Ps d1 Candida albicans Planktonik Hücreler ve Biyofilmler Üzerindeki Etkiler
Sónia Gonçalves , 1, * Patricia M. Silva , 1 Mário R. Felício , 1 Luciano N. de Medeiros , 2 Eleonora Kurtenbach , 2 ve Nuno C. Santos 1, *
Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk Reddi
Bu makale, PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır . İlişkili Veriler
Ek Malzemeler
Git: Soyut
Candida albicans , fırsatçı enfeksiyonlara neden olan önemli bir insan patojenidir. Planktonik hücrelerin bir substrata yapışması, biyofilm gelişimi için ilk adımdır. Antimikrobiyal peptit (AMP) Ps d1, Pisum sativum tohumlarından izole edilen bir defensindir . Bu AMP'nin C. albicans biyofilmleri ve planktonik hücreleri üzerindeki etkilerini, aktivitesini amfoterisin B ve flukonazol ile karşılaştırarak test ettik. Üç C. albicans varyantı üzerinde çalışıldı; bunlardan biri, glukosilseramid sentazdan yoksun, Ps'ye direnç veren bir mutantd1 mantar önleyici etki. Mantar hücreleri üzerindeki morfolojik ve biyomekanik değişiklikleri değerlendirmek için atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanıldı. Membran bozulması ve hücresel içeriğin sızıntısı ile yüzey değişiklikleri gözlendi. Sitometri deneyleri ve konfokal mikroskopi görüntüleme, Ps d1'in zamana ve konsantrasyona bağlı bir şekilde hücre ölümüne neden olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar, ilgili bir mantar insan patojenine karşı Ps d1 pleiotropik etkiyi gösterir ve bunun doğal bir antimikotik ajan olarak kullanılmasını önerir.
Anahtar Kelimeler: antimikrobiyal peptitler, atomik kuvvet mikroskobu, Candida albicans , biyofilm, konfokal mikroskopi
Git: Tanıtım
Candida albicans , özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda önemli olan oral, genital ve sistemik mantar enfeksiyonlarına neden olan fırsatçı bir insan patojenidir (Berman ve Sudbery, 2002 ). Mevcut antifungal tedavilere rağmen, bu patojenin neden olduğu mortalite ve morbidite hala yüksektir (Behnsen ve ark., 2008 ).). İntravenöz hatlar ve biyoprostetik cihazlarla ilişkili kandidiyazis problemlidir, çünkü bu cihazlar biyofilm büyümesi için substrat görevi görebilir. Biyofilmlerin varlığı, antimikrobiyal ajanlara karşı dirençleri nedeniyle ciddi sorunlara neden olabilir. Bu direnç, biyofilm topluluklarının inşası ve/veya çözülmesi için mevcut mantar popülasyonunun yerel yoğunluğuna dayalı olarak, biyofilm oluşumunda ve virülansında önemli bir rol oynayan çekirdek algılayıcı moleküllerin mevcudiyeti ile geliştirilmiştir (Donlan, 2002 ; Kruppa). , 2009 ; Deveau ve Hogan, 2011). Serbest yüzen planktonik hücreler ile biyofilm büyümesi arasında ince bir çizgi vardır. Aslında biyofilm gelişimi, planktonik hücreler substrata yapıştığında başlar. Yapışık/yapışkan hücreler büyür ve bölünerek salgılanan ekzopolisakkaritleri (EPS'ler) içeren koruyucu bir matris oluşturur (Donlan, 2002 ; Kruppa, 2009 ; Deveau ve Hogan, 2011 ). EPS'ler, bir biyofilmin hacmine ve yapışkan makroskopik özelliklerine katkıda bulunur. Tamamen gelişmiş bir biyofilm, sıvı dolu mikrokanallar tarafından yükselen ve nüfuz eden hücre katmanları ile yüksek düzeyde yapılandırılmıştır (Donlan, 2002 ).). Bu dinamik topluluklar yüzeylere yayılabilir, çevredeki partikülleri ve diğer mikropları içerebilir ve sürekli olarak yeni planktonik hücreler yayabilir (Stephens, 2002 ). C. _ albicans , çeşitli yüzeylerde tutunma, kolonize olma ve biyofilm oluşturma yeteneğine sahiptir. Bir patojen olarak C. albicans'ın önemi , hastalığı kontrol etmek ve saptamak için yeni stratejilerin geliştirilmesi konusunda önemli bir çabaya yol açmıştır (Srinivasan ve ark., 2011 ).
Mantarlar, antifungal ajanlar için hedef olarak hizmet edebilen benzersiz bir hücre duvarına ve hücre zarına sahiptir. Fungal hücre zarı, ana sterolü ergosterol olan ve içinde proteinlerin gömülü olduğu bir lipid çift tabakasından oluşan diğer ökaryotik hücrelere benzer (Katzung ve diğerleri, 2011 ). Glikosfingolipidler (GSL), hayvanlarda, bitkilerde ve mantarlarda biyolojik zarların temel bileşenleri olarak işlev gören bir lipid ailesidir (Leipelt ve diğerleri, 2001 ; Halter ve diğerleri, 2007 ; Daniotti ve Iglesias-Bartolome, 2011 ). Mantarlarda bulunan en yaygın GSL, Pichia pastoris, C. albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Sporothrix schenckii gibi çoğu mantarın hücre zarında bulunan glukosilseramiddir (GlcCer).ve Neurospora crassa (Barreto-Bergter ve diğerleri, 2004 ; Saito ve diğerleri, 2006 ). Bu glikosfingolipidin büyük miktarları mantar hücre duvarında da bulunmuştur (Nimrichter ve Rodrigues, 2011 ). Mantar büyümesi/dimorfizm sırasındaki işlevleri, virülans süreci ile ilişkilendirilmiştir (Rittershaus ve diğerleri, 2006 ), bu da GSL'nin yeni mantar önleyici ilaçların geliştirilmesinde potansiyel hedefler olduğunu düşündürür (Rittershaus ve diğerleri, 2006 ; Nimrichter ve Rodrigues, 2011 ; Gonçalves ve diğerleri, 2012 ).
Antimikrobiyal peptitler (AMP'ler), hem hidrofobik hem de hidrofilik kalıntılara sahip olan ve amfipatik yapılarla sonuçlanan kısa diziler (genellikle 15-50 amino asit kalıntısı) ile karakterize edilen katyonik moleküllerdir. Bitki, mantar veya hayvan kaynaklı endojen AMP'ler, kendilerini patojenik mikroplardan korumak için üretilir. Bu adaptif mekanizma, onları doğuştan gelen bağışıklık sistemi için gerekli kılar. AMP'lerin terapötik aktivitesi, bakterilere, mantarlara, protozoan ve metazoan parazitlere, virüslere, cilt hastalıklarına ve tümör hücrelerine karşı ortaya çıkar (Li ve diğerleri, 2012 ; Morizane ve Gallo, 2012 ; Torrent ve diğerleri, 2012 ). Terapötik aktiviteleri ve etki biçimleri hakkında kapsamlı bilgiler başka bir yerde verilmiştir (Silva ve ark., 2014 ).). Bu doğal antibiyotiklerin ek avantajı, antibiyotiğe dirençli mikrobiyal suşların gelişimine yatkın olmamalarıdır (Korting ve diğerleri, 2012 ).
Ps d1, bahçe bezelyesinin ( Pisum sativum ) tohumlarından izole edilen, sistein açısından zengin 46 amino asit tortulu bir defensindir (Almeida ve diğerleri, 2000 , 2002 ; Cabral ve diğerleri, 2003 ; de Medeiros ve diğerleri, 2010 ) . Esas olarak epidermal dokularda ve bezelye kabuklarının damar demetlerinde bulunur. Bu peptit, birkaç filamentli mantara ve dimorfik C'ye karşı yüksek antimikrobiyal aktivite sergiler . albicans ve N. _ crassa , ancak test edilen birkaç bakteriye karşı değil (Almeida ve diğerleri, 2000 , 2002 ; Lobo ve diğerleri, 2007 ; de Medeiros ve diğerleri,2010 ). 20 uM'de Ps d1'in, C. albicans vahşi tipinin (WT) %100 büyüme inhibisyonuna neden olduğu, buna karşılık karşılık gelen C. albicans gcs -silinmiş suşunun (Δ gcs ) %70 inhibisyonuna sahip olduğu gösterilmiştir (de Medeiros ve ark . ., 2014 ). Son zamanlarda, membran bölme çalışmaları yoluyla, Ps d1'in mantar hücrelerinde olduğu gibi ergosterol ve GlcCer içeren membranlar için yüksek afinite ve özgüllüğe sahip olduğunu gösterdik (Gonçalves ve diğerleri, 2012 ). Aksine, bu defensin, kolesterol açısından zengin membranlarla düşük etkileşime sahiptir ve Ps d1'in insan hücrelerine karşı azaltılmış toksisitesini açıklar (Gonçalves ve diğerleri, 2012 ). EksikliğiC'de Ps d1 içselleştirme . albicans mutant suşu (A gcs ), konfokal mikroskopi ile gösterilmiştir (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ). Birlikte, bu sonuçlar GlcCer'in mantar plazma zarı ile Ps d1 etkileşimi ve bunun içselleştirilmesi için önemli olduğunu gösterdi.
Bu çalışmada, Ps d1'in etki modu, üç farklı Candida albicans suşunun hücre morfolojisi, pürüzlülüğü ve sertliği üzerindeki etkilerinin nano ölçekte değerlendirilmesi yoluyla değerlendirildi . İncelenen varyantlar için planktonik hücreler ve biyofilmler arasındaki farklar bulundu. İşlenmemiş ve tedavi edilmiş C'nin konfokal mikroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleri . albicans hücreleri, Ps d1'in planktonik hücreleri 20 μM'de öldürdüğünü gösterirken, biyofilmin toplam inhibisyonu ve kısmen yok edilmesi sadece 10 kat daha yüksek bir konsantrasyonda gözlemlendi. C . _ albicans Δ gcsmutant, hem biyofilmler hem de planktonik hücreler için peptidin yokluğunda bile hücre morfolojisinde ve pürüzlülüğünde değişiklikler gösterdi. Ps d1 varlığında planktonik hücrelerin yapışması azalmış ve biyofilmin tamamen inhibisyonu ve/veya eradikasyonu gözlenmiştir. Bu sonuçlar , GlcCer'in oldukça alakalı olduğu Ps d1-mantar membran etkileşimi için birkaç anahtar yönü göstermektedir. Ek olarak, verilerimiz defensinin hücre içinde meydana gelen antimikrobiyal etkisinin ek bir bileşeniyle birlikte pleiotropik bir etkiye sahip olduğunu gösterir.
Git: Malzemeler ve yöntemler
Candida albicans kültürlerinin hazırlanması
Üç Ç . albicans suşları çalışıldı: Santa Maria Hastanesi'ndeki (Lizbon, Portekiz) bir hastadan toplanan bir klinik izolat (CI), SC5314/ATCC MYA-2876 (WT) ve SC5314 CAI4 ura3 Δ ::imm434/ura3 Δ ::imm434 ( Δ gcs ), SC5314'e benzer, lütfen Dr. Dirk Warnecke (Institut für Allgemeine Botanik, Hamburg Üniversitesi, Almanya) tarafından sağlanmıştır. Δ gcs'de , glukosilseramid sentaz geni (HSX11) bozuldu ve suşun glukosilseramid lipidi üzerinde yetersiz kalmasına neden oldu (Leipelt ve diğerleri, 2001 ).). Suş stokları -80°C'de %15 gliserol ile tutuldu. Stokta önceden çözülmüş hücreler Maya Pepton Dekstroz (YPD, Sigma Aldrich, ABD) agar plakalarına aşılandı ve 48 saat 37°C'de inkübe edildi. Bu süreden sonra, izole edilmiş bir mantar kolonisi, YPD broth içinde 180 rpm'de çalkalanarak 25°C'de gece boyunca kültürlendi. Bu süre zarfında kültür, büyümenin durağan aşamasına ulaşır. Hücreler, 1.880 g'de santrifüjleme ile toplandı4°C'de 10 dakika süreyle, süpernatan çıkarıldı ve hücreler, planktonik çalışmalar için 150 mM NaCl içeren 10 mM HEPES tamponu pH 7.4 ile ve 10 mM fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 2.7 mM potasyum klorür, 137) ile üç kez yıkandı. Biyofilm deneyleri için mM sodyum klorür) pH 7.4. Daha sonra hücre konsantrasyonu belirlendi ve ilk süspansiyon, her deney için gerekli konsantrasyona seyreltildi. Planktonik C. albicans'ın amfoterisin B, flukonazol ve Ps d1'e duyarlılığı
Minimal inhibitör konsantrasyonu (MIC) belirlemek için in vitro antifungal duyarlılık testleri yapıldı. Ulusal Klinik Laboratuvar Standartları Komitesi'nin (Klinik Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi, 1997 ) tavsiyesine göre, mikrodilüsyon yöntemiyle, 96 kuyulu mikroplakalarda belirlenmiştir (Brito ve diğerleri, 2010 ; Eksi ve diğerleri, 2013 ).). L-glutaminli (Gibco-Life Technologies, UK) RPMI 1640 ortamı kullanıldı, %0.2 glikoz, 165 mM MOPS (3-morfolinopropansülfonik asit) (AppliChem, Almanya) ile desteklendi ve pH 7.4'e tamponlandı. Karşılaştırma amacıyla ve pozitif kontrol olarak, geleneksel antifungal ilaçlar amfoterisin B (AMPH B) ve flukonazol (FCZ) (Sigma Aldrich, ABD) de seçilen suşlara karşı test edildi. Her oyuk, büyüme ortamı (RPMI), farklı AMPH B veya FCZ konsantrasyonları (0.001 ila 100 ug/ml) ve C ile toplam 200 ul hacme hazırlandı . albicans (2 × 10 3hücreler/ml). Antifungal içermeyen kontroller de test edildi. Plakalar 48 saat 37°C'de inkübe edildi, ardından optik yoğunluk 540 nm'de ölçüldü. MIC, inkübasyondan sonra bir organizmanın %100 büyüme inhibisyonuna neden olan bir ilacın minimum konsantrasyonu olarak tanımlandı (Andrews, 2001 ). Deneyler üç kopya halinde yapıldı ve değerler, MIC belirlemesi için Gompertz denklemi kullanılarak GraphPad Prism 5 ile analiz edildi (Lambert ve Pearson, 2000 ). Ps d1 ile deneyler , 90 ug/ml (20 uM)'de gerçekleştirilmiştir (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ). Biyofilm geliştirme ve XTT/menadion testi testi
C'nin oluşumu ve duyarlılıkları . albicans biyofilmleri, 96 oyuklu plaka bazlı yöntemle belirlendi (Pierce ve diğerleri, 2008 ). Her suş için biyofilm oluşumu için optimal hücre konsantrasyonunu belirlemek için 100 µl C. albicans süspansiyon hücreleri RPMI 1640 içinde, 1,0 × 105 , 1.0 × 106 , 1.0 × 107 ve 1.0 × 108'de glikoz % 2 ve 165 mM MOPS ilehücreler/ml polistiren 96 oyuklu bir plaka üzerine yerleştirildi, her numune üç kopya halinde. Plakalar, biyofilm gelişimi için optimal hücre konsantrasyonunu oluşturmak amacıyla 37°C'de 12, 24, 48, 72 ve 96 saat süreyle inkübe edildi. Her adım süresinin sonunda (inkübasyon süresi), biyofilm, planktonik ve/veya yapışmayan hücreleri çıkarmak için üç kez PBS ile yıkandı. Bu noktada 100 µl XTT/menadion solüsyonu (10 ml XTT 0.5 g/l içinde 1 µl menadion 1 mM) her bir kuyucuk plakasına (biyofilmin oluştuğu yer) ilave edildi ve 2 saat 37°C'de inkübe edildi. Bu süreden sonra turuncu bir renk, biyofilm içindeki hücrelerin metabolik aktivitesini ortaya çıkarır. Süpernatanlar yeni bir plakaya aktarıldı ve optik yoğunluk 490 nm'de ölçüldü. Atomik kuvvet mikroskobu görüntüleme
Tüm C. albicans suşları için planktonik hücre görüntülemesi aşağıdaki gibi yapıldı, 1 x 105 hücre/ml HEPES tamponu içinde 25°C'de 6 ve 24 saat çalkalanarak inkübe edildi. AMPH B, FCZ ve Ps d1 nihai konsantrasyonları MİK'e eşit ve MİK'ten 10 kat daha yüksekti. Kontrol olarak, antifungal tedavisi olmayan hücreler kullanıldı. Her test örneğinden 100 ul damla, poli-L-lizin (PLL) kaplı bir lamel üzerine uygulandı ve 2 saat 25°C'de bırakıldı. Biriktirmeden sonra, numuneler filtrelenmiş (0,2 µm) deiyonize su ile 10 kez durulanmış ve 25°C'de havada kurutulmuştur.
