten ortalama 10 gün sonra Bb hastaların %60-80’inde deride lokal olarak yayılır ve E, migrans ortaya çıkar. E. migrans santral makül veya papül şeklinde başlar. Birkaç milimetrelik eritem, hiperpigmentasyon, pullanma günler, haftalar

-10 cm'e kadar ulaşabilir. EM lezyonlari tipik olarak düz, yuvarlak veya oval, parlak kırmızı ve keskin kenarlıdır. Klasik boğa gözü lezyonu %30 vakada mevcuttur. En sık uyluk, axilla, kasıklar gibi kene isırığının çok görüldüğü yerlerdedir. Tedavi edilmemiş hastalarda lezyonlar 3-4 hafta içinde kendiliğinden kaybolur. Hastalarda halsizlik, yorgunluk, baş ağrısı, myalji, artralji, bölgesel/jeneralize LAP gibi nonspesifik ve viral hastalığa benzer semptomlar gözlenebilir.

ERKEN İNFEKSİYON (EVRE 2-DÍSSEMİNE İNFEKSİYON)

Inokülasyondan sonra günler, haftalar içinde Bb hastanın kan veya lenfi ile birçok bölgeye yayılabilir. Bu dönemde spiroket kandan birçok kez izole edilmiş ve myokard, retina, kas, kemik, sinoviyum, dalak, karaciğer, meninks ve beyinde de az sayıda saptanmıştır.

Dissemine infeksiyon asıl olarak sinir sistemi, iskelet-kas sistemi ve kardiak semptom ve bulgulara yol açar. Şiddetli baş ağrısı ve hafif bir ense sertliği sıktır fakat tipik olarak yalnızca saatlerce süren kısa ataklar şeklinde görülür. Semptomların ilk gününde BOS genellikle normaldir. İskelet, kas ağrıları genellikle eklemler, bursa, tendon, kaslar ve kemiklerde ve migratuardır ve bir lokalizasyonda saatler veya günlerce sürer. Bu evrede hastalar aşırı halsiz ve yorgundur ve bunlar asıl semptomlar olabilir. Yorgunluk haricindeki semptomlar intermittan ve değişkendir. ABD'de Avrupa'dan daha fazla dissemine hematojen infeksiyon görülür. Bu dönemde hastaların mononükleer hücrelerinin Bb antijen ve mitojenlerine karşı cevapları artar. Supresör hücre ve natural killer hücre aktivitesi azalır. Spiroketin 41 kd flagellar antijenine karşı oluşan spesifik lg M cevabı 3. ve 6. haftada peak yapar fakat devam edebilir. Yavaş yavaş spesifik Ig G cevabı gelişir. PMNL ve monositler spiroketi fagosite eder ve öldürürler. Histolojik olarak tüm etkilenen dokularda lenfosit ve bol miktarda plazma hücre infiltrasyonu vardır.

Hastalığın başlangıcından sonra haftalar içinde tedavi edilmemiş hastaların 10'unda kardiyak tutulum görülür. En sık görülen anormallik değişik derecelerde atrioventriküler bloktur. Fakat bazı hastalarda akut myoperikardit, hafif derecede sol ventriküler yetmezlik, nadiren kardiyomegali veya fatal pankardit görülebilir. Tam kalp bloğu nadiren bir haftadan uzun sürer ve sürekli pacemaker yerleştirilmesine gerek yoktur

Birkaç hafta veya ay sonra hastalık lokalize kalmaya başladıkça tedavi edilmemiş hastaların %10-12’inde nörolojik tutulum görülür. Birçok anormallik görülebileceği gibi menenjitle birlikte kranial ve periferik nöropati görülmesi sıktır. Ensefalik belirtiler olduğunda somnolans, hafızada zayıflama ve ruhsal durumda değişiklikler görülür. Avrupa'da görülen ilk nörolojik belirti karakteristik bir radiküler ağrıdır. Bunu BOS’da pleositoz izler Meningeal bulgular yoktur.