Muamele edilmemiş ve muamele edilmiş hücreler, bir Zeiss Axiovert 200 ters mikroskobu (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Almanya) üzerine monte edilmiş bir JPK NanoWizard II atomik kuvvet mikroskobu (JPK Instruments, Berlin, Almanya) kullanılarak görüntülendi. Ölçümler, aralıklı temas modunda, oda sıcaklığında, kaplanmamış silikon ACL konsolları (Applied NanoStructures, Mountain View, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu konsollar, 145-230 kHz'lik tipik rezonans frekanslarına ve 20-90 N/m'lik yay sabitlerine sahiptir. Görüntüleme için tarama hızı 1 Hz'den daha az olarak ayarlandı ve görüntü çözünürlüğü tüm görüntüler için 512 × 512 piksel olarak ayarlandı. Yükseklik, hata sinyali ve faz kontrast görüntüleri kaydedildi ve gerektiğinde hatta takıldı. Kaydedilen görüntülerden yükseklik ve boyut bilgileri JPK Veri İşleme yazılımı v.4.2.53 ile elde edilmiştir.
AFM yükseklik görüntülerinin pürüzlülük analizi, Gwyddion 2.31 yazılımı (Çek Metroloji Enstitüsü, Brno, Çek Cumhuriyeti) kullanılarak yapıldı. Pürüzlülük, kök ortalama kare değerinden hesaplanmıştır (RMS, yani 1 × 1 µm 2 görüntülü alan üzerinde yükseklik dağılımının standart sapması). Bu işlemenin sonuçları, varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni son testleri kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi. AFM tabanlı hücre sertliği ölçümleri
C. albicans yıkanmış süspansiyonları, oda sıcaklığında çalkalanarak 24 saat süreyle inkübe edildi. AMPH B, FCZ ve Ps d1 nihai konsantrasyonları, MIC'den 10 kat daha yüksekti. Nihai hücre konsantrasyonu 1 x 105 idihücre/ml ve kontrol olarak hücre numuneleri herhangi bir işlem görmeden inkübe edildi. Her numuneden 100 ul bir poli-L-lisin (PLL) kaplı cam lamel üzerine yerleştirildi ve 2 saat 25°C'de bırakıldı. Biriktirmeden sonra, lamel yapışmamış hücreleri çıkarmak için numuneler HEPES tamponu ile 10 kez durulandı. Numunenin kurumasını önlemek için yapıştırılan hücrelere 100 µl HEPES tamponu eklendi. Ölçümler, 25°C'de HEPES tamponunda, 200 um uzunluğunda altın refleks kaplı silikon nitrür OMCL-TR400PSA-1 konsollar (Olympus, Japonya) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu konsollar, 8-14 kHz'lik tipik rezonans frekanslarına ve yaklaşık 0.02 N/m'lik yay sabitlerine sahiptir.
İlk olarak, hücrelerin şekli ve yüksekliği hakkında önceden bir genel bakışa sahip olmak için, 10 µm/s'lik bir yaklaşım ve geri çekme hızı, 3 µm'lik Z uzunluğu ve 0,4 V'luk bir bağıl ayar noktası kullanılarak kuvvet haritaları yapıldı. Haritadaki koordinatlar sonra seçildi. Daha sonra, her hücre için bir konum seçildi ve 3 μm/s yaklaşma ve geri çekme hızı, 3 μm Z uzunluğu ve 0,4 V nispi ayar noktası kullanılarak bu koordinatlar üzerinde üç kopya halinde kuvvet-mesafe ölçümleri yapıldı. koşullar, tanımlamanın hücre yüksekliğinin %5 ila %10'u arasında olmasını sağlar. Geri çekme kuvveti-mesafe eğrileri, JPK Veri İşleme yazılımı v. 4.2.53 ile işlendi. İşlemden sonra, eğrilere dört taraflı piramit Hertz modifiye denklemi uygulandı ve Young modülü elde edildi. Biyofilm inhibisyonu ve eradikasyon testleri
Biyofilm geliştirme deneylerinde elde edilen hücre koşulları kullanılarak biyofilm inhibisyonu ve eradikasyon deneyleri belirlendi. Her suş için hücre konsantrasyonları belirlendikten sonra, AMPH B, FCZ ve Ps konsantrasyonlarıBiyofilm inhibisyonu ve eradikasyon deneyleri için kullanılan d1, MIC'den 10 ve 100 kat daha fazlasına karşılık gelir. İnhibisyon deneylerinde, mantar önleyici ilaçlar hücrelerle aynı zamanda (antifungal hücrelerle önceden karıştırılarak) yerleştirildi ve daha önce biyofilm gelişimi için belirlenen aynı adım süresi sırasında inkübe edildi. Eradikasyon deneyleri için, her suş için biyofilm oluşturulduktan sonra antifungaller eklendi ve 24 saat 37°C'de inkübe edilmeye bırakıldı. Her iki durumda da biyofilm ortamı, mikroskopi ölçümleri için PBS ile değiştirildi. AFM görüntüleme için, biyofilmler 10 kez filtrelenmiş deiyonize su (0.2 um) ile yıkandı ve oda sıcaklığında havayla kurutuldu. C'nin oluşumu, inhibisyonu ve eradikasyonu için biyofilm görüntüleri . albicans suşları, hücrelerin büyütüldüğü yüzeyde doğrudan ölçüldü. Konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi ile biyofilmlerin ve plancktonik hücrelerin Canlı/Ölü ölçümleri
Hem C. albicans biyofilmlerinde hem de plancktonik hücrelerde Canlı/Ölü tahlil kiti kullanıldı . LIVE/DEAD® Funga Light™ Maya Canlılık Kiti ( L34952 , LifeTechnologies, ABD) iki floresan prob, SYTO 9 ve propidium iyodürden (PI) oluşur. Canlı ve ölü hücrelerden oluşan bir popülasyonda, SYTO 9 nükleik asit, bir popülasyondaki tüm mayaları, zarları sağlam olanlar ve zarları hasarlı olanlar olarak etiketler. Buna karşılık, PI yalnızca membranları hasarlı mayaya nüfuz eder ve her iki boya da mevcut olduğunda floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile SYTO 9 leke floresansında bir azalmaya neden olur (Johnson ve Spence, 2010 ).). Sonuç olarak, zarları sağlam olan maya yeşil floresan ile boyanırken, zarları hasarlı maya kırmızı floresan ile boyanır.
Bir Zeiss LSM 510 META konfokal nokta tarama mikroskobu (Jena, Almanya) ile optik mikroskopi deneyleri, antifungal ajanlara maruz kalmadan önce ve sonra hücrelerin yapısını ve canlılığını incelemek için yapıldı. Argon (488 nm; 45 mW) ve diyot pompalı katı hal (561 nm; 15 mW) lazerler, 40 x kuru hedef ile kullanıldı. Hücreler, görüntülemeden önce 24 saat AMPH B (10 mg/ml), FCZ (40 mg/ml) veya Ps d1 (900 ug/ml) ile inkübe edildi. Bu mantar önleyici konsantrasyonlar, planktonik MIC'den 10 kat daha fazla olacak şekilde seçilmiştir. Daha sonra biyofilmler SYTO 9 ve PI probları ile etiketlendi, 15 dakika inkübe edildi ve görüntüler alındı. Görüntüler ImageJ 1.47v (rsbweb.nih.gov/ij/) ile analiz edildi.
Akış sitometrisi deneyleri için, C. albicans suşları , planktonik MIC'ye eşit ve 10 kat daha yüksek antifungal konsantrasyonla AMPH B, FCZ ve Ps d1 ile 24 saat süreyle inkübe edildi. Yeşil boya tüm hücrelerde mevcut olduğundan ve FRET fenomeninin yanı sıra yeşil floresan yoğunluğunun her zaman küçük bir katkısı olduğundan, çift etiketli hücreler ölüm için pozitif sonuç olarak kabul edildi. C. albicans boyamaları üreticinin talimatlarına göre yapıldı. Kısaca 1 × 10 5HEPES tamponundaki hücreler/ml, her iki boya ile 3.34 ve 20 uM'lik bir nihai konsantrasyona kadar boyandı (sırasıyla SYTO 9 ve PI). Akış sitometrisi analizinden önce tüm numuneler oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika tutuldu. Deneyler, lekeli hücreleri uyarmak için mavi (488 nm) ve kırmızı (640 nm) lazerler kullanılarak bir BD Accuri C6 Akış Sitometresinde (BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) yapıldı. Yeşil floresan emisyonu 530 nm bant geçiren filtre ile ve kırmızı floresan emisyonu 670 nm bant geçiren filtre ile tespit edildi. Floresan emisyonu biyo-üssel ölçekte elde edildi ve 40 000 hücre için veriler toplandı. Tüm akış sitometresi sonuçları, FlowJo Yazılımı sürüm 10.0x (Tree Star Inc., Ashland, OR, ABD) kullanılarak analiz edildi.
Git: Sonuçlar
Planktonik C. albicans'ın AMPH B, FCZ ve Ps d1'e duyarlılığı
AMPH B ve FCZ'nin üç C. albicans suşuna karşı aktivitesi, Şekil S1'de (Ek Malzeme) gösterildiği gibi antifungal ilaçlara duyarlılıkları ölçülerek belirlendi . Elde edilen eğriler uyduruldu ve MIC değerleri Gompertz denklemi kullanılarak elde edildi (Lambert ve Pearson, 2000 ). Ps d1 için kullanılan değerler önceki çalışmalarda (20 μM) rapor edilmiştir (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ). Şekil Sl'de gösterildiği gibi , AMPH B ve FCZ için MIC değerleri, çalışılan suşa bağlı olarak farklılık göstermiştir. Toplamda, üç C. albicans suşu, AMPH B, FCZ ve Ps d1'e duyarlıydı . AMPH B ve FCZ, WT ve Δ'de benzer MIC gösterdigcs planktonik hücreler (bu dört MIC'in tümü 3,7-4,0 μg/ml aralığındadır). CI test edildiğinde daha düşük değerler elde edildi. Biyofilm geliştirme ve XTT/menadion testi testi
Biyofilm oluşumu, hücrenin büyüme yüzeyine yapışmasına bağlıdır. Ps d1'in C üzerindeki etki modunu incelemek . albicans biyofilm oluşumu, polistiren yüzeyler seçilmiştir. Biyofilm oluşumu için koşulları optimize etmek için, üç C için XTT tahlilleri yapıldı . albicans suşları çalışıldı. En iyi biyofilm büyümesini sağlayan zaman ve hücre konsantrasyonları, Şekil S2'de (Ek Malzeme) gösterilmiştir. Görüldüğü gibi biyofilm gelişimi için ihtiyaç duyulan hücre yoğunluğu suştan suşa farklılık göstermektedir. WT ve Δ gcs , CI'den 10 kat daha yüksek bir hücre konsantrasyonuna ihtiyaç duyar (10 5hücreler/ml) biyofilm gelişimini başlatmak için. Buna rağmen, klinik izolat ve WT 24 saat sonra biyofilm oluştururken, mutant suşun biyofilm gelişimini ve yapışmasını sağlamak için 72 saate ihtiyacı vardır. AMPH B, FCZ ve Ps d1, C. albicans plancktonik hücrelerinde morfolojik değişikliklere neden olur
Aralıklı temas modunda AFM görüntüleme, MIC'de ve 10 kat daha yüksek konsantrasyonlarda AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile 6 saat ve 24 saat inkübasyondan sonra C. albicans planktonik hücrelerinin maruz kaldığı etkileri değerlendirmek için kullanıldı . Hata sinyali, dedektör sinyali ile ayar noktası arasındaki farktır ve daha fazla uzaysal ayrıntıya sahip görüntüler sağlar. Genel olarak, antimikrobiyal tedaviler tüm hücrelerde morfolojik değişikliklere neden oldu. Bu etkilerin şiddeti zamana bağlı olarak arttı. 6 saat sonra, hücre yüzeyinde (kabarcıklar) küçük düzensizlikler ve hücrelerin üzerinde ve çevresinde biriken küçük veziküllerin MIC antifungal konsantrasyonundan 10 kat daha yüksek olduğunu gözlemlemek mümkün olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Şekilde görüldüğü gibiŞekil 11CI ve WT suşları için, işlenmemiş hücreler (kontroller) pürüzsüz bir yüzeye ve düzenli şekle sahiptir (Şekiller).1A,D). CI ve WT'nin aksine, işlenmemiş Δ gcs hücreleri düzensiz yüzey gösterdi (Şekil(Şekil1G).1G). MIC konsantrasyonunda Ps d1 ile 24 saat süreyle inkübasyon , hücre yüzeyinde bazı deformasyonlar gösterdi (Şekiller).1B,E,H). 10 × MIC'de, MIC'de elde edilenlerden daha gelişmiş etkiler gözlendi (Şekiller1C,F,I). Küçük kabarcıklar eşlik eden hücrelerden salınmakta ve iç içerik serbest bırakılmaktadır (Şekil(Şekil 11ve Şekil S7 ).
Şekil 1
Ps d1 konsantrasyonunun C. albicans planktonik hücreleri üzerindeki etkisi . Ps d1 : ( A , D ,G) 0 μM (kontrol) ; (B,E,H) MIC (20 μM) ve (C,F,I) 10 kat daha yüksek konsantrasyonda. Tüm görüntüler 10 × 10 μm 2'dir .
AMPH B ve FCZ'den farklı olarak (Şekil S5 , S6 ), Ps d1 etkileri daha şiddetli görünmektedir. Mutabakat sonucu, hücre iç içeriğinin veya tamamen kabarcıklarla kaplanmış hücrelerin serbest bırakılmasıdır. WT ile muamele edilmiş hücreler için, bir kabarcığın yüksekliği yaklaşık 14 nm'dir (Şekil S3 ). Kabarcıklar birbiri üzerinde birikerek hücrenin üzerinde toplu bir yapı oluşturur. Mutant hücreler için benzer sonuçlar elde edildi (Şekil S4 ). Yalnızca CI hücreleri için, Ps d1 10 × MIC'de soyulma benzeri bir morfoloji gözlendi (Şekil(Şekil1C).1C). Üç tedaviden AMPH B, daha kapsamlı bir hücre deformasyonunu indükleyendir: hücreler hacim kaybeder ve zarlar daha pürüzlü görünür. Klinik izolat, hem inkübasyon hem de kullanılan ilacın konsantrasyonunda FCZ'den daha az etkilenmiş gibi görünmektedir, sadece 24 saatlik inkübasyondan sonra hücre yüzeyinde bazı düzensizlikler ortaya çıkmaktadır. C. albicans , AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile işlemden sonra yüzey pürüzlülüğünde bir artışa maruz kalıyor
Yüzey pürüzlülüğü üç C için değerlendirildi . albicans suşları, AMPH B, FCZ ve Ps d1 ile tedaviden önce ve sonra (Şekil(Şekil 2),2), hem 6 saat hem de 24 saat hücre tedavisinden sonra. Planktonik hücrelerle gerçekleştirilen tedavilerin herhangi birinde ortalama pürüzlülükte genel bir artış oldu. Hücre yüzeyinin 1 × 1 μm 2 görüntülerine uygulanan RMS formülü ile elde edilen bu sonuçlar, antifungal tedaviden sonra yüzey pürüzlülüğünün arttığına dair önceki nitel gözlemlerle uyumludur (Şekil(Şekil 1).1). Kontrol koşulları ile ilgili olarak, CI ve WT hücreleri daha düşük yüzey pürüzlülük değerlerine sahiptir (Şekiller).2A,D, kontrol), 5 nm'nin altında, Δ gcs hücreleri ise 5 nm'nin üzerinde yüzey pürüzlülük değerleri sunar (Şekil(Şekil2G,2G, kontrol). WT hücreleri en çok etkilenenlerdi (Şekiller2D–F) ve Δ gcs en az etkilenen (Şekiller )2G–I) tedavilerden herhangi biri ile. AMPH B ile yapılan tüm tedaviler, CI ve WT hücrelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir membran pürüzlülüğü artışına neden oldu (Şekiller).2A,D). Pürüzlülükteki artışları istatistiksel olarak anlamlı olmadığı için Δ gcs hücreleri için durum her zaman böyle değildi (Şekiller).2H, ben). FCZ ile tedavi edilen üç hücreyi karşılaştırırken (Şekiller2B,E,H), CI ve Δ gcs için yüzey pürüzlülüğü üzerinde daha az etki gözlendi . Aksine, WT hücreleri bu işlemden güçlü bir şekilde etkilendi ve test edilen tüm koşullar, yüzey pürüzlülüğünde istatistiksel olarak anlamlı bir artışla sonuçlandı. Son olarak, Ps d1, AMPH B'ye benzer bir şekilde CI hücrelerinin pürüzlülüğünü arttırdı (Şekil(Şekil2C),2C), WT hücreleri için ise Ps d1'in etkileri (Şekil(Şekil2F)2F) büyüklük olarak FCZ'ninkilere benzerdi. Yine, AMPH B ve FCZ için gözlemlendiği gibi, Δ gcs , Ps d1'den en az etkilenen ; yine de defensin, MIC'den 10 kat daha yüksek bir peptit konsantrasyonu ile 24 saatlik inkübasyondan sonra bu hücrelerin yüzey pürüzlülüğünü güçlü bir şekilde artırabildi (Şekil(Şekil2I2I).