Lyme menenjiti Bb’nin SSS'ne direkt invazyonu sonucu ortaya çıkar. Aseptik menenjitlerde olduğu gibi ateş, intermittant başağrısı, fotofobi ve menenjismus ile karakterizedir.Menenjitli hastalarda BOS'da lenfositik pleositoz vardır. Hücre sayısı 100/mm3, protein artmış, glukoz ise normaldir. Spiroket BOS'da birkaç kez üretilmiştir. Mononükleer hücreler burada konsantredir, intratekal olarak spesifik lg 6, M, A oligoklonal bantlar saptanabilir. Bb'e karşı reaktivasyona ek olarak BOS'daki T hücre klonları myelin basic protein, periferal myelin, kardiyolipin ve galaktoserebrosidi içeren otoantijenlerle reaksiyona girerler.

Fasial palsi en sık görülen kranial nöropatidir ve belki de tek nörolojik anormalliktir.

al nevrit genellikle ekstremiteler veya gövdede asimetrik motor, duyusal ve karışık radikülonöropati ile karakterlidir.Bb'e karşı oluşan IgM antikorlarının normal insan aksonuna bağlandığı gösterilmiştir. Bu da spiroketal ve host proteinleri arasındaki moleküler benzerliğin periferik sinir lezyonlarında bir rolü olabileceğini göstermektedir. Evre 2 nörolojik anormallikler genellikle haftalar veya aylarca sürebilir fakat tekrar edebilir veya kronikleşebilir.

Hastalığın başlangıçından 6 ay sonra (2 hf-2 yıl) intermittan artralji veya migratuar iskelet kas ağrılarından sonra tedavi edilmemiş hastaların %50'inde özellikle diz gibi büyük eklemleri etkileyen asimetrik oligoartiküler artrit artralji „ellerde sertlik ve sırt ağrıları görülebilir. Eklem sıvısında lökosit sayısı 500-110000/mm3 ve PMNL hakimiyeti vardır. Total granülosit sayısı ile ilişkili olan immun kompleksler de mevcuttur.

Erken evrede rastlanılan diğer sistemlere ait bulgular nadirdir. Ancak hekimler tarafından akla. getirilmediklerinden kolayca atlanabilmektedir. Rekürren hepatit, myozit, osteomyelit, pannikülit, kojunktivit, keratit, irit, üveit, optik nörit, optik atrofi, papil ödemi , panoftalmit, eksudatif retinal ayrılma ile birlikte koroidit, vitrit, mikrohematüri, proteinuri, adult respiratuar distres sendromunun görüldüğü vakalar bildirilmiştir. Avrupada lenfositoma isimli kulakta veya meme başında kırmızı veya menekşe renginde nodüler anormal deri lezyonu ,E. nodozum, LAP'ler görülebilir.

GEÇ İNFEKSİYON (EVRE 3-PERSİSTAN İNFEKSİYON)

Tedavi görmeyen hastalarda bile immun sistem spiroketi bulunduğu pek çok yerden eradike edebilir. Bununla birlikte çoğunlukla tedavisiz hastalarda Bb belli odaklarda canlı kalabilir. Değişmekle birlikte, artrit epizotları 2. ve 3. yıllarda daha uzun sürer ve kronik artrit (bir yıl veya daha uzun süren eklem inflamasyonu) karakteristik olarak bu dönemde başlar. Tipik olarak az sayıda büyük eklem etkilenir(sıklıkla diz). Sinovial lezyonlarda villöz hipertrofi, fibrin depolanması, mononükleer hücre infiltrasyonu görülür. Spiroketler eklem sivisinda üretilebilmiştir. Ciddi vakalarda kronik Lyme artriti kartilaj ve kemik erozyonuna ve nadiren sürekli eklem sakatlığına neden olur. ABD'de ve Avrupa'da eklem tutulumu benzerdir fakat Avrupa'da daha az sıklıkla görülür.Kronik Lyme artritinin romatizmal hastalıklar gibi immunolojik bir temeli vardır. Yapılan çalışmalarda Lyme artritli hastalarda HLA DR4, DR3 ve DR2' nin artmış sıklıkla görüldüğü saptanmıştır. Genetik olarak duyarlı kişilerde Bb organizma öldürüldükten sonra da devam eden immun cevabı tetikleyebilir.