şekil 2
AMPH B (A,D,G) , FCZ ile klinik izolat (A–C) , vahşi tip (D–F) ve Δ gcs (G–I) C. albicans suşlarının inkübasyonundan sonra hücre pürüzlülüğü (RMS) ölçümleri ( B,E,H) ve Ps d1 (C,F,I) , MIC'de ve 10 kat daha yüksek konsantrasyonda. AFM yükseklik görüntülerinden, hücre üzerinde 1 x 1 µm 2 ekinlerde ölçümler elde edildi ( N = 10). Sütunlar, her deney koşulu için toplam 30 hücrede her hücre için üç bağımsız ölçümün ortalama ± standart sapmasına karşılık gelir. İki yönlü ANOVA ve Bonferroni son testi yapıldı ( * p< 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001). Hata çubukları SEM'i gösterir. C. albicans , AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile tedaviden sonra sertliğini kaybeder
Hücrelerin sertliğindeki değişiklikler iki farklı şekilde değerlendirildi. Biri, AFM tabanlı kuvvet spektroskopisi kullanılarak zarın Young modülünün belirlenmesine dayanıyordu (üç tedavi için; ŞekilFigür 3);3); ve diğeri, hücre yüzeyinin, zardaki daha yumuşak ve daha sert alanları görselleştirmeye ve ayırt etmeye izin veren AFM faz-kontrast görüntülerinin gözlemlenmesine dayanıyordu ( yalnızca Ps dl için; Şekil S7 ).
Figür 3
C. albicans'ın AMPH B, FCZ ve Ps d1 (konsantrasyonlar MIC'in 10 katı) ile 24 saat inkübasyonundan sonra hücre sertliği ölçümleri (AFM kuvvet-mesafe eğrilerinden hesaplanan Young modülü ). Ölçümler, her deneysel koşul için toplam 30 hücre üzerinde her hücre için üç kopyaya karşılık gelir. İki yönlü ANOVA ve Bonferroni son testi yapıldı ( * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). Hata çubukları SEM'i gösterir.
Young modülü tayini, MIC'den 10 kat daha yüksek bir AMPH B, FCZ veya Ps d1 konsantrasyonu ile 24 saatlik inkübasyondan sonra yapıldı (Şekil(Figür 3).3). CI hücrelerinin ortalama zar sertliği değeri 354 ± 14 kPa, WT'nin ortalama değeri 384 ± 14 kPa ve Δ gcs ortalama değeri 315 ± 21 kPa idi. Δ gcs hücrelerinin sertliği WT ile karşılaştırıldığında, %18'lik bir azalma oldu (Şekilde kırmızı yıldızFigür 3;3; * p < 0.05). Kontrole göre sertlik azaltma yüzdeleri, her bir işlemin farklı etkilerini daha iyi anlamak için hesaplanmıştır (Şekil'in altındaki koyu kırmızı kutudaki değerler).Figür 3).3). AMPH B'nin hücre sertliği üzerindeki etkileri, hücre başlangıç sertliğinde %60'lık bir azalma ile Δ gcs hücreleri için daha şiddetliydi (Şekil(Figür 3).3). WT hücreleri, ilk sertlikte %23'lük bir azalma ile bu işlemden daha az etkilendi. FCZ, üç suş üzerinde en az etkiye sahip tedaviydi ve sertlik üzerindeki en yüksek azalma, FCZ'nin ilk sertliğin neredeyse yarısına kadar bir azalmaya neden olduğu WT hücreleri için kaydedildi. Üç tedaviden, Ps d1, CI (%67) ve WT (%57) hücrelerinin sertliğinde en büyük azalmaya neden olurken, Δ gcs hücreleri için bu, daha düşük etkiye sahip olan tedaviydi (%34 sertlik azalması). Her durumda, Ps d1 dahil olmak üzere antifungal ilaçlarla tedavi, hücre sertliğinde istatistiksel olarak anlamlı düşüşlere yol açar (Şekil(Figür 3;3; p < 0,001).
Ps d1 işleminden sonra C. albicans'ın faz kontrastlı görüntülemesiyle, sertlik ve yumuşaklık gibi numune özellikleriyle ilgili bazı değişiklikleri ayırt etmek mümkün olmuştur (Magonov ve diğerleri, 1997 ; Martinez ve Garcia, 2006 ; Garcia ve diğerleri, 2007 ; Nie ve diğerleri, 2011 ). Üç suşun kontrol hücrelerinin faz kontrastlı görüntülerinin tümü homojen bir yüzey sunar. Üç suş için gözlemlenen sonuçlar kabaca aynıdır. Peptit ile muamelenin neden olduğu hücre yüzeyindeki kabarcıklar, çevreleyen hücre yüzeyinden daha yumuşaktır (Şekil S7, Ek Malzemedeki faz kontrast görüntüleri) ve kabarcık oluşmadığında bile, bu görüntüler daha yumuşak ve daha sert alanların ayırt edilmesini sağlar. Ps d1, C. albicans planktonik hücrelerinde ölümü tetikler
Ps d1'in canlı/ölü boyama yoluyla planktonik C. albicans hücrelerini öldürüp öldürmediğini belirlemek için akış sitometrisi deneyleri yapıldı . CI, WT ve Δ gcs hücreleri, MIC'ye eşit ve 10 kat daha yüksek bir AMPH B, FCZ veya Ps d1 konsantrasyonu ile 24 saat boyunca inkübe edildi . Çeyrekler (boyasız, canlı, ölü ve çift pozitif hücreler), ilgili kontrolleri kullanılarak her suş için oluşturulmuştur (veriler gösterilmemiştir).
FigürŞekil 44MIC ve 10 kat daha yüksekte Ps d1 ile tedaviden sonra CI, WT ve Δ gcs planktonik hücreler için elde edilen akış sitometrisi nokta grafiklerini gösterir. Burada, Ps d1'in CI hücreleri üzerinde daha az etkisi oldu ve peptit varlığında daha az hücre öldü (Şekiller).4A–C). WT ve Δ gcs için, ölü hücre yüzdesi , MIC konsantrasyonunda Ps d1 varlığında sırasıyla %70.6 ve %23.8'e yükseldi . İlginç bir şekilde, peptit konsantrasyonu 10 kat daha yükseğe çıkarıldığında, ölü hücrelerin yüzdesi Δ gcs hücreleri için (%27.8) benzer görünüyor , ancak WT hücreleri için değil (%48.7).
Şekil 4
Ps d1 ile tedaviden sonra klinik izolat (A–C) , vahşi tip (D–F) ve Δ gcs (G–I) planktonik hücrelerin akış sitometrisi nokta grafikleri . MIC konsantrasyonunda (20 μM) (B,E,H) ve 10 kat daha yüksek (200 μM) (C,F,I) Ps d1 ile 24 saat inkübasyondan sonra hücreler her iki boyayla da boyandı . A,D,G , kontrol).
Tüm bu sonuçları AMPH B ve FCZ için elde edilenlerle karşılaştırarak (Şekil S8 – S10 ), Ps d1'in WT ve Δ gcs hücrelerinde daha güçlü bir etkiye sahip olduğu sonucunu çıkarmak mümkündür (Şekiller2E,F,H,I, sırasıyla) AMPH B'ye benzer (Şekil S9 , S10 ). AMPHB ve FCZ antifungalleri, CI hücrelerinde aynı etkiye sahipti: hücrelerin yaklaşık %20'si etkileriyle öldürüldü (Şekiller).4B,Cve Şekil S8 ). Ps d1 ve AMPH B, üç suşun hepsinde aynı davranışa sahipti: CI suşunda antifungal etki ile daha az hücre ölümü indüklenirken, WT ve Δ gcs hücrelerinde artan ölüm gözlendi . Aksine FCZ, C. albicans suşlarında daha az ölü hücre (%30'dan az) gösterdi. C. albicans biyofilmlerinin AFM görüntülemesi
AMPH B, FCZ ve Ps d1'in C üzerindeki etkisini görüntülemek için AFM kullanıldı . planktonik hücreler için MIC'den 10 kat daha yüksek bir konsantrasyonda 24 saat inkübasyondan sonra albicans biyofilmleri (Şekil(Şekil 5).5). AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile tedavi edildiğinde CI ve WT suşları için biyofilm gelişiminin inhibisyonu gözlemlendi (veriler gösterilmemiştir). Biyofilm gelişiminin inhibisyonu, hif veya psödohifa olmadığını gösterdi. Tüm antifungal tedaviler için küçük gruplar halinde (4-8 hücre) tomurcuklanan maya hücreleri gözlendi. AMPH B varlığında CI, WT'ye kıyasla daha az etkilenmiş gibi görünmektedir. CI biyofilm görüntüleri (Şekil(Şekil5B)5B) hem yalancı hif hem de hif yokluğunu gösterir. AMPH B'nin etkisi, WT biyofilmi üzerinde daha belirgindi (Şekil(Şekil5F):5F): küçültülmüş boyutlu hücrelerle birlikte büyük deforme olmuş hücreler. Hem CI hem de WT için, hücreler tarafından açığa çıkarılan yüzeyin varlığı, AMPH B eylemi üzerine biyofilm biyokütlesindeki değişiklikleri kanıtlar. Bu etkiler FCZ ve Ps d1 ile daha dikkat çekiciydi . CI ve WT suşları için kaplanmamış yüzey alanı arttırıldı ve hacim kaybı gözlemlendi. 10 × MIC'deki FCZ, hücre hacmi ve boyutunda bir azalmaya neden oldu (Şekiller5C,G). Ps d1 hücre yüzeyinde önemli morfolojik değişikliklere neden olmuştur. 10 x MIC'de Ps d1 ile tedavi edilen CI için kabarcıkların ortaya çıkması ve hücre hacminin kaybı gözlendi (Şekil(Şekil5D).5D). WT, Ps d1'den daha az etkilenmiş gibi görünüyordu . Bununla birlikte, küçük kabarcıkların ortaya çıkması fark edilebilir (Şekil(Şekil5H).5H). Canlı ve ölü hücrelerin yüzdeleri deneysel olarak ölçülmüştür (Tablo S1 ). Gösterildiği gibi, AMPH B, FCZ ve Ps d1 ile karşılaştırıldığında biyofilm eradikasyonunda daha etkilidir .
Şekil 5
C. albicans suşlarının AFM hata görüntüleri eradikasyon deneyleri. AMPH B (B,F) , FCZ (C,G) ve Ps d1 (D,H) yokluğunda klinik izolat (A–D) , vahşi tip (E–H) ve Δ gcs (I) 10'da × MİK. Peptit oluşan biyofilmi yok ettiğinden, Δ gcs biyofilminin AMPH B, FCZ ve/veya Ps d1 ile antifungal tedavisine ilişkin hiçbir görüntü gösterilmemiştir. 10 × 10 μm 2 olan (D,H,I) hariç tüm görüntüler 15 × 15 μm 2 'dir . C. albicans biyofilmlerinin canlı/ölü hücre konfokal görüntülemesi -inhibisyon ve eradikasyon deneyleri
Mantar önleyici tedavilerden önce ve sonra maya hücrelerinin canlılığını değerlendirmek için, üç biyofilm “fazında” konfokal lazer tarama mikroskopi görüntüleri elde edildi: oluşan biyofilmin oluşumu, inhibisyonu ve eradikasyonu. Şekilde gösterildiği gibiŞekil6,6, tüm suşlar için oluşturulan biyofilm, birkaç noktada birbirine bağlı bir hif ağından ve tomurcuklanan maya hücrelerinden oluşan bir 3D mimarisi sundu. Miktar tayini üzerine, biyofilm oluşturulduktan sonra ölü hücrelerin yoğunluğunun tüm suşlar için düşük (yaklaşık %10) olduğu gösterildi (Şekiller).6A,E,I). İnhibisyon deneyleri için, antifungal tedaviden sonra hiçbir hücre büyümesi gözlenmedi. Verilerimiz, AMPH B, FCZ ve Ps d1'in, gelişim hızını azaltarak biyofilm oluşumunu engellediğini göstermektedir.
Şekil 6
Eradikasyon testleri. C'nin konfokal mikroskopi görüntüleri . albicans suşları klinik izolatı (A–D) , vahşi tip (E–H) ve Δ gcs (I–L) , AMPH B (B,F,J) yokluğunda (A,E,I) , FCZ (C,G,K) veya Ps d1 (D,H,L) , MIC'den 10 kat daha yüksek bir konsantrasyonda.
Eradikasyon deneyleri için, her suş için biyofilm geliştirildiğinde, antifungal 10 x MIC konsantrasyonunda ilave edildi ve 24 saat inkübe edildi. Elde edilen sonuçlar, Δ gcs suşu tarafından oluşturulan biyofilmin tamamen yok edildiğini göstermektedir (Şekil(Şekil6),6), CI'nin aksine (Şekiller6B–D) ve WT (Rakamlar6F–H), özellikle AMPH B ile tedavi edilen CI için biyofilm mimarisinin algılanabilir/fark edilebilir değişikliklere uğradığı ve ölü hücrelerin miktarının arttığı (Şekil(Şekil6B)6B) ve FCZ (Şekil(Şekil6C),6C) ve AMPH B ile tedavi edilen WT için (Şekil(Şekil6F6F).
Git: Tartışma
Bazı Candida türleri . suşları en yaygın antifungal ilaçlara karşı dirençli hale gelmektedir. Bu anlamda, enfeksiyonu in vivo yok etmek için bağışıklık sistemi boyunca hareket eden antimikrobiyal ajanlar oluşturmak için birçok çaba sarf edilmiştir . Ps d1, C'ye karşı antifungal etkileri olan bir AMP'dir . albicans . Bu peptidin etki modunu anlamak için , biri GlcCer sentaz geninde bir mutasyon ve bunun yanı sıra vahşi tipteki karşılığı olan üç C. albicans suşu üzerinde çalışılmıştır. Özetle, Ps d1 hücre yüzeyinde önemli morfolojik değişikliklere ve hücre ölümüne neden olmuştur. C. albicans'ın aderans testleriabiyotik yüzeye mutant, GlcCer'de eksik suş çalışması yoluyla GlcCer'in Ps d1 antifungal aktivitedeki önemini arttırdı (Lobo ve diğerleri, 2007 ). Aslında, bu çalışmada rapor edilen bazı gözlemler, Ps d1 etkilerinin C. albicans membranındaki bu lipidin varlığına bağlı olduğuna dair bu kanıtlarla uyumludur (Tyagi ve Malik, 2010a ; de Medeiros ve diğerleri, 2014 ; Rollin -Pinheiro ve diğerleri, 2016 ).
AMP'ler, morfoloji, boyut, yükseklik, pürüzlülük ve sertlik gibi hücrelerin fiziksel özelliklerini etkileme yetenekleri açısından test edilmiştir (Canetta ve diğerleri, 2006 ; Tyagi ve Malik, 2010a , b ; Kim ve diğerleri, 2011 ; Eaton ve diğerleri, 2012 ; Alsteens ve diğerleri, 2013a , b ; El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Formosa ve diğerleri, 2013 ). Önemli olarak, C. albicans hücre duvarı bileşimi, yapışma proteinlerinin ekspresyonu düzeyinde de dahil olmak üzere mantar önleyici muamele üzerine değiştirilebilir, bu nedenle hücre-hücre etkileşimlerini de etkiler (El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Formosa ve diğerleri. ,2013 ). Peptidik olmayan iki geleneksel antifungal ajan (AMPH B ve FCZ) ve bir doğal AMP ( Ps d1), C'de morfolojik değişikliklere neden olur . albicans (Alviano ve diğerleri, 1999 ). Ergosterol, mantar hücre zarının önemli bir bileşenidir. Doğrudan bağlanması (AMPH B) (Gray ve diğerleri, 2012 ) veya sentezinin inhibisyonu (FCZ) (Chang ve diğerleri, 2008 , 2014 ), hücresel içeriğin sızmasına neden olarak artan hücresel geçirgenlikle sonuçlanır. C. albicans için gözlemlenen değişikliklersuşları düşük antifungal konsantrasyonda ve kısa bir inkübasyon süresinde meydana geldi: hücre hacminde azalma, hücre yüzeyinde kabarcık veya soyma etkisi, pürüzlülüğün artması (Tyagi ve Malik, 2010a , b ) ve daha düşük bir yetenek hücrelerin birbirine yapışmasını sağlar (Alsteens ve diğerleri, 2013a , b ). Bunlar, AMPH B, FCZ ve Ps d1'in eylemiyle gösterilen ortak özelliklerdi . Ps d1 için gözlemlendiği gibi (Şekil(Şekil 4),4), soyulma benzeri bir yüzey deseni, C. albicans üzerinde sıklıkla indüklenen bir etki gibi görünüyordu . Burada sunulan sonuçlar, AMPH B, flusitozin (Kim ve diğerleri, 2011 ) ve kaspofungin (El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Formosa ve diğerleri, 2013 ) tarafından C. albicans hücrelerinde indüklenen bildirilen etkilerle uyumludur. ; Haşim ve diğerleri, 2016 ).
AMP'lerin etki modunu tanımlayan en yaygın olarak kabul edilen modeller arasında (Silva ve diğerleri, 2014 ), halı modeli, membran homojenliğinde daha büyük bir azalmaya neden olan etkileri daha iyi açıklayabilecek olanıdır ve bir deterjan- miselleşme gibi, zar direncinde bir kayıp (Chang ve diğerleri, 2008 ). Zayıflamış bir zar, bazı hücrelerde gözlenen hacim kaybını açıklayarak hücresel içeriğin sızmasına neden olarak bozulmaya maruz kalabilir (Şekil(Şekil 4).4). Hata sinyali görüntülerini gözlemleyerek, Ps d1 ile tedavi edilen hücrelerin kontrol hücreleri gibi veya hatta AMPH B veya FCZ ile tedavi edilen hücreler gibi kümelenmediğini fark etmek de mümkün oldu . Bu, Ps d1'in hücre-hücre yapışması üzerinde bir etkisi olduğunu kanıtlayabilir. Bu sonuç, hücre duvarında Ps d1 (El-Kirat-Chatel ve diğ., 2013 ; Haşim ve diğ., 2016 ) tarafından sağlanan destabilizasyon ve zar seviyesinde olası bir deterjan benzeri etki (Da Silva) ile açıklanabilir. ve Machado, 2012 ).
C. _ albicans planktonik hücreleri, AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile işlemden sonra yüzey pürüzlülüğünde önemli bir artış gösterdi . AFM yükseklik görüntülerinin yüzey analizi üzerine (Tyagi ve Malik, 2010a , b ; Domingues ve diğerleri, 2013 ; Franquelim ve diğerleri, 2013 ), hata sinyali görüntülerinde fark edilen membran pürüzlülüğündeki artışı ölçmek mümkün olmuştur. . Δ gcs hücrelerinin bu maddelerden daha az etkilenmesi, zaten daha pürüzlü olmalarına bağlı olabilir (Şekil 1).(Şekil2G)2G) CI ve WT suşlarından daha, AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile tedaviden önce bile.
Dış ajanların etkisinden kaynaklanan morfolojik değişiklikler, hücre sertliği üzerindeki değişikliklerle de ilişkilendirilebilir (El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Haşim ve diğerleri, 2016 ). AFM bazlı kuvvet spektroskopisi ölçümleri, Young modül hesaplaması yoluyla hücre elastikiyetinin nicelleştirilmesine izin verdi (Domingues ve diğerleri, 2013 ; El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Franquelim ve diğerleri, 2013 ). C. albicans , AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile tedaviden sonra sertliğini kaybeder. Δ gcs hücreleri, WT muadili ile karşılaştırıldığında ortalama hücre sertliğinde %18'lik bir azalma sundu (Şekil(Figür 3).3). Bunun nedeni GlcCer'in olmaması olabilir (Thevissen ve diğerleri, 2004 , 2012 ; Nimrichter ve Rodrigues, 2011 ). Seramidlerin membran sertliğini, stabilitesini ve biyolojik membranların yapısal organizasyonunu arttırdığı bilinmektedir (Sullan ve diğerleri, 2009 ). Hücre yüzeyi sertliği azalmasında AMPH B veya FCZ etkileriyle karşılaştırıldığında, Ps d1, kontrol örneğine göre sırasıyla %67 ve %57'lik düşüşlerle hem CI hem de WT hücreleri üzerinde daha güçlü bir etkiye sahipti (Şekil(Figür 3).3). Ps d1'in Δ gcs hücre yüzeyinin sertliği üzerinde önemli ölçüde daha düşük bir azalmaya neden olması (%34), bu defensinin , daha önce önerildiği gibi (de Medeiros ve diğerleri, 2010 , 2014 ; Gonçalves ve diğerleri, 2012 ; Rollin-Pinheiro ve diğerleri, 2016 ). Δ gcs hücrelerinin sertliğinde AMPH B tarafından yönlendirilen güçlü azalma (%60, ŞekilFigür 3)3), bu mantar önleyici ilacın hücre yüzeyinde oluşturduğu gözenekler ile hücre zarındaki GlcCer eksikliği arasındaki sinerjistik bir etkiden kaynaklanabilir. AMPH B'nin ergosterole bağlanması geri döndürülemez olduğundan (Filippin ve diğerleri, 2008 ), C. albicans hücrelerinde GlcCer yokluğu ile birlikte, hücrenin, hücre yüzeyinde antifungal etkinin neden olduğu hasarı onarmasının bir yolu yoktur. kararsız ve daha düşük dirençli (Leipelt ve diğerleri, 2001 ).
Ps d1 ile muameleden sonra C. albicans'ın AFM faz kontrast görüntülerine bakıldığında (Şekil S7 ), yüzeyinde, hata sinyali görüntülerinde görülen kabarcıkların lokalizasyonu ile örtüşen daha yumuşak alanları gözlemlemek mümkün olmuştur. Bu daha yumuşak alanlar muhtemelen peptidin hücre yüzeyi üzerinde birikmesinden kaynaklanan bir etkidir, sonuçta deterjan benzeri bir şekilde hareket ederek lipidlerin düzensizleşmesine ve miselleşmesine ve sonuç olarak da kararsız hücre zarı ve duvarına yol açar.
Bir antimikrobiyal peptitin hücre ölümünü indükleme kabiliyeti, hedef(ler)ine karşı, genellikle hücre duvarı ve/veya membran seviyesinde hareket ettiği mekanizma ile ilişkilidir. Peptidin bulduğu zar tipinin önemi önemlidir; bu nedenle, suşlar arasındaki farklılıklar beklenebilir. CI hücreleri için, burada test edilen moleküllerin hiçbiri (AMPH B, FCZ ve Ps d1) önemli bir canlılık kaybına neden olmadı (Şekiller).4B,Cve Şekil S3 ), bu sadece peptidin bu hücrelerdeki etki modu ile açıklanabilir. Zarda bile, hasta hücrelerinde GlcCer moleküllerinde veya zardaki oryantasyonda bazı küçük biyokimyasal değişiklikler olabilir, bu da peptidin etki mekanizmasını etkiler (Rollin-Pinheiro ve diğerleri, 2016 ). Bununla birlikte, peptidin bu tip hücrelerde etki ederek hücrelerin pürüzlülüğünü ve sertliğini azalttığı diğer sonuçlardan açıktı (Şekiller).(Şekiller2,2,,3,3, sırasıyla), bu AMP'nin ölümü indüklemesi veya hücre zarını geçirgenleştirmesi zorunlu değildir, bu da ölü hücreler için neden hiçbir pozitif sonuç olmadığını açıklar.
Ps d1 , kullanılan konsantrasyondan bağımsız olarak, geleneksel mantar önleyici moleküllerden (AMPH B ve FCZ) WT C. albicans üzerinde daha güçlü bir etkiye sahipti . Ek olarak, ölü hücrelerin yüzdesinin WT için Δ gcs hücrelerinden daha yüksek olması dikkat çekiciydi (Şekiller) .4D,F,H,I) (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ). Δ gcs hücrelerinin zarında GlcCer'in olmaması, mantar virülansında önemli bir rol oynadığı için bu lipide ilişkin önceki gözlemleri açıklayabilir (Thevissen ve diğerleri, 2003 , 2012 ; Barreto-Bergter ve diğerleri, 2004 ). Her bir suş için hangi mekanizmanın baskın olduğu açık olmasa da, bireysel defensinlerin etki şekline ilişkin bildirilen açıklamalar hücre duvarına bağlanma, sinyal kaskadlarının indüklenmesi ve hücre içi hedeflerle etkileşim, apoptoza yol açma, membran geçirgenliği ve reseptör- aracılı içselleştirme (Thevissen ve diğerleri, 2004 ; de Medeiros ve diğerleri, 2010 ; Van Der Weerden ve diğerleri,2013 ). P sd1'in N. crassa hücre döngüsü proteini siklin F ile etkileşime girdiği ve hücre döngüsünü durdurduğu göz önüne alındığında (Lobo ve diğerleri, 2007 ), son zamanlarda, hücrelere giren ve hücre içi bir hedefle etkileşime giren C. albicans için de aynısı rapor edilmiştir . hücre ölümüne yol açar (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ).
Ps d1'in ilk önce mantar duvar seviyesinde etki ederek polisakkarit matrisini ayrıştırdığına ve mannoproteinler, β-glukanlar ve kitinden oluşan duvarı bozduğuna inanıyoruz. Bu, hücre pürüzlülüğünü artırarak ve sertliğini azaltarak hücre duvarının bütünlüğünü etkiler. Peptit hücre zarına ulaştığında, C'deki glukosilseramidlerle etkileşime girer . albicans membranı oluşturur ve hücre içi etkiyi indükler. Daha sonra, Ps d1'in hücre içi birikimi , daha önce C. albicans için tarif edildiği gibi (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ), N. crassa (Lobo ) için bulunana benzer şekilde hücre döngüsü kontrol proteini siklin F'ye müdahale eder. ve diğerleri,2007 ), bu da mantar patojeninin apoptozuna yol açar.
Planktonik hücrelerin abiyotik bir yüzeye ve diğer hücrelere yapışma yeteneği önemli bir virülans faktörüdür ve özellikle biyofilm oluşumu için önemlidir. Bu yeteneği engelleyerek, C. albicans biyofilmlerine karşı Ps d1 testi son derece alakalı hale gelir. Biyofilmler, planktonik hücrelere kıyasla artan ilaç direnci sergiler (Şekiller).(Şekil1,1,,5,5, sırasıyla). Bazı mantar önleyici moleküllerin etki tarzındaki değişiklikler, planktonikten sapsız hücre durumlarına (biyofilm) kadar değişir. Bu, C üzerinde AMPH B, FCZ ve Ps d1 için geçerlidir . albicans biyofilmleri (Şekiller(Şekil5,5,,6).6). Yüksek oranda karbonhidrat, protein, heksozamin, fosfor ve ürik asit içeren ekzopolimerler açısından zengin maddelerle çevrili biyofilmin karmaşık yapısı, dış etkenlerin penetrasyonunu kısıtlayarak etkilerini azaltabilir (Şekiller).(Şekil5,5,,6)6) ve artan biyofilm yaşam süresi.
Bu çalışma , daha önce araştırılmamış olan Pisum sativum defensin 1 antifungal aktivitesinin bazı yönlerini aydınlatmaktadır . Ps d1 , hücrelerin yapışma yeteneğini engelleyerek , C. albicans hücrelerinin enfekte olmuş dokuya yapışmasını azaltarak bir enfeksiyonun çoğalmasını önlemeye de katkıda bulunabilir . Ps d1'in, yüksek oranda hücre-substrat ve hücre-hücre yapışmasına (Alsteens ve diğerleri, 2013a , b ) ve ayrıca çekirdek algılamaya (Kruppa, 2009 ) bağlı olan biyofilm oluşumuna müdahale edebileceğini düşünmek de mümkündür . Toplamda, C. albicans'ın morfolojik formlarının (mantar pleomorfizmi) kabiliyeti Ps tarafından engellendi.d1 (Şekiller(Şekil1,1,,55).
AMP'lerin yapısından ve dizisinden ilham alan yeni moleküllerin moleküler tasarımı ve sentezi, yeni ve kapsamlı bir uygulama alanı açmak için umut verici bir yaklaşım gibi görünmektedir (Ören ve diğerleri, 1997 ; Wu ve diğerleri, 2003 ; McPhee ve diğerleri, 2005 ). ), antimikrobiyal tedaviden aşı adjuvanları olarak olası kullanımlarına kadar. Bu nedenle, konak savunma peptitlerinin işlev ve etki mekanizmasının daha iyi anlaşılması, anti-enfektif ve immünomodülatör terapötiklerde büyük bir vaattir. Önceki çalışmamız, Ps d1'in mantar zarlarını taklit eden bileşimdeki zarlarla etkileşime girdiğini gösterdi (Gonçalves ve ark., 2012 ).). Ergosterol ve GlcCer içeren zarlarla güçlü etkileşimler rapor edilirken, kolesterol içeren zarlarla hiçbir etkileşim, memeli hücrelerinde (kolesterol açısından zengin zarlarla) azaltılmış toksisiteyi haklı çıkarır. Burada, Ps d1'in C üzerinde güçlü ve pleiotropik bir antifungal aktiviteye sahip olduğunu gösteriyoruz . albicans ve GlcCer'in mantar zarlarının önemli bir bileşeni olarak öneminin altı çizildi.
Git: Yazar Katkıları
Deneyleri tasarladı ve tasarladı: SG, Ld, EK ve NS. Deneyleri gerçekleştirdi: SG, PS, MF ve Ld. Verileri analiz etti: SG, PS, MF ve Ld. Makaleyi yazdı: SG, PS, MF, Ld, EK ve NS. Çıkar çatışması beyanı
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda gerçekleştirildiğini beyan eder.
Git: Teşekkür
Bu çalışma Fundação para a Ciência ea Tecnologia – Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (FCT-MCTES, Portekiz), FP7-IRSES projesi MEMPEPACROSS (Avrupa Birliği), Marie Skłodowska-Curie Araştırma ve Yenilik Personel Değişimi (MSCA-) tarafından finanse edilmiştir. RISE) projesi INPACT (çağrı H2020-MSCA-RISE-2014, hibe sözleşmesi 644167, Avrupa Birliği) ve CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Brezilya). MF ayrıca FCT-MCTES Doktora bursu SPRH/BD/100517/2014'ü de kabul eder.
Git: Ek materyal
Bu makalenin Ek Malzemesi çevrimiçi olarak şu adreste bulunabilir: http://journal.frontiersin.org/artic...ntary-material
Ek veri dosyası için buraya tıklayın. (1,7 milyon, pdf)
Git: Referanslar
Sónia Gonçalves , 1, * Patricia M. Silva , 1 Mário R. Felício , 1 Luciano N. de Medeiros , 2 Eleonora Kurtenbach , 2 ve Nuno C. Santos 1, *
Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk Reddi
Bu makale, PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır . İlişkili Veriler
Ek Malzemeler
Git: Soyut
Candida albicans , fırsatçı enfeksiyonlara neden olan önemli bir insan patojenidir. Planktonik hücrelerin bir substrata yapışması, biyofilm gelişimi için ilk adımdır. Antimikrobiyal peptit (AMP) Ps d1, Pisum sativum tohumlarından izole edilen bir defensindir . Bu AMP'nin C. albicans biyofilmleri ve planktonik hücreleri üzerindeki etkilerini, aktivitesini amfoterisin B ve flukonazol ile karşılaştırarak test ettik. Üç C. albicans varyantı üzerinde çalışıldı; bunlardan biri, glukosilseramid sentazdan yoksun, Ps'ye direnç veren bir mutantd1 mantar önleyici etki. Mantar hücreleri üzerindeki morfolojik ve biyomekanik değişiklikleri değerlendirmek için atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanıldı. Membran bozulması ve hücresel içeriğin sızıntısı ile yüzey değişiklikleri gözlendi. Sitometri deneyleri ve konfokal mikroskopi görüntüleme, Ps d1'in zamana ve konsantrasyona bağlı bir şekilde hücre ölümüne neden olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar, ilgili bir mantar insan patojenine karşı Ps d1 pleiotropik etkiyi gösterir ve bunun doğal bir antimikotik ajan olarak kullanılmasını önerir.
Anahtar Kelimeler: antimikrobiyal peptitler, atomik kuvvet mikroskobu, Candida albicans , biyofilm, konfokal mikroskopi
Git: Tanıtım
Candida albicans , özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda önemli olan oral, genital ve sistemik mantar enfeksiyonlarına neden olan fırsatçı bir insan patojenidir (Berman ve Sudbery, 2002 ). Mevcut antifungal tedavilere rağmen, bu patojenin neden olduğu mortalite ve morbidite hala yüksektir (Behnsen ve ark., 2008 ).). İntravenöz hatlar ve biyoprostetik cihazlarla ilişkili kandidiyazis problemlidir, çünkü bu cihazlar biyofilm büyümesi için substrat görevi görebilir. Biyofilmlerin varlığı, antimikrobiyal ajanlara karşı dirençleri nedeniyle ciddi sorunlara neden olabilir. Bu direnç, biyofilm topluluklarının inşası ve/veya çözülmesi için mevcut mantar popülasyonunun yerel yoğunluğuna dayalı olarak, biyofilm oluşumunda ve virülansında önemli bir rol oynayan çekirdek algılayıcı moleküllerin mevcudiyeti ile geliştirilmiştir (Donlan, 2002 ; Kruppa). , 2009 ; Deveau ve Hogan, 2011). Serbest yüzen planktonik hücreler ile biyofilm büyümesi arasında ince bir çizgi vardır. Aslında biyofilm gelişimi, planktonik hücreler substrata yapıştığında başlar. Yapışık/yapışkan hücreler büyür ve bölünerek salgılanan ekzopolisakkaritleri (EPS'ler) içeren koruyucu bir matris oluşturur (Donlan, 2002 ; Kruppa, 2009 ; Deveau ve Hogan, 2011 ). EPS'ler, bir biyofilmin hacmine ve yapışkan makroskopik özelliklerine katkıda bulunur. Tamamen gelişmiş bir biyofilm, sıvı dolu mikrokanallar tarafından yükselen ve nüfuz eden hücre katmanları ile yüksek düzeyde yapılandırılmıştır (Donlan, 2002 ).). Bu dinamik topluluklar yüzeylere yayılabilir, çevredeki partikülleri ve diğer mikropları içerebilir ve sürekli olarak yeni planktonik hücreler yayabilir (Stephens, 2002 ). C. _ albicans , çeşitli yüzeylerde tutunma, kolonize olma ve biyofilm oluşturma yeteneğine sahiptir. Bir patojen olarak C. albicans'ın önemi , hastalığı kontrol etmek ve saptamak için yeni stratejilerin geliştirilmesi konusunda önemli bir çabaya yol açmıştır (Srinivasan ve ark., 2011 ).