Ilk infeksiyondan 1 yıl sonra Bb santral ve periferik sinir sisteminde sendromlara yol açabilir. Santral sinir sisteminde ortaya çıkan geç semptomlardan en iyi tanımlananı progresif ensefalomyelittir. Bu hastalarda spastik paraparezi, mesane disfonksiyonu, ataksi, 7. veya 8. sinir tutulumu, bilişsel bozukluklar mevcuttur. Tani intratekal olarak Bb antikorlarının gösterilmesi ile konulabilir. Bununla birlikte periferal nöropati, ataksi, demans, uyku bozuklukları da görülebilir.

Lyme borelyozisinde uzamış latentliğin en iyi örneği akrodermatitis kronika atrofikanstır. Asıl olarak Avrupa'da gözlenir. Lezyon genellikle ekstremitede mavi, kırmızı diskolorasyon ve deride şişlik ile karakterlidir. Lezyonun inflamatuar fazı yıllarca devam edip deride atrofiye neden olabilir. Bu tür lezyonlardan başlangıçtan 10 yıl sonra Bb kültürü yapılabilmiştir. Uzun süren vakalarda periostit ve küçük eklem subluksasyonlarını içeren kronik kemik-eklem tutulumu kutanöz lezyonların altında görülebilir. Bu da spiroketin direkt yayılımını düşündürür. Görülebilen diğer deri hastalıkları morfea, lichen sclerozis et atrophicus, granuloma annulare, eozinofilik fasiitis, progresif fasial hemiatrofi, yüzün diskoid lupus benzeri lezyonu, benign lenfositik infiltrasyondur.

Gözde keratit ve üveit görülür. Kronik dilate kardiyomiyopati şeklinde kardiak tutulum görülebilir.

KONJENİTAL İNFEKSİYON

Bb’nin transplasental geçtiği ve fetusta zararlı etkiler oluşturduğu kesin olarak kanıtlanmamıştır. Yapılan araştırmalarda hastalığı gebelik döneminde geçiren bazı annelerin fetuslarında spirokete rastlanmış ancak fetal inflamasyona ait herhangi bir bulgu saptanmamıştır. Bbʼni konjenital infeksiyona neden olduğuna dair kesin deliller olmamasına rağmen böyle bir ilişkinin olabileceği akılda tutulmalıdır.

LYME HASTALIĞI TANISI

Lyme hastalığı pek çok hastalıkla karışabileceği için tanısı zordur. CDC sürveyans amaçlı tanımlama geliştirmiştir. Bunlar tanısal kriterler değildir. Tam bir hikaye, fizik muayene ve uygun testlerin yapılması önemlidir. LH tanısı asıl olarak klinik tabloya dayanır.

CDC kriterleri:

E. migrans'ın görülmesi veya vakalarda en azından bir geç dönem bulgusunun olması ve infeksiyonun serolojik olarak doğrulanması gerekir.

Kas-iskelet sistemi: Tekrarlayan, kısa süreli, 1 veya daha fazla eklemde şişlik olması önemlidir. Kısa süreli ataklar halinde izlenmeyen kronik artritler, tek başına artralji, myalji, veya fibromyalji sendromları kriter olarak kabul edilmezler.