Mantarlar, antifungal ajanlar için hedef olarak hizmet edebilen benzersiz bir hücre duvarına ve hücre zarına sahiptir. Fungal hücre zarı, ana sterolü ergosterol olan ve içinde proteinlerin gömülü olduğu bir lipid çift tabakasından oluşan diğer ökaryotik hücrelere benzer (Katzung ve diğerleri, 2011 ). Glikosfingolipidler (GSL), hayvanlarda, bitkilerde ve mantarlarda biyolojik zarların temel bileşenleri olarak işlev gören bir lipid ailesidir (Leipelt ve diğerleri, 2001 ; Halter ve diğerleri, 2007 ; Daniotti ve Iglesias-Bartolome, 2011 ). Mantarlarda bulunan en yaygın GSL, Pichia pastoris, C. albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Sporothrix schenckii gibi çoğu mantarın hücre zarında bulunan glukosilseramiddir (GlcCer).ve Neurospora crassa (Barreto-Bergter ve diğerleri, 2004 ; Saito ve diğerleri, 2006 ). Bu glikosfingolipidin büyük miktarları mantar hücre duvarında da bulunmuştur (Nimrichter ve Rodrigues, 2011 ). Mantar büyümesi/dimorfizm sırasındaki işlevleri, virülans süreci ile ilişkilendirilmiştir (Rittershaus ve diğerleri, 2006 ), bu da GSL'nin yeni mantar önleyici ilaçların geliştirilmesinde potansiyel hedefler olduğunu düşündürür (Rittershaus ve diğerleri, 2006 ; Nimrichter ve Rodrigues, 2011 ; Gonçalves ve diğerleri, 2012 ).
Antimikrobiyal peptitler (AMP'ler), hem hidrofobik hem de hidrofilik kalıntılara sahip olan ve amfipatik yapılarla sonuçlanan kısa diziler (genellikle 15-50 amino asit kalıntısı) ile karakterize edilen katyonik moleküllerdir. Bitki, mantar veya hayvan kaynaklı endojen AMP'ler, kendilerini patojenik mikroplardan korumak için üretilir. Bu adaptif mekanizma, onları doğuştan gelen bağışıklık sistemi için gerekli kılar. AMP'lerin terapötik aktivitesi, bakterilere, mantarlara, protozoan ve metazoan parazitlere, virüslere, cilt hastalıklarına ve tümör hücrelerine karşı ortaya çıkar (Li ve diğerleri, 2012 ; Morizane ve Gallo, 2012 ; Torrent ve diğerleri, 2012 ). Terapötik aktiviteleri ve etki biçimleri hakkında kapsamlı bilgiler başka bir yerde verilmiştir (Silva ve ark., 2014 ).). Bu doğal antibiyotiklerin ek avantajı, antibiyotiğe dirençli mikrobiyal suşların gelişimine yatkın olmamalarıdır (Korting ve diğerleri, 2012 ).
Ps d1, bahçe bezelyesinin ( Pisum sativum ) tohumlarından izole edilen, sistein açısından zengin 46 amino asit tortulu bir defensindir (Almeida ve diğerleri, 2000 , 2002 ; Cabral ve diğerleri, 2003 ; de Medeiros ve diğerleri, 2010 ) . Esas olarak epidermal dokularda ve bezelye kabuklarının damar demetlerinde bulunur. Bu peptit, birkaç filamentli mantara ve dimorfik C'ye karşı yüksek antimikrobiyal aktivite sergiler . albicans ve N. _ crassa , ancak test edilen birkaç bakteriye karşı değil (Almeida ve diğerleri, 2000 , 2002 ; Lobo ve diğerleri, 2007 ; de Medeiros ve diğerleri,2010 ). 20 uM'de Ps d1'in, C. albicans vahşi tipinin (WT) %100 büyüme inhibisyonuna neden olduğu, buna karşılık karşılık gelen C. albicans gcs -silinmiş suşunun (Δ gcs ) %70 inhibisyonuna sahip olduğu gösterilmiştir (de Medeiros ve ark . ., 2014 ). Son zamanlarda, membran bölme çalışmaları yoluyla, Ps d1'in mantar hücrelerinde olduğu gibi ergosterol ve GlcCer içeren membranlar için yüksek afinite ve özgüllüğe sahip olduğunu gösterdik (Gonçalves ve diğerleri, 2012 ). Aksine, bu defensin, kolesterol açısından zengin membranlarla düşük etkileşime sahiptir ve Ps d1'in insan hücrelerine karşı azaltılmış toksisitesini açıklar (Gonçalves ve diğerleri, 2012 ). EksikliğiC'de Ps d1 içselleştirme . albicans mutant suşu (A gcs ), konfokal mikroskopi ile gösterilmiştir (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ). Birlikte, bu sonuçlar GlcCer'in mantar plazma zarı ile Ps d1 etkileşimi ve bunun içselleştirilmesi için önemli olduğunu gösterdi.
Bu çalışmada, Ps d1'in etki modu, üç farklı Candida albicans suşunun hücre morfolojisi, pürüzlülüğü ve sertliği üzerindeki etkilerinin nano ölçekte değerlendirilmesi yoluyla değerlendirildi . İncelenen varyantlar için planktonik hücreler ve biyofilmler arasındaki farklar bulundu. İşlenmemiş ve tedavi edilmiş C'nin konfokal mikroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleri . albicans hücreleri, Ps d1'in planktonik hücreleri 20 μM'de öldürdüğünü gösterirken, biyofilmin toplam inhibisyonu ve kısmen yok edilmesi sadece 10 kat daha yüksek bir konsantrasyonda gözlemlendi. C . _ albicans Δ gcsmutant, hem biyofilmler hem de planktonik hücreler için peptidin yokluğunda bile hücre morfolojisinde ve pürüzlülüğünde değişiklikler gösterdi. Ps d1 varlığında planktonik hücrelerin yapışması azalmış ve biyofilmin tamamen inhibisyonu ve/veya eradikasyonu gözlenmiştir. Bu sonuçlar , GlcCer'in oldukça alakalı olduğu Ps d1-mantar membran etkileşimi için birkaç anahtar yönü göstermektedir. Ek olarak, verilerimiz defensinin hücre içinde meydana gelen antimikrobiyal etkisinin ek bir bileşeniyle birlikte pleiotropik bir etkiye sahip olduğunu gösterir.
Git: Malzemeler ve yöntemler
Candida albicans kültürlerinin hazırlanması
Üç Ç . albicans suşları çalışıldı: Santa Maria Hastanesi'ndeki (Lizbon, Portekiz) bir hastadan toplanan bir klinik izolat (CI), SC5314/ATCC MYA-2876 (WT) ve SC5314 CAI4 ura3 Δ ::imm434/ura3 Δ ::imm434 ( Δ gcs ), SC5314'e benzer, lütfen Dr. Dirk Warnecke (Institut für Allgemeine Botanik, Hamburg Üniversitesi, Almanya) tarafından sağlanmıştır. Δ gcs'de , glukosilseramid sentaz geni (HSX11) bozuldu ve suşun glukosilseramid lipidi üzerinde yetersiz kalmasına neden oldu (Leipelt ve diğerleri, 2001 ).). Suş stokları -80°C'de %15 gliserol ile tutuldu. Stokta önceden çözülmüş hücreler Maya Pepton Dekstroz (YPD, Sigma Aldrich, ABD) agar plakalarına aşılandı ve 48 saat 37°C'de inkübe edildi. Bu süreden sonra, izole edilmiş bir mantar kolonisi, YPD broth içinde 180 rpm'de çalkalanarak 25°C'de gece boyunca kültürlendi. Bu süre zarfında kültür, büyümenin durağan aşamasına ulaşır. Hücreler, 1.880 g'de santrifüjleme ile toplandı4°C'de 10 dakika süreyle, süpernatan çıkarıldı ve hücreler, planktonik çalışmalar için 150 mM NaCl içeren 10 mM HEPES tamponu pH 7.4 ile ve 10 mM fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 2.7 mM potasyum klorür, 137) ile üç kez yıkandı. Biyofilm deneyleri için mM sodyum klorür) pH 7.4. Daha sonra hücre konsantrasyonu belirlendi ve ilk süspansiyon, her deney için gerekli konsantrasyona seyreltildi. Planktonik C. albicans'ın amfoterisin B, flukonazol ve Ps d1'e duyarlılığı
Minimal inhibitör konsantrasyonu (MIC) belirlemek için in vitro antifungal duyarlılık testleri yapıldı. Ulusal Klinik Laboratuvar Standartları Komitesi'nin (Klinik Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi, 1997 ) tavsiyesine göre, mikrodilüsyon yöntemiyle, 96 kuyulu mikroplakalarda belirlenmiştir (Brito ve diğerleri, 2010 ; Eksi ve diğerleri, 2013 ).). L-glutaminli (Gibco-Life Technologies, UK) RPMI 1640 ortamı kullanıldı, %0.2 glikoz, 165 mM MOPS (3-morfolinopropansülfonik asit) (AppliChem, Almanya) ile desteklendi ve pH 7.4'e tamponlandı. Karşılaştırma amacıyla ve pozitif kontrol olarak, geleneksel antifungal ilaçlar amfoterisin B (AMPH B) ve flukonazol (FCZ) (Sigma Aldrich, ABD) de seçilen suşlara karşı test edildi. Her oyuk, büyüme ortamı (RPMI), farklı AMPH B veya FCZ konsantrasyonları (0.001 ila 100 ug/ml) ve C ile toplam 200 ul hacme hazırlandı . albicans (2 × 10 3hücreler/ml). Antifungal içermeyen kontroller de test edildi. Plakalar 48 saat 37°C'de inkübe edildi, ardından optik yoğunluk 540 nm'de ölçüldü. MIC, inkübasyondan sonra bir organizmanın %100 büyüme inhibisyonuna neden olan bir ilacın minimum konsantrasyonu olarak tanımlandı (Andrews, 2001 ). Deneyler üç kopya halinde yapıldı ve değerler, MIC belirlemesi için Gompertz denklemi kullanılarak GraphPad Prism 5 ile analiz edildi (Lambert ve Pearson, 2000 ). Ps d1 ile deneyler , 90 ug/ml (20 uM)'de gerçekleştirilmiştir (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ). Biyofilm geliştirme ve XTT/menadion testi testi
C'nin oluşumu ve duyarlılıkları . albicans biyofilmleri, 96 oyuklu plaka bazlı yöntemle belirlendi (Pierce ve diğerleri, 2008 ). Her suş için biyofilm oluşumu için optimal hücre konsantrasyonunu belirlemek için 100 µl C. albicans süspansiyon hücreleri RPMI 1640 içinde, 1,0 × 105 , 1.0 × 106 , 1.0 × 107 ve 1.0 × 108'de glikoz % 2 ve 165 mM MOPS ilehücreler/ml polistiren 96 oyuklu bir plaka üzerine yerleştirildi, her numune üç kopya halinde. Plakalar, biyofilm gelişimi için optimal hücre konsantrasyonunu oluşturmak amacıyla 37°C'de 12, 24, 48, 72 ve 96 saat süreyle inkübe edildi. Her adım süresinin sonunda (inkübasyon süresi), biyofilm, planktonik ve/veya yapışmayan hücreleri çıkarmak için üç kez PBS ile yıkandı. Bu noktada 100 µl XTT/menadion solüsyonu (10 ml XTT 0.5 g/l içinde 1 µl menadion 1 mM) her bir kuyucuk plakasına (biyofilmin oluştuğu yer) ilave edildi ve 2 saat 37°C'de inkübe edildi. Bu süreden sonra turuncu bir renk, biyofilm içindeki hücrelerin metabolik aktivitesini ortaya çıkarır. Süpernatanlar yeni bir plakaya aktarıldı ve optik yoğunluk 490 nm'de ölçüldü. Atomik kuvvet mikroskobu görüntüleme
Tüm C. albicans suşları için planktonik hücre görüntülemesi aşağıdaki gibi yapıldı, 1 x 105 hücre/ml HEPES tamponu içinde 25°C'de 6 ve 24 saat çalkalanarak inkübe edildi. AMPH B, FCZ ve Ps d1 nihai konsantrasyonları MİK'e eşit ve MİK'ten 10 kat daha yüksekti. Kontrol olarak, antifungal tedavisi olmayan hücreler kullanıldı. Her test örneğinden 100 ul damla, poli-L-lizin (PLL) kaplı bir lamel üzerine uygulandı ve 2 saat 25°C'de bırakıldı. Biriktirmeden sonra, numuneler filtrelenmiş (0,2 µm) deiyonize su ile 10 kez durulanmış ve 25°C'de havada kurutulmuştur.
Muamele edilmemiş ve muamele edilmiş hücreler, bir Zeiss Axiovert 200 ters mikroskobu (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Almanya) üzerine monte edilmiş bir JPK NanoWizard II atomik kuvvet mikroskobu (JPK Instruments, Berlin, Almanya) kullanılarak görüntülendi. Ölçümler, aralıklı temas modunda, oda sıcaklığında, kaplanmamış silikon ACL konsolları (Applied NanoStructures, Mountain View, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu konsollar, 145-230 kHz'lik tipik rezonans frekanslarına ve 20-90 N/m'lik yay sabitlerine sahiptir. Görüntüleme için tarama hızı 1 Hz'den daha az olarak ayarlandı ve görüntü çözünürlüğü tüm görüntüler için 512 × 512 piksel olarak ayarlandı. Yükseklik, hata sinyali ve faz kontrast görüntüleri kaydedildi ve gerektiğinde hatta takıldı. Kaydedilen görüntülerden yükseklik ve boyut bilgileri JPK Veri İşleme yazılımı v.4.2.53 ile elde edilmiştir.
AFM yükseklik görüntülerinin pürüzlülük analizi, Gwyddion 2.31 yazılımı (Çek Metroloji Enstitüsü, Brno, Çek Cumhuriyeti) kullanılarak yapıldı. Pürüzlülük, kök ortalama kare değerinden hesaplanmıştır (RMS, yani 1 × 1 µm 2 görüntülü alan üzerinde yükseklik dağılımının standart sapması). Bu işlemenin sonuçları, varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni son testleri kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi. AFM tabanlı hücre sertliği ölçümleri
C. albicans yıkanmış süspansiyonları, oda sıcaklığında çalkalanarak 24 saat süreyle inkübe edildi. AMPH B, FCZ ve Ps d1 nihai konsantrasyonları, MIC'den 10 kat daha yüksekti. Nihai hücre konsantrasyonu 1 x 105 idihücre/ml ve kontrol olarak hücre numuneleri herhangi bir işlem görmeden inkübe edildi. Her numuneden 100 ul bir poli-L-lisin (PLL) kaplı cam lamel üzerine yerleştirildi ve 2 saat 25°C'de bırakıldı. Biriktirmeden sonra, lamel yapışmamış hücreleri çıkarmak için numuneler HEPES tamponu ile 10 kez durulandı. Numunenin kurumasını önlemek için yapıştırılan hücrelere 100 µl HEPES tamponu eklendi. Ölçümler, 25°C'de HEPES tamponunda, 200 um uzunluğunda altın refleks kaplı silikon nitrür OMCL-TR400PSA-1 konsollar (Olympus, Japonya) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu konsollar, 8-14 kHz'lik tipik rezonans frekanslarına ve yaklaşık 0.02 N/m'lik yay sabitlerine sahiptir.