Sinir sistemi: Lenfositik menenjit, kranial nevrit, özellikle fasial palsi, radikülonöropati, veya nadiren ensefalomyelit. Ensefalomyelit BOS’da Bb'e karşı antikor yapımının gösterilmesi ile doğrulanmalıdır. Tek başına başağrısı, halsizlik, parestezi, hafif ense sertliği kriter olarak kabul edilmezler.

ut başlangıçlı, günler, haftalar içinde gerileyen 2-3. Dereceden A-V iletim kusurları, bazen bloğa eşlik eden myokardit LH’nı düşündürmelidir. Tek başına çarpıntı, bradikardi, dal blokları, myokardit kriter olarak kabul edilmezler.

Laboratuar bulguları: -Spiroketin hastanın doku veya sıvılarında üretilmesi

-Serum veya BOS’da tanısal düzeylerde spirokete karşı oluşmuş IgM ve IgG tipi antikorların saptanmasi

-Akut ve konvelasan serum örnekleri arasında antikor titresinde anlamlı artış olması

En sık karşılaşılan non-spesifik laboratuar bulguları: Sedimentasyon- CRP yüksekliği SGOT düzeylerinde artış, anemi, lokositoz, hipergamaglobulinemi saptanabilir.

SSS tutulumu olduğunda BOS’da genellikle lenfositik pleositoz bulunur. BOS proteini hafif-orta derecede artmış, glukoz ise normaldir.

Artritli olgularda lokal hassasiyet ve intraartiküler sivida polimorfonükleer lökositlerin hakim olduğu 500-100000/mm3 kadar hücre bulunur. Eklem çevresi sinovial dokuda mononükleer hücre infilrasyonu, sinovial hücre hiperplazisi ve vasküler proliferasyon saptanabilir.

Kardiak tutulumu olanlarda kalbe yönelik, nörolojik tutulumu olanlarda sinir sistemine yönelik incelemelerle tanı konabilir.

Bb en kolay deri lezyonlarından izole edilmektedir.(Barbour-Stoenner-Kelly by)Biyopsi ve aspirasyon kültürlerinden %80-90'a yakın sonuç alınabilmektedir. BOS, kan, myokarddan spiroket izolasyonu mümkün olmaktadır. Bb’nin dokularda direkt olarak gösterilmesi amacıyla çeşitli gümüşleme yöntemleri kullanılmaktadır.(Warthin-Starry, modifiye Dieterle, Steiner) Bunların yanında doku kesitlerinde spiroketin spesifik olarak immun flöresans tekniği ile, ayrıca histolojik olarak immun histolojik boyalarla gösterilmesi mümkündür. PCR BOS, deri lezyonları, sinovial sivi ve idrarda Bb'e ait genomik yapı tesbit edebilir. Kanda tesbit etmek zordur. Yöntem duyarlı olduğu için ortam şartlarından çok etkilenir. Diğer bir sorun tesbit edilen DNA’nın canlı mı ya da ölü spirokete mi ait olduğunu ayırt edemez.

Direkt yöntemler uzun zaman alması, pahalı teknikler olmaları ve yoğun çalışmaya gereksinim duyması nedeni ile tanıda indirekt yöntemler (IFA, HA, ELİSA ve Western-Blot)daha sıklıkla kulanılmaktadır. İndirekt yöntemlerde esas amaç oluşmuş antikorların gösterilmesidir. Tc LPA ( T cell lympoproliferatif assay) tanısal amaçla kullanılan bir yöntemdir.

IFA: Serum, BOS ve diğer vücut sıvılarında IgM ve IgG tipi anti Bb antikorlarını araştımada kullanılır. Duyarlılık ve özgüllüğü yüksektir.

HA: Duyarlılığına karşın özgüllüğü düşüktür. WB ile birlikte kullanıldığında tanıda yararlı olabilir.

ELİSA: İFA'dan daha duyarlı ve özgüldür. Birçok bakteri ile çapraz reaksiyon verebilir. Yalancı pozitiflikler saptanabilir.(Diğer spiroket infeksiyonları, subakut bakteriyel endokardit, EMN, JRA, RA, SLE)

WB: LH’da kullanılan testlerin (İFA, ELİSA) doğrulanması amacı ile kullanılır. Özellikle indetermine ve yalancı pozitif ELISA sonucunu kontrol için faydalıdır. Zaman alıcı ve dikkatli çalışmayı gerektiren bir testtir.