İlk olarak, hücrelerin şekli ve yüksekliği hakkında önceden bir genel bakışa sahip olmak için, 10 µm/s'lik bir yaklaşım ve geri çekme hızı, 3 µm'lik Z uzunluğu ve 0,4 V'luk bir bağıl ayar noktası kullanılarak kuvvet haritaları yapıldı. Haritadaki koordinatlar sonra seçildi. Daha sonra, her hücre için bir konum seçildi ve 3 μm/s yaklaşma ve geri çekme hızı, 3 μm Z uzunluğu ve 0,4 V nispi ayar noktası kullanılarak bu koordinatlar üzerinde üç kopya halinde kuvvet-mesafe ölçümleri yapıldı. koşullar, tanımlamanın hücre yüksekliğinin %5 ila %10'u arasında olmasını sağlar. Geri çekme kuvveti-mesafe eğrileri, JPK Veri İşleme yazılımı v. 4.2.53 ile işlendi. İşlemden sonra, eğrilere dört taraflı piramit Hertz modifiye denklemi uygulandı ve Young modülü elde edildi. Biyofilm inhibisyonu ve eradikasyon testleri
Biyofilm geliştirme deneylerinde elde edilen hücre koşulları kullanılarak biyofilm inhibisyonu ve eradikasyon deneyleri belirlendi. Her suş için hücre konsantrasyonları belirlendikten sonra, AMPH B, FCZ ve Ps konsantrasyonlarıBiyofilm inhibisyonu ve eradikasyon deneyleri için kullanılan d1, MIC'den 10 ve 100 kat daha fazlasına karşılık gelir. İnhibisyon deneylerinde, mantar önleyici ilaçlar hücrelerle aynı zamanda (antifungal hücrelerle önceden karıştırılarak) yerleştirildi ve daha önce biyofilm gelişimi için belirlenen aynı adım süresi sırasında inkübe edildi. Eradikasyon deneyleri için, her suş için biyofilm oluşturulduktan sonra antifungaller eklendi ve 24 saat 37°C'de inkübe edilmeye bırakıldı. Her iki durumda da biyofilm ortamı, mikroskopi ölçümleri için PBS ile değiştirildi. AFM görüntüleme için, biyofilmler 10 kez filtrelenmiş deiyonize su (0.2 um) ile yıkandı ve oda sıcaklığında havayla kurutuldu. C'nin oluşumu, inhibisyonu ve eradikasyonu için biyofilm görüntüleri . albicans suşları, hücrelerin büyütüldüğü yüzeyde doğrudan ölçüldü. Konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi ile biyofilmlerin ve plancktonik hücrelerin Canlı/Ölü ölçümleri
Hem C. albicans biyofilmlerinde hem de plancktonik hücrelerde Canlı/Ölü tahlil kiti kullanıldı . LIVE/DEAD® Funga Light™ Maya Canlılık Kiti ( L34952 , LifeTechnologies, ABD) iki floresan prob, SYTO 9 ve propidium iyodürden (PI) oluşur. Canlı ve ölü hücrelerden oluşan bir popülasyonda, SYTO 9 nükleik asit, bir popülasyondaki tüm mayaları, zarları sağlam olanlar ve zarları hasarlı olanlar olarak etiketler. Buna karşılık, PI yalnızca membranları hasarlı mayaya nüfuz eder ve her iki boya da mevcut olduğunda floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile SYTO 9 leke floresansında bir azalmaya neden olur (Johnson ve Spence, 2010 ).). Sonuç olarak, zarları sağlam olan maya yeşil floresan ile boyanırken, zarları hasarlı maya kırmızı floresan ile boyanır.
Bir Zeiss LSM 510 META konfokal nokta tarama mikroskobu (Jena, Almanya) ile optik mikroskopi deneyleri, antifungal ajanlara maruz kalmadan önce ve sonra hücrelerin yapısını ve canlılığını incelemek için yapıldı. Argon (488 nm; 45 mW) ve diyot pompalı katı hal (561 nm; 15 mW) lazerler, 40 x kuru hedef ile kullanıldı. Hücreler, görüntülemeden önce 24 saat AMPH B (10 mg/ml), FCZ (40 mg/ml) veya Ps d1 (900 ug/ml) ile inkübe edildi. Bu mantar önleyici konsantrasyonlar, planktonik MIC'den 10 kat daha fazla olacak şekilde seçilmiştir. Daha sonra biyofilmler SYTO 9 ve PI probları ile etiketlendi, 15 dakika inkübe edildi ve görüntüler alındı. Görüntüler ImageJ 1.47v (rsbweb.nih.gov/ij/) ile analiz edildi.
Akış sitometrisi deneyleri için, C. albicans suşları , planktonik MIC'ye eşit ve 10 kat daha yüksek antifungal konsantrasyonla AMPH B, FCZ ve Ps d1 ile 24 saat süreyle inkübe edildi. Yeşil boya tüm hücrelerde mevcut olduğundan ve FRET fenomeninin yanı sıra yeşil floresan yoğunluğunun her zaman küçük bir katkısı olduğundan, çift etiketli hücreler ölüm için pozitif sonuç olarak kabul edildi. C. albicans boyamaları üreticinin talimatlarına göre yapıldı. Kısaca 1 × 10 5HEPES tamponundaki hücreler/ml, her iki boya ile 3.34 ve 20 uM'lik bir nihai konsantrasyona kadar boyandı (sırasıyla SYTO 9 ve PI). Akış sitometrisi analizinden önce tüm numuneler oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika tutuldu. Deneyler, lekeli hücreleri uyarmak için mavi (488 nm) ve kırmızı (640 nm) lazerler kullanılarak bir BD Accuri C6 Akış Sitometresinde (BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) yapıldı. Yeşil floresan emisyonu 530 nm bant geçiren filtre ile ve kırmızı floresan emisyonu 670 nm bant geçiren filtre ile tespit edildi. Floresan emisyonu biyo-üssel ölçekte elde edildi ve 40 000 hücre için veriler toplandı. Tüm akış sitometresi sonuçları, FlowJo Yazılımı sürüm 10.0x (Tree Star Inc., Ashland, OR, ABD) kullanılarak analiz edildi.
Git: Sonuçlar
Planktonik C. albicans'ın AMPH B, FCZ ve Ps d1'e duyarlılığı
AMPH B ve FCZ'nin üç C. albicans suşuna karşı aktivitesi, Şekil S1'de (Ek Malzeme) gösterildiği gibi antifungal ilaçlara duyarlılıkları ölçülerek belirlendi . Elde edilen eğriler uyduruldu ve MIC değerleri Gompertz denklemi kullanılarak elde edildi (Lambert ve Pearson, 2000 ). Ps d1 için kullanılan değerler önceki çalışmalarda (20 μM) rapor edilmiştir (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ). Şekil Sl'de gösterildiği gibi , AMPH B ve FCZ için MIC değerleri, çalışılan suşa bağlı olarak farklılık göstermiştir. Toplamda, üç C. albicans suşu, AMPH B, FCZ ve Ps d1'e duyarlıydı . AMPH B ve FCZ, WT ve Δ'de benzer MIC gösterdigcs planktonik hücreler (bu dört MIC'in tümü 3,7-4,0 μg/ml aralığındadır). CI test edildiğinde daha düşük değerler elde edildi. Biyofilm geliştirme ve XTT/menadion testi testi
Biyofilm oluşumu, hücrenin büyüme yüzeyine yapışmasına bağlıdır. Ps d1'in C üzerindeki etki modunu incelemek . albicans biyofilm oluşumu, polistiren yüzeyler seçilmiştir. Biyofilm oluşumu için koşulları optimize etmek için, üç C için XTT tahlilleri yapıldı . albicans suşları çalışıldı. En iyi biyofilm büyümesini sağlayan zaman ve hücre konsantrasyonları, Şekil S2'de (Ek Malzeme) gösterilmiştir. Görüldüğü gibi biyofilm gelişimi için ihtiyaç duyulan hücre yoğunluğu suştan suşa farklılık göstermektedir. WT ve Δ gcs , CI'den 10 kat daha yüksek bir hücre konsantrasyonuna ihtiyaç duyar (10 5hücreler/ml) biyofilm gelişimini başlatmak için. Buna rağmen, klinik izolat ve WT 24 saat sonra biyofilm oluştururken, mutant suşun biyofilm gelişimini ve yapışmasını sağlamak için 72 saate ihtiyacı vardır. AMPH B, FCZ ve Ps d1, C. albicans plancktonik hücrelerinde morfolojik değişikliklere neden olur
Aralıklı temas modunda AFM görüntüleme, MIC'de ve 10 kat daha yüksek konsantrasyonlarda AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile 6 saat ve 24 saat inkübasyondan sonra C. albicans planktonik hücrelerinin maruz kaldığı etkileri değerlendirmek için kullanıldı . Hata sinyali, dedektör sinyali ile ayar noktası arasındaki farktır ve daha fazla uzaysal ayrıntıya sahip görüntüler sağlar. Genel olarak, antimikrobiyal tedaviler tüm hücrelerde morfolojik değişikliklere neden oldu. Bu etkilerin şiddeti zamana bağlı olarak arttı. 6 saat sonra, hücre yüzeyinde (kabarcıklar) küçük düzensizlikler ve hücrelerin üzerinde ve çevresinde biriken küçük veziküllerin MIC antifungal konsantrasyonundan 10 kat daha yüksek olduğunu gözlemlemek mümkün olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Şekilde görüldüğü gibiŞekil 11CI ve WT suşları için, işlenmemiş hücreler (kontroller) pürüzsüz bir yüzeye ve düzenli şekle sahiptir (Şekiller).1A,D). CI ve WT'nin aksine, işlenmemiş Δ gcs hücreleri düzensiz yüzey gösterdi (Şekil(Şekil1G).1G). MIC konsantrasyonunda Ps d1 ile 24 saat süreyle inkübasyon , hücre yüzeyinde bazı deformasyonlar gösterdi (Şekiller).1B,E,H). 10 × MIC'de, MIC'de elde edilenlerden daha gelişmiş etkiler gözlendi (Şekiller1C,F,I). Küçük kabarcıklar eşlik eden hücrelerden salınmakta ve iç içerik serbest bırakılmaktadır (Şekil(Şekil 11ve Şekil S7 ).
Şekil 1
Ps d1 konsantrasyonunun C. albicans planktonik hücreleri üzerindeki etkisi . Ps d1 : ( A , D ,G) 0 μM (kontrol) ; (B,E,H) MIC (20 μM) ve (C,F,I) 10 kat daha yüksek konsantrasyonda. Tüm görüntüler 10 × 10 μm 2'dir .
AMPH B ve FCZ'den farklı olarak (Şekil S5 , S6 ), Ps d1 etkileri daha şiddetli görünmektedir. Mutabakat sonucu, hücre iç içeriğinin veya tamamen kabarcıklarla kaplanmış hücrelerin serbest bırakılmasıdır. WT ile muamele edilmiş hücreler için, bir kabarcığın yüksekliği yaklaşık 14 nm'dir (Şekil S3 ). Kabarcıklar birbiri üzerinde birikerek hücrenin üzerinde toplu bir yapı oluşturur. Mutant hücreler için benzer sonuçlar elde edildi (Şekil S4 ). Yalnızca CI hücreleri için, Ps d1 10 × MIC'de soyulma benzeri bir morfoloji gözlendi (Şekil(Şekil1C).1C). Üç tedaviden AMPH B, daha kapsamlı bir hücre deformasyonunu indükleyendir: hücreler hacim kaybeder ve zarlar daha pürüzlü görünür. Klinik izolat, hem inkübasyon hem de kullanılan ilacın konsantrasyonunda FCZ'den daha az etkilenmiş gibi görünmektedir, sadece 24 saatlik inkübasyondan sonra hücre yüzeyinde bazı düzensizlikler ortaya çıkmaktadır. C. albicans , AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile işlemden sonra yüzey pürüzlülüğünde bir artışa maruz kalıyor
Yüzey pürüzlülüğü üç C için değerlendirildi . albicans suşları, AMPH B, FCZ ve Ps d1 ile tedaviden önce ve sonra (Şekil(Şekil 2),2), hem 6 saat hem de 24 saat hücre tedavisinden sonra. Planktonik hücrelerle gerçekleştirilen tedavilerin herhangi birinde ortalama pürüzlülükte genel bir artış oldu. Hücre yüzeyinin 1 × 1 μm 2 görüntülerine uygulanan RMS formülü ile elde edilen bu sonuçlar, antifungal tedaviden sonra yüzey pürüzlülüğünün arttığına dair önceki nitel gözlemlerle uyumludur (Şekil(Şekil 1).1). Kontrol koşulları ile ilgili olarak, CI ve WT hücreleri daha düşük yüzey pürüzlülük değerlerine sahiptir (Şekiller).2A,D, kontrol), 5 nm'nin altında, Δ gcs hücreleri ise 5 nm'nin üzerinde yüzey pürüzlülük değerleri sunar (Şekil(Şekil2G,2G, kontrol). WT hücreleri en çok etkilenenlerdi (Şekiller2D–F) ve Δ gcs en az etkilenen (Şekiller )2G–I) tedavilerden herhangi biri ile. AMPH B ile yapılan tüm tedaviler, CI ve WT hücrelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir membran pürüzlülüğü artışına neden oldu (Şekiller).2A,D). Pürüzlülükteki artışları istatistiksel olarak anlamlı olmadığı için Δ gcs hücreleri için durum her zaman böyle değildi (Şekiller).2H, ben). FCZ ile tedavi edilen üç hücreyi karşılaştırırken (Şekiller2B,E,H), CI ve Δ gcs için yüzey pürüzlülüğü üzerinde daha az etki gözlendi . Aksine, WT hücreleri bu işlemden güçlü bir şekilde etkilendi ve test edilen tüm koşullar, yüzey pürüzlülüğünde istatistiksel olarak anlamlı bir artışla sonuçlandı. Son olarak, Ps d1, AMPH B'ye benzer bir şekilde CI hücrelerinin pürüzlülüğünü arttırdı (Şekil(Şekil2C),2C), WT hücreleri için ise Ps d1'in etkileri (Şekil(Şekil2F)2F) büyüklük olarak FCZ'ninkilere benzerdi. Yine, AMPH B ve FCZ için gözlemlendiği gibi, Δ gcs , Ps d1'den en az etkilenen ; yine de defensin, MIC'den 10 kat daha yüksek bir peptit konsantrasyonu ile 24 saatlik inkübasyondan sonra bu hücrelerin yüzey pürüzlülüğünü güçlü bir şekilde artırabildi (Şekil(Şekil2I2I).
şekil 2
AMPH B (A,D,G) , FCZ ile klinik izolat (A–C) , vahşi tip (D–F) ve Δ gcs (G–I) C. albicans suşlarının inkübasyonundan sonra hücre pürüzlülüğü (RMS) ölçümleri ( B,E,H) ve Ps d1 (C,F,I) , MIC'de ve 10 kat daha yüksek konsantrasyonda. AFM yükseklik görüntülerinden, hücre üzerinde 1 x 1 µm 2 ekinlerde ölçümler elde edildi ( N = 10). Sütunlar, her deney koşulu için toplam 30 hücrede her hücre için üç bağımsız ölçümün ortalama ± standart sapmasına karşılık gelir. İki yönlü ANOVA ve Bonferroni son testi yapıldı ( * p< 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001). Hata çubukları SEM'i gösterir. C. albicans , AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile tedaviden sonra sertliğini kaybeder
Hücrelerin sertliğindeki değişiklikler iki farklı şekilde değerlendirildi. Biri, AFM tabanlı kuvvet spektroskopisi kullanılarak zarın Young modülünün belirlenmesine dayanıyordu (üç tedavi için; ŞekilFigür 3);3); ve diğeri, hücre yüzeyinin, zardaki daha yumuşak ve daha sert alanları görselleştirmeye ve ayırt etmeye izin veren AFM faz-kontrast görüntülerinin gözlemlenmesine dayanıyordu ( yalnızca Ps dl için; Şekil S7 ).
Figür 3
C. albicans'ın AMPH B, FCZ ve Ps d1 (konsantrasyonlar MIC'in 10 katı) ile 24 saat inkübasyonundan sonra hücre sertliği ölçümleri (AFM kuvvet-mesafe eğrilerinden hesaplanan Young modülü ). Ölçümler, her deneysel koşul için toplam 30 hücre üzerinde her hücre için üç kopyaya karşılık gelir. İki yönlü ANOVA ve Bonferroni son testi yapıldı ( * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). Hata çubukları SEM'i gösterir.
Young modülü tayini, MIC'den 10 kat daha yüksek bir AMPH B, FCZ veya Ps d1 konsantrasyonu ile 24 saatlik inkübasyondan sonra yapıldı (Şekil(Figür 3).3). CI hücrelerinin ortalama zar sertliği değeri 354 ± 14 kPa, WT'nin ortalama değeri 384 ± 14 kPa ve Δ gcs ortalama değeri 315 ± 21 kPa idi. Δ gcs hücrelerinin sertliği WT ile karşılaştırıldığında, %18'lik bir azalma oldu (Şekilde kırmızı yıldızFigür 3;3; * p < 0.05). Kontrole göre sertlik azaltma yüzdeleri, her bir işlemin farklı etkilerini daha iyi anlamak için hesaplanmıştır (Şekil'in altındaki koyu kırmızı kutudaki değerler).Figür 3).3). AMPH B'nin hücre sertliği üzerindeki etkileri, hücre başlangıç sertliğinde %60'lık bir azalma ile Δ gcs hücreleri için daha şiddetliydi (Şekil(Figür 3).3). WT hücreleri, ilk sertlikte %23'lük bir azalma ile bu işlemden daha az etkilendi. FCZ, üç suş üzerinde en az etkiye sahip tedaviydi ve sertlik üzerindeki en yüksek azalma, FCZ'nin ilk sertliğin neredeyse yarısına kadar bir azalmaya neden olduğu WT hücreleri için kaydedildi. Üç tedaviden, Ps d1, CI (%67) ve WT (%57) hücrelerinin sertliğinde en büyük azalmaya neden olurken, Δ gcs hücreleri için bu, daha düşük etkiye sahip olan tedaviydi (%34 sertlik azalması). Her durumda, Ps d1 dahil olmak üzere antifungal ilaçlarla tedavi, hücre sertliğinde istatistiksel olarak anlamlı düşüşlere yol açar (Şekil(Figür 3;3; p < 0,001).