Tc LPA: Pahalı ve zaman alan bir testtir. Hücresel immun cevabı test eder.Özgüllüğü yüksek, duyarlılığı düşüktür.

Doktorlar tanı koyarken asıl olarak hikaye (kenelere maruziyeti de içeren), FM ve laboratuar bulgularına anti Bb sonuçlarından daha fazla güvenmelidir. Serolojik testler tanı koymaktan çok doğrulamak amaçlı kullanılmalıdır. 2 basamaklı test sistemi tavsiye edilmektedir. 1. basamak: ELİSA, IFA ve 2. basamak : WB dan oluşur. ELİSA'da elde edilen pozitif veya indetermine sonuçlar WB ile de test edilmelidir. Birçok vakada spesifik IgM + IgG antikorları ile infeksiyon doğrulanır. Fakat infeksiyondan en az 4 hafta sonra IgM , 6-8 hafta sonra IgG düzeyleri ölçülebilir. Negatif bir sonuç o an için Bb. açısından serolojik bir delil olmadığını gösterir. Eğer LH’dan kuvvetle şüpheleniliyorsa 2-4 hafta sonra test tekrarlanmalıdır. Anti Bb ile hastalık arasında kesin bir ilişki kurmak mümkün değildir. Pozitif sonuç şu anki hastalıktan bağımsız olarak önceki hastalığı gösterebilir. Diğer spiroket infeksiyonları, subakut bakteriyel endokardit, EMN, JRA, RA, SLE gibi hastalıklarda ELİSA'da yalancı pozitiflikler saptanabilir .(+) ELISA ile birlikte (-) WB yalancı pozitifliği gösterir. Hastada uzun süredir semptomlar var ve yalnızca IgM mevcutsa bu semptomlar Lyme hastalığına bağlanamaz.1-2 haftalık şikayetleri olan bir kişide IgG (+) ise bu önceki maruziyeti gösterir. Lyme hastalığının erken dönemlerinde hasta antibiyotik tedavisi alıyorsa antikor cevabı bloke olabilir ve hasta seronegatif kalır. İnflamatuar sıvılarda (spinal, sinovial) seruma göre yüksek antikor titrelerinin saptanması nörolojik veya eklem hastalığının Bb.’e bağlı olduğunu gösterir. E. migransi olan hastalara test yapılmasına gerek yoktur. Hastalığın ileri dönemlerinde de seronegatiflik nadirdir.Nöropsikolojik testler , elektrofizyolojik testler ve MRI objektif anormallikleri göstermede yaralı olabilir fakat Bb. nin neden olduğu hasarın spesifik markerlarını göstermede yararlı değillerdir.

AYIRICI TANI

Lyme hastalığı klinik tablosunun çeşitliliği ve serolojik testlerinin standartize edilmiş olmaması nedeni ile çok hastalıkla karışabilir. Bu yüzden pek çok sendrom ekarte edildikten sonra Lyme hastalığı tanısı konabilir. Semptomatik yayılan eritem böcek ısırığı şeklinde düşünülebilir. Stafilokoksik ve streptokoksik deri infeksiyonları, derinin fungal infeksiyonları, alerjik dermatitler, ürtikeryal lezyonlarla karışabilir. Endemik bölgelerde kayalık dağlar lekeli humması, babesiozis, erlichiosis, kene isırığı ensefaliti ve enteroviral infeksiyonlardan ayırt edilmelidir. Lyme artriti diğer infeksiyöz artritlerden, JRA, AER, kollajen vasküler hastalıklardan ayrılmalıdır. Belirgin yorgunluk, başağrısı, yaygın kas-eklem ağrısı , konsantrasyon güçlüğü, uyku bozukluğu ile seyreden fibromyaljinin ayrılması gerekir.