Ps d1 işleminden sonra C. albicans'ın faz kontrastlı görüntülemesiyle, sertlik ve yumuşaklık gibi numune özellikleriyle ilgili bazı değişiklikleri ayırt etmek mümkün olmuştur (Magonov ve diğerleri, 1997 ; Martinez ve Garcia, 2006 ; Garcia ve diğerleri, 2007 ; Nie ve diğerleri, 2011 ). Üç suşun kontrol hücrelerinin faz kontrastlı görüntülerinin tümü homojen bir yüzey sunar. Üç suş için gözlemlenen sonuçlar kabaca aynıdır. Peptit ile muamelenin neden olduğu hücre yüzeyindeki kabarcıklar, çevreleyen hücre yüzeyinden daha yumuşaktır (Şekil S7, Ek Malzemedeki faz kontrast görüntüleri) ve kabarcık oluşmadığında bile, bu görüntüler daha yumuşak ve daha sert alanların ayırt edilmesini sağlar. Ps d1, C. albicans planktonik hücrelerinde ölümü tetikler
Ps d1'in canlı/ölü boyama yoluyla planktonik C. albicans hücrelerini öldürüp öldürmediğini belirlemek için akış sitometrisi deneyleri yapıldı . CI, WT ve Δ gcs hücreleri, MIC'ye eşit ve 10 kat daha yüksek bir AMPH B, FCZ veya Ps d1 konsantrasyonu ile 24 saat boyunca inkübe edildi . Çeyrekler (boyasız, canlı, ölü ve çift pozitif hücreler), ilgili kontrolleri kullanılarak her suş için oluşturulmuştur (veriler gösterilmemiştir).
FigürŞekil 44MIC ve 10 kat daha yüksekte Ps d1 ile tedaviden sonra CI, WT ve Δ gcs planktonik hücreler için elde edilen akış sitometrisi nokta grafiklerini gösterir. Burada, Ps d1'in CI hücreleri üzerinde daha az etkisi oldu ve peptit varlığında daha az hücre öldü (Şekiller).4A–C). WT ve Δ gcs için, ölü hücre yüzdesi , MIC konsantrasyonunda Ps d1 varlığında sırasıyla %70.6 ve %23.8'e yükseldi . İlginç bir şekilde, peptit konsantrasyonu 10 kat daha yükseğe çıkarıldığında, ölü hücrelerin yüzdesi Δ gcs hücreleri için (%27.8) benzer görünüyor , ancak WT hücreleri için değil (%48.7).
Şekil 4
Ps d1 ile tedaviden sonra klinik izolat (A–C) , vahşi tip (D–F) ve Δ gcs (G–I) planktonik hücrelerin akış sitometrisi nokta grafikleri . MIC konsantrasyonunda (20 μM) (B,E,H) ve 10 kat daha yüksek (200 μM) (C,F,I) Ps d1 ile 24 saat inkübasyondan sonra hücreler her iki boyayla da boyandı . A,D,G , kontrol).
Tüm bu sonuçları AMPH B ve FCZ için elde edilenlerle karşılaştırarak (Şekil S8 – S10 ), Ps d1'in WT ve Δ gcs hücrelerinde daha güçlü bir etkiye sahip olduğu sonucunu çıkarmak mümkündür (Şekiller2E,F,H,I, sırasıyla) AMPH B'ye benzer (Şekil S9 , S10 ). AMPHB ve FCZ antifungalleri, CI hücrelerinde aynı etkiye sahipti: hücrelerin yaklaşık %20'si etkileriyle öldürüldü (Şekiller).4B,Cve Şekil S8 ). Ps d1 ve AMPH B, üç suşun hepsinde aynı davranışa sahipti: CI suşunda antifungal etki ile daha az hücre ölümü indüklenirken, WT ve Δ gcs hücrelerinde artan ölüm gözlendi . Aksine FCZ, C. albicans suşlarında daha az ölü hücre (%30'dan az) gösterdi. C. albicans biyofilmlerinin AFM görüntülemesi
AMPH B, FCZ ve Ps d1'in C üzerindeki etkisini görüntülemek için AFM kullanıldı . planktonik hücreler için MIC'den 10 kat daha yüksek bir konsantrasyonda 24 saat inkübasyondan sonra albicans biyofilmleri (Şekil(Şekil 5).5). AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile tedavi edildiğinde CI ve WT suşları için biyofilm gelişiminin inhibisyonu gözlemlendi (veriler gösterilmemiştir). Biyofilm gelişiminin inhibisyonu, hif veya psödohifa olmadığını gösterdi. Tüm antifungal tedaviler için küçük gruplar halinde (4-8 hücre) tomurcuklanan maya hücreleri gözlendi. AMPH B varlığında CI, WT'ye kıyasla daha az etkilenmiş gibi görünmektedir. CI biyofilm görüntüleri (Şekil(Şekil5B)5B) hem yalancı hif hem de hif yokluğunu gösterir. AMPH B'nin etkisi, WT biyofilmi üzerinde daha belirgindi (Şekil(Şekil5F):5F): küçültülmüş boyutlu hücrelerle birlikte büyük deforme olmuş hücreler. Hem CI hem de WT için, hücreler tarafından açığa çıkarılan yüzeyin varlığı, AMPH B eylemi üzerine biyofilm biyokütlesindeki değişiklikleri kanıtlar. Bu etkiler FCZ ve Ps d1 ile daha dikkat çekiciydi . CI ve WT suşları için kaplanmamış yüzey alanı arttırıldı ve hacim kaybı gözlemlendi. 10 × MIC'deki FCZ, hücre hacmi ve boyutunda bir azalmaya neden oldu (Şekiller5C,G). Ps d1 hücre yüzeyinde önemli morfolojik değişikliklere neden olmuştur. 10 x MIC'de Ps d1 ile tedavi edilen CI için kabarcıkların ortaya çıkması ve hücre hacminin kaybı gözlendi (Şekil(Şekil5D).5D). WT, Ps d1'den daha az etkilenmiş gibi görünüyordu . Bununla birlikte, küçük kabarcıkların ortaya çıkması fark edilebilir (Şekil(Şekil5H).5H). Canlı ve ölü hücrelerin yüzdeleri deneysel olarak ölçülmüştür (Tablo S1 ). Gösterildiği gibi, AMPH B, FCZ ve Ps d1 ile karşılaştırıldığında biyofilm eradikasyonunda daha etkilidir .
Şekil 5
C. albicans suşlarının AFM hata görüntüleri eradikasyon deneyleri. AMPH B (B,F) , FCZ (C,G) ve Ps d1 (D,H) yokluğunda klinik izolat (A–D) , vahşi tip (E–H) ve Δ gcs (I) 10'da × MİK. Peptit oluşan biyofilmi yok ettiğinden, Δ gcs biyofilminin AMPH B, FCZ ve/veya Ps d1 ile antifungal tedavisine ilişkin hiçbir görüntü gösterilmemiştir. 10 × 10 μm 2 olan (D,H,I) hariç tüm görüntüler 15 × 15 μm 2 'dir . C. albicans biyofilmlerinin canlı/ölü hücre konfokal görüntülemesi -inhibisyon ve eradikasyon deneyleri
Mantar önleyici tedavilerden önce ve sonra maya hücrelerinin canlılığını değerlendirmek için, üç biyofilm “fazında” konfokal lazer tarama mikroskopi görüntüleri elde edildi: oluşan biyofilmin oluşumu, inhibisyonu ve eradikasyonu. Şekilde gösterildiği gibiŞekil6,6, tüm suşlar için oluşturulan biyofilm, birkaç noktada birbirine bağlı bir hif ağından ve tomurcuklanan maya hücrelerinden oluşan bir 3D mimarisi sundu. Miktar tayini üzerine, biyofilm oluşturulduktan sonra ölü hücrelerin yoğunluğunun tüm suşlar için düşük (yaklaşık %10) olduğu gösterildi (Şekiller).6A,E,I). İnhibisyon deneyleri için, antifungal tedaviden sonra hiçbir hücre büyümesi gözlenmedi. Verilerimiz, AMPH B, FCZ ve Ps d1'in, gelişim hızını azaltarak biyofilm oluşumunu engellediğini göstermektedir.
Şekil 6
Eradikasyon testleri. C'nin konfokal mikroskopi görüntüleri . albicans suşları klinik izolatı (A–D) , vahşi tip (E–H) ve Δ gcs (I–L) , AMPH B (B,F,J) yokluğunda (A,E,I) , FCZ (C,G,K) veya Ps d1 (D,H,L) , MIC'den 10 kat daha yüksek bir konsantrasyonda.
Eradikasyon deneyleri için, her suş için biyofilm geliştirildiğinde, antifungal 10 x MIC konsantrasyonunda ilave edildi ve 24 saat inkübe edildi. Elde edilen sonuçlar, Δ gcs suşu tarafından oluşturulan biyofilmin tamamen yok edildiğini göstermektedir (Şekil(Şekil6),6), CI'nin aksine (Şekiller6B–D) ve WT (Rakamlar6F–H), özellikle AMPH B ile tedavi edilen CI için biyofilm mimarisinin algılanabilir/fark edilebilir değişikliklere uğradığı ve ölü hücrelerin miktarının arttığı (Şekil(Şekil6B)6B) ve FCZ (Şekil(Şekil6C),6C) ve AMPH B ile tedavi edilen WT için (Şekil(Şekil6F6F).
Git: Tartışma
Bazı Candida türleri . suşları en yaygın antifungal ilaçlara karşı dirençli hale gelmektedir. Bu anlamda, enfeksiyonu in vivo yok etmek için bağışıklık sistemi boyunca hareket eden antimikrobiyal ajanlar oluşturmak için birçok çaba sarf edilmiştir . Ps d1, C'ye karşı antifungal etkileri olan bir AMP'dir . albicans . Bu peptidin etki modunu anlamak için , biri GlcCer sentaz geninde bir mutasyon ve bunun yanı sıra vahşi tipteki karşılığı olan üç C. albicans suşu üzerinde çalışılmıştır. Özetle, Ps d1 hücre yüzeyinde önemli morfolojik değişikliklere ve hücre ölümüne neden olmuştur. C. albicans'ın aderans testleriabiyotik yüzeye mutant, GlcCer'de eksik suş çalışması yoluyla GlcCer'in Ps d1 antifungal aktivitedeki önemini arttırdı (Lobo ve diğerleri, 2007 ). Aslında, bu çalışmada rapor edilen bazı gözlemler, Ps d1 etkilerinin C. albicans membranındaki bu lipidin varlığına bağlı olduğuna dair bu kanıtlarla uyumludur (Tyagi ve Malik, 2010a ; de Medeiros ve diğerleri, 2014 ; Rollin -Pinheiro ve diğerleri, 2016 ).
AMP'ler, morfoloji, boyut, yükseklik, pürüzlülük ve sertlik gibi hücrelerin fiziksel özelliklerini etkileme yetenekleri açısından test edilmiştir (Canetta ve diğerleri, 2006 ; Tyagi ve Malik, 2010a , b ; Kim ve diğerleri, 2011 ; Eaton ve diğerleri, 2012 ; Alsteens ve diğerleri, 2013a , b ; El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Formosa ve diğerleri, 2013 ). Önemli olarak, C. albicans hücre duvarı bileşimi, yapışma proteinlerinin ekspresyonu düzeyinde de dahil olmak üzere mantar önleyici muamele üzerine değiştirilebilir, bu nedenle hücre-hücre etkileşimlerini de etkiler (El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Formosa ve diğerleri. ,2013 ). Peptidik olmayan iki geleneksel antifungal ajan (AMPH B ve FCZ) ve bir doğal AMP ( Ps d1), C'de morfolojik değişikliklere neden olur . albicans (Alviano ve diğerleri, 1999 ). Ergosterol, mantar hücre zarının önemli bir bileşenidir. Doğrudan bağlanması (AMPH B) (Gray ve diğerleri, 2012 ) veya sentezinin inhibisyonu (FCZ) (Chang ve diğerleri, 2008 , 2014 ), hücresel içeriğin sızmasına neden olarak artan hücresel geçirgenlikle sonuçlanır. C. albicans için gözlemlenen değişikliklersuşları düşük antifungal konsantrasyonda ve kısa bir inkübasyon süresinde meydana geldi: hücre hacminde azalma, hücre yüzeyinde kabarcık veya soyma etkisi, pürüzlülüğün artması (Tyagi ve Malik, 2010a , b ) ve daha düşük bir yetenek hücrelerin birbirine yapışmasını sağlar (Alsteens ve diğerleri, 2013a , b ). Bunlar, AMPH B, FCZ ve Ps d1'in eylemiyle gösterilen ortak özelliklerdi . Ps d1 için gözlemlendiği gibi (Şekil(Şekil 4),4), soyulma benzeri bir yüzey deseni, C. albicans üzerinde sıklıkla indüklenen bir etki gibi görünüyordu . Burada sunulan sonuçlar, AMPH B, flusitozin (Kim ve diğerleri, 2011 ) ve kaspofungin (El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Formosa ve diğerleri, 2013 ) tarafından C. albicans hücrelerinde indüklenen bildirilen etkilerle uyumludur. ; Haşim ve diğerleri, 2016 ).
AMP'lerin etki modunu tanımlayan en yaygın olarak kabul edilen modeller arasında (Silva ve diğerleri, 2014 ), halı modeli, membran homojenliğinde daha büyük bir azalmaya neden olan etkileri daha iyi açıklayabilecek olanıdır ve bir deterjan- miselleşme gibi, zar direncinde bir kayıp (Chang ve diğerleri, 2008 ). Zayıflamış bir zar, bazı hücrelerde gözlenen hacim kaybını açıklayarak hücresel içeriğin sızmasına neden olarak bozulmaya maruz kalabilir (Şekil(Şekil 4).4). Hata sinyali görüntülerini gözlemleyerek, Ps d1 ile tedavi edilen hücrelerin kontrol hücreleri gibi veya hatta AMPH B veya FCZ ile tedavi edilen hücreler gibi kümelenmediğini fark etmek de mümkün oldu . Bu, Ps d1'in hücre-hücre yapışması üzerinde bir etkisi olduğunu kanıtlayabilir. Bu sonuç, hücre duvarında Ps d1 (El-Kirat-Chatel ve diğ., 2013 ; Haşim ve diğ., 2016 ) tarafından sağlanan destabilizasyon ve zar seviyesinde olası bir deterjan benzeri etki (Da Silva) ile açıklanabilir. ve Machado, 2012 ).
C. _ albicans planktonik hücreleri, AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile işlemden sonra yüzey pürüzlülüğünde önemli bir artış gösterdi . AFM yükseklik görüntülerinin yüzey analizi üzerine (Tyagi ve Malik, 2010a , b ; Domingues ve diğerleri, 2013 ; Franquelim ve diğerleri, 2013 ), hata sinyali görüntülerinde fark edilen membran pürüzlülüğündeki artışı ölçmek mümkün olmuştur. . Δ gcs hücrelerinin bu maddelerden daha az etkilenmesi, zaten daha pürüzlü olmalarına bağlı olabilir (Şekil 1).(Şekil2G)2G) CI ve WT suşlarından daha, AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile tedaviden önce bile.
Dış ajanların etkisinden kaynaklanan morfolojik değişiklikler, hücre sertliği üzerindeki değişikliklerle de ilişkilendirilebilir (El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Haşim ve diğerleri, 2016 ). AFM bazlı kuvvet spektroskopisi ölçümleri, Young modül hesaplaması yoluyla hücre elastikiyetinin nicelleştirilmesine izin verdi (Domingues ve diğerleri, 2013 ; El-Kirat-Chatel ve diğerleri, 2013 ; Franquelim ve diğerleri, 2013 ). C. albicans , AMPH B, FCZ veya Ps d1 ile tedaviden sonra sertliğini kaybeder. Δ gcs hücreleri, WT muadili ile karşılaştırıldığında ortalama hücre sertliğinde %18'lik bir azalma sundu (Şekil(Figür 3).3). Bunun nedeni GlcCer'in olmaması olabilir (Thevissen ve diğerleri, 2004 , 2012 ; Nimrichter ve Rodrigues, 2011 ). Seramidlerin membran sertliğini, stabilitesini ve biyolojik membranların yapısal organizasyonunu arttırdığı bilinmektedir (Sullan ve diğerleri, 2009 ). Hücre yüzeyi sertliği azalmasında AMPH B veya FCZ etkileriyle karşılaştırıldığında, Ps d1, kontrol örneğine göre sırasıyla %67 ve %57'lik düşüşlerle hem CI hem de WT hücreleri üzerinde daha güçlü bir etkiye sahipti (Şekil(Figür 3).3). Ps d1'in Δ gcs hücre yüzeyinin sertliği üzerinde önemli ölçüde daha düşük bir azalmaya neden olması (%34), bu defensinin , daha önce önerildiği gibi (de Medeiros ve diğerleri, 2010 , 2014 ; Gonçalves ve diğerleri, 2012 ; Rollin-Pinheiro ve diğerleri, 2016 ). Δ gcs hücrelerinin sertliğinde AMPH B tarafından yönlendirilen güçlü azalma (%60, ŞekilFigür 3)3), bu mantar önleyici ilacın hücre yüzeyinde oluşturduğu gözenekler ile hücre zarındaki GlcCer eksikliği arasındaki sinerjistik bir etkiden kaynaklanabilir. AMPH B'nin ergosterole bağlanması geri döndürülemez olduğundan (Filippin ve diğerleri, 2008 ), C. albicans hücrelerinde GlcCer yokluğu ile birlikte, hücrenin, hücre yüzeyinde antifungal etkinin neden olduğu hasarı onarmasının bir yolu yoktur. kararsız ve daha düşük dirençli (Leipelt ve diğerleri, 2001 ).