KORUNMA

Hastalığın en kesin korunma yolu kenelere karşı savaştır. Endemik bölgelerde insektisit kullanımı, temasi minimale indirmek için kapalı giyinmek ve vücudun açık bölgelerine kimyasal kene kovucular sürmek yararlıdır.

Aşi: ABD'de Lyme hastalığına karşı 2 monovalan aşı mevcuttur. Bunlardan her ikisi de Borrelia dış yüzey proteini A (Osp A) i antijen olarak kullanmaktadır. Bu aşılardan ilki kullanılmaya başlamıştır.Aşinin çocuklardaki güvenliği ve etkinliği bilinmiyor. Aşılarda yeterli korunma için dozlar tekrarlanmalıdır. İlk dozdan sonra 20 ay etkinliği gösterilmiştir ancak uzun dönem takip çalışmaları mevcut değildir. Avrupada OspC’i antijen olarak kullanan polivalan aşının ise klinik çalışmaları Finlandiya'da yapılmaktadır. Aşi çalışmaları hızla devam etmektedir.

KAYNAKLAR

1-İnfectious Diseases Mandell, Douglas, Bennett's Volume 2,p: 2143 2-Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology p:964 3-Harrison's Principles of Internal Medicine p:1042 4-Textbook of Internal Medicine 3rd edition William N. Kelley p:1079 5-İnfeksiyon Hastalıkları Ayşe Willke Topçu p:547 6-Bölgemizde sağlıklı bireyler ve bazı hasta gruplarında ELİSA yöntemiyle Lyme hastalığına özgül antikor prevalansı Dr. Serhat Birengel 7-Laboratory evaluation in the diagnosis of Lyme Disease Ann. İntern. Med. 1997:127:1109-1123 8-Systematic Review of the Treatment of Early Lyme Disease, Drugs 1999 Feb;57(2)157-173 9-Lyme Disease Diagnosis and Management Pitfalls, Arthritis and Rheumatism, vol 41 No2 Feb 1998, p195
10-Lyme Disease Serology , JAMA July 7 1999, Vol 282 No1 11-Evaluation of Two Test Serodiagnostic Method of Early Lyme Disease in Clinical Practice „JID 1999,179
12-Lyme Disease NEJM Aug 31,1989 p.586 13-Prevention of Lyme Disease after Tick Bites NEJM Aug, 20,1992 14-Lyme Disease Vaccines Ann of Intern Med Vol 129 Num 7p 583 15-Immunization Against Lyme Disease NEJM Vol 339 Num 4 p:263 16-FDA public Health Advisory:Assays for antibodies to B.burgdorferi 17-A reanalysis of IgM Western Blot Criteria for the Diagnosis of Early Lyme Disease 18-A controlled trial of antimicrobial prophylaxis for Lyme Disease after deer -tick bites NEJM Dec 17, 1992 Num 25 p:1170

19- B. borgdorferi ile ilişkili olabilecek semptomları olan hasta grubunun Lyme serolojisi yönünden değerlendirilmesi Mikrobiyoloji Bülteni 1994; 28(2): 106 20-Antalya yöresinde B.burgdorferi antikorlarının ve vektörlerinin araştırılması .Mikrobiyoloji Bülteni 1995; 29(1):1-6 21-Role of Serology in the Diagnosis of Lyme Disease JAMA, July, 1999,vol 282,nol

A.Ü.T.F. KLİNİK BAKTERİYOLOJİ VE İNFEKSİYON HASTALIKLARI A.B.D.

1999-2000

Duyuru

Hidras, Hidrastis, Hydrastis canadensis

Hidras, Hidrastis, Hydrastis canadensis

Yorum yap

Yorum yap

Yorum yap

Yorum yap

Yorum yap

Yorum yap

Yorum yap

Yorum yap

Yorum yap