Ps d1 ile muameleden sonra C. albicans'ın AFM faz kontrast görüntülerine bakıldığında (Şekil S7 ), yüzeyinde, hata sinyali görüntülerinde görülen kabarcıkların lokalizasyonu ile örtüşen daha yumuşak alanları gözlemlemek mümkün olmuştur. Bu daha yumuşak alanlar muhtemelen peptidin hücre yüzeyi üzerinde birikmesinden kaynaklanan bir etkidir, sonuçta deterjan benzeri bir şekilde hareket ederek lipidlerin düzensizleşmesine ve miselleşmesine ve sonuç olarak da kararsız hücre zarı ve duvarına yol açar.
Bir antimikrobiyal peptitin hücre ölümünü indükleme kabiliyeti, hedef(ler)ine karşı, genellikle hücre duvarı ve/veya membran seviyesinde hareket ettiği mekanizma ile ilişkilidir. Peptidin bulduğu zar tipinin önemi önemlidir; bu nedenle, suşlar arasındaki farklılıklar beklenebilir. CI hücreleri için, burada test edilen moleküllerin hiçbiri (AMPH B, FCZ ve Ps d1) önemli bir canlılık kaybına neden olmadı (Şekiller).4B,Cve Şekil S3 ), bu sadece peptidin bu hücrelerdeki etki modu ile açıklanabilir. Zarda bile, hasta hücrelerinde GlcCer moleküllerinde veya zardaki oryantasyonda bazı küçük biyokimyasal değişiklikler olabilir, bu da peptidin etki mekanizmasını etkiler (Rollin-Pinheiro ve diğerleri, 2016 ). Bununla birlikte, peptidin bu tip hücrelerde etki ederek hücrelerin pürüzlülüğünü ve sertliğini azalttığı diğer sonuçlardan açıktı (Şekiller).(Şekiller2,2,,3,3, sırasıyla), bu AMP'nin ölümü indüklemesi veya hücre zarını geçirgenleştirmesi zorunlu değildir, bu da ölü hücreler için neden hiçbir pozitif sonuç olmadığını açıklar.
Ps d1 , kullanılan konsantrasyondan bağımsız olarak, geleneksel mantar önleyici moleküllerden (AMPH B ve FCZ) WT C. albicans üzerinde daha güçlü bir etkiye sahipti . Ek olarak, ölü hücrelerin yüzdesinin WT için Δ gcs hücrelerinden daha yüksek olması dikkat çekiciydi (Şekiller) .4D,F,H,I) (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ). Δ gcs hücrelerinin zarında GlcCer'in olmaması, mantar virülansında önemli bir rol oynadığı için bu lipide ilişkin önceki gözlemleri açıklayabilir (Thevissen ve diğerleri, 2003 , 2012 ; Barreto-Bergter ve diğerleri, 2004 ). Her bir suş için hangi mekanizmanın baskın olduğu açık olmasa da, bireysel defensinlerin etki şekline ilişkin bildirilen açıklamalar hücre duvarına bağlanma, sinyal kaskadlarının indüklenmesi ve hücre içi hedeflerle etkileşim, apoptoza yol açma, membran geçirgenliği ve reseptör- aracılı içselleştirme (Thevissen ve diğerleri, 2004 ; de Medeiros ve diğerleri, 2010 ; Van Der Weerden ve diğerleri,2013 ). P sd1'in N. crassa hücre döngüsü proteini siklin F ile etkileşime girdiği ve hücre döngüsünü durdurduğu göz önüne alındığında (Lobo ve diğerleri, 2007 ), son zamanlarda, hücrelere giren ve hücre içi bir hedefle etkileşime giren C. albicans için de aynısı rapor edilmiştir . hücre ölümüne yol açar (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ).
Ps d1'in ilk önce mantar duvar seviyesinde etki ederek polisakkarit matrisini ayrıştırdığına ve mannoproteinler, β-glukanlar ve kitinden oluşan duvarı bozduğuna inanıyoruz. Bu, hücre pürüzlülüğünü artırarak ve sertliğini azaltarak hücre duvarının bütünlüğünü etkiler. Peptit hücre zarına ulaştığında, C'deki glukosilseramidlerle etkileşime girer . albicans membranı oluşturur ve hücre içi etkiyi indükler. Daha sonra, Ps d1'in hücre içi birikimi , daha önce C. albicans için tarif edildiği gibi (de Medeiros ve diğerleri, 2014 ), N. crassa (Lobo ) için bulunana benzer şekilde hücre döngüsü kontrol proteini siklin F'ye müdahale eder. ve diğerleri,2007 ), bu da mantar patojeninin apoptozuna yol açar.
Planktonik hücrelerin abiyotik bir yüzeye ve diğer hücrelere yapışma yeteneği önemli bir virülans faktörüdür ve özellikle biyofilm oluşumu için önemlidir. Bu yeteneği engelleyerek, C. albicans biyofilmlerine karşı Ps d1 testi son derece alakalı hale gelir. Biyofilmler, planktonik hücrelere kıyasla artan ilaç direnci sergiler (Şekiller).(Şekil1,1,,5,5, sırasıyla). Bazı mantar önleyici moleküllerin etki tarzındaki değişiklikler, planktonikten sapsız hücre durumlarına (biyofilm) kadar değişir. Bu, C üzerinde AMPH B, FCZ ve Ps d1 için geçerlidir . albicans biyofilmleri (Şekiller(Şekil5,5,,6).6). Yüksek oranda karbonhidrat, protein, heksozamin, fosfor ve ürik asit içeren ekzopolimerler açısından zengin maddelerle çevrili biyofilmin karmaşık yapısı, dış etkenlerin penetrasyonunu kısıtlayarak etkilerini azaltabilir (Şekiller).(Şekil5,5,,6)6) ve artan biyofilm yaşam süresi.
Bu çalışma , daha önce araştırılmamış olan Pisum sativum defensin 1 antifungal aktivitesinin bazı yönlerini aydınlatmaktadır . Ps d1 , hücrelerin yapışma yeteneğini engelleyerek , C. albicans hücrelerinin enfekte olmuş dokuya yapışmasını azaltarak bir enfeksiyonun çoğalmasını önlemeye de katkıda bulunabilir . Ps d1'in, yüksek oranda hücre-substrat ve hücre-hücre yapışmasına (Alsteens ve diğerleri, 2013a , b ) ve ayrıca çekirdek algılamaya (Kruppa, 2009 ) bağlı olan biyofilm oluşumuna müdahale edebileceğini düşünmek de mümkündür . Toplamda, C. albicans'ın morfolojik formlarının (mantar pleomorfizmi) kabiliyeti Ps tarafından engellendi.d1 (Şekiller(Şekil1,1,,55).
AMP'lerin yapısından ve dizisinden ilham alan yeni moleküllerin moleküler tasarımı ve sentezi, yeni ve kapsamlı bir uygulama alanı açmak için umut verici bir yaklaşım gibi görünmektedir (Ören ve diğerleri, 1997 ; Wu ve diğerleri, 2003 ; McPhee ve diğerleri, 2005 ). ), antimikrobiyal tedaviden aşı adjuvanları olarak olası kullanımlarına kadar. Bu nedenle, konak savunma peptitlerinin işlev ve etki mekanizmasının daha iyi anlaşılması, anti-enfektif ve immünomodülatör terapötiklerde büyük bir vaattir. Önceki çalışmamız, Ps d1'in mantar zarlarını taklit eden bileşimdeki zarlarla etkileşime girdiğini gösterdi (Gonçalves ve ark., 2012 ).). Ergosterol ve GlcCer içeren zarlarla güçlü etkileşimler rapor edilirken, kolesterol içeren zarlarla hiçbir etkileşim, memeli hücrelerinde (kolesterol açısından zengin zarlarla) azaltılmış toksisiteyi haklı çıkarır. Burada, Ps d1'in C üzerinde güçlü ve pleiotropik bir antifungal aktiviteye sahip olduğunu gösteriyoruz . albicans ve GlcCer'in mantar zarlarının önemli bir bileşeni olarak öneminin altı çizildi.
Git: Yazar Katkıları
Deneyleri tasarladı ve tasarladı: SG, Ld, EK ve NS. Deneyleri gerçekleştirdi: SG, PS, MF ve Ld. Verileri analiz etti: SG, PS, MF ve Ld. Makaleyi yazdı: SG, PS, MF, Ld, EK ve NS. Çıkar çatışması beyanı
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda gerçekleştirildiğini beyan eder.
Git: Teşekkür
Bu çalışma Fundação para a Ciência ea Tecnologia – Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (FCT-MCTES, Portekiz), FP7-IRSES projesi MEMPEPACROSS (Avrupa Birliği), Marie Skłodowska-Curie Araştırma ve Yenilik Personel Değişimi (MSCA-) tarafından finanse edilmiştir. RISE) projesi INPACT (çağrı H2020-MSCA-RISE-2014, hibe sözleşmesi 644167, Avrupa Birliği) ve CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Brezilya). MF ayrıca FCT-MCTES Doktora bursu SPRH/BD/100517/2014'ü de kabul eder.
Git: Ek materyal
Bu makalenin Ek Malzemesi çevrimiçi olarak şu adreste bulunabilir: http://journal.frontiersin.org/artic...ntary-material
Ek veri dosyası için buraya tıklayın. (1,7 milyon, pdf)
Git: Referanslar
- Almeida MS, Cabral KM, Kurtenbach E., Almeida FC, Valente AP (2002). Pisum sativum defensin 1'in yüksek çözünürlüklü NMR ile çözelti yapısı : bitki defensinleri, farklı etki mekanizmalarına sahip özdeş omurga . J. Mol. Biol. 315 , 749-757. 10.1006/jmbi.2001.5252 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Almeida MS, Cabral KM, Zingali RB, Kurtenbach E. (2000). Bezelye ( Pisum sativum ) tohumlarından iki yeni savunma peptidinin karakterizasyonu . Kemer Biyokimya. Biyofiz. 378 , 278–286. 10.1006/abbi.2000.1824 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Alsteens D., Beaussart A., Derclaye S., El-Kirat-Chatel S., Park HR, Lipke PN, et al. . (2013a). Als aracılı mantar yapışmasının tek hücreli kuvvet spektroskopisi . Anal. Yöntem 5 , 3657–3662. 10.1039/c3ay40473k [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Alsteens D., Van Dijck P., Lipke PN, Dufrene YF (2013b). Bir mantar patojeninde hücre-hücre yapışmasını sağlayan kuvvetlerin ölçülmesi . Langmuir 29 , 13473-13480. 10.1021/la403237f [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Alviano CS, Travassos LR, Schauer R. (1999). Mantarlardaki siyalik asitler: bir mini inceleme . glikokonj. J.16 , 545-554 . 10.1023/A:1007078106280 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Andrews JM (2001). Minimum inhibitör konsantrasyonlarının belirlenmesi . J. Antimikrobiyal. kimyager. 48 ( Ek 1 ), 5-16. 10.1093/jac/48.suppl_1.5 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Barreto-Bergter E., Pinto MR, Rodrigues ML (2004). Fungal serebrositlerin yapısı ve biyolojik fonksiyonları . Bir. Acad. sutyen Cenc. 76 , 67-84. 10.1590/S0001-37652004000100007 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Behnsen J., Hartmann A., Schmaler J., Gehrke A., Brakhage AA, Zipfel PF (2008). Fırsatçı insan patojenik mantarı Aspergillus fumigatus , konakçı kompleman sisteminden kaçar . Bulaş. bağışık. 76 , 820-827. 10.1128/IAI.01037-07 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Berman J., Sudbery PE (2002). Candida albicans : tomurcuklanan mayadan alınan dersler üzerine kurulmuş moleküler bir devrim . Nat. Rev. Genetik 3 , 918-930. 10.1038/nrg948 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Brito G., Inocêncio A., Querido S., Jorge A., Koga-Ito C. (2010). Candida türlerinin in vitro antifungal duyarlılığı . HIV pozitif hastalardan ve kontrol bireylerden elde edilen oral izolatlar . Braz. Oral. Araş. 25 , 28–33. 10.1590/S1806-83242011005000001 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Cabral KM, Almeida MS, Valente AP, Almeida FC, Kurtenbach E. (2003). Pichia pastoris'te aktif antifungal Pisum sativum defensin 1'in (Psd1) üretimi : STE13 proteazın verimsizliğinin üstesinden gelmek . Protein Ekspr. Purif. 31 , 115-122. 10.1016/S1046-5928(03)00136-0 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Canetta E., Adya AK, Walker GM (2006). Etanolün maya hücresi yüzey morfolojisi üzerindeki etkilerinin atomik kuvvet mikroskobik çalışması . FEMS Mikrobiyol. Lett. 255 , 308–315. 10.1111/j.1574-6968.2005.00089.x [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Chang FM, Ou TY, Cheng WN, Chou ML, Lee KC, Chin YP, et al. . (2014). Flukonazole kısa süreli maruz kalma, Candida albicans'ta kromozom kaybına neden olur : haploid hücreler üretmek için bir yaklaşım . Mantar Genet. Biol. 70 , 68-76. 10.1016/j.fgb.2014.06.009 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Chang WK, Wimley WC, Searson PC, Hristova K., Merzlyakov M. (2008). Antimikrobiyal peptit aktivitesinin elektrokimyasal empedans spektroskopisi ile karakterizasyonu . Biyokimya. Biyofiz. Açta 1778 , 2430–2436. 10.1016/j.bbamem.2008.06.016 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Daniotti JL, Iglesias-Bartolome R. (2011). Gangliosidlerin metabolik yolları ve hücre içi ticareti . IUBMB Yaşam 63 , 513-520. 10.1002/iub.477 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Da Silva FP, Machado MCC (2012). Antimikrobiyal peptitler: klinik uygunluk ve terapötik çıkarımlar . Peptitler 36 , 308-314. 10.1016/j.peptids.2012.05.014 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- de Medeiros LN, Angeli R., Sarzedas CG, Barreto-Bergter E., Valente AP, Kurtenbach E., et al. . (2010). Antifungal P sd1 bezelye defensinin omurga dinamiği ve NMR spektroskopisi ile membran etkileşimi ile korelasyonu . Biyokimya. Biyofiz. Açta 1798 , 105-113. 10.1016/j.bbamem.2009.07.013 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- de Medeiros LN, Domitrovic T., De Andrade PC, Faria J., Bergter EB, Weissmuller G., et al. . (2014). SPR tarafından değerlendirildiği gibi mantar membran bileşenlerine karşı P sd1 bağlanma afinitesi: glukozilseramidin mantar tanıma ve girişindeki rolü . Biyopolimerler 102 , 456-464. 10.1002/bip.22570 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Deveau A., Hogan DA (2011). Candida albicans tarafından çekirdek algılama düzenlemesi ve biyofilm oluşumunun bağlanması . Yöntemler Mol. Biol. 692 , 219–233. 10.1007/978-1-60761-971-0_16 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Domingues MM, Silva PM, Franquelim HG, Carvalho FA, Castanho MA, Santos NC (2013). Gram-negatif ve Gram-pozitif bakterilerde antimikrobiyal protein rBPI kaynaklı yüzey değişiklikleri . Nanotıp 10 , 543–551. 10.1016/j.nano.2013.11.002 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Donlan RM (2002). Biyofilmler: yüzeylerde mikrobiyal yaşam . Acil. Bulaş. Dis. 8 , 881-890. 10.3201/eid0809.020063 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Eaton P., Zzarte-Luis V., Mota MM, Santos NC, Prudencio M. (2012). Plasmodium enfeksiyonu , karaciğer hücrelerinin şeklini ve sertliğini değiştirir . Nanotıp 8 , 17-19. 10.1016/j.nano.2011.10.004 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Ekşi F., Gayyurhan ED, Balcı İ. (2013). Candida türlerinin dört antifungal ajana karşı in vitro duyarlılıkları, referans et suyu mikrodilüsyon yöntemiyle değerlendirildi . ScientificWorldJournal. 2013 :236903. 10.1155/2013/236903 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- El-Kirat-Chatel S., Beaussart A., Alsteens D., Jackson DN, Lipke PN, Dufrene YF (2013). Candida albicans'ta kaspofungin kaynaklı hücre yüzeyi yeniden yapılanmasının nano ölçekli analizi . Nano ölçekli 5 , 1105-1115. 10.1039/C2NR33215A [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Filippin FB, Souza LC, Maranhao RC (2008). Trigliserit açısından zengin nanoemülsiyon ile ilişkili amfoterisin B: stabilite çalışmaları ve in vitro antifungal aktivite . Quim. Nova 31 , 591-594. 10.1590/S0100-40422008000300024 [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Formosa C., Schiavone M., Martin-Yken H., Francois JM, Duval RE, Dague E. (2013). Caspofunginin iki maya türüne, Saccharomyces cerevisiae ve Candida albicans'a karşı nano ölçekli etkileri . Antimikrobiyal. Ajanlar Chemother. 57 , 3498–3506. 10.1128/AAC.00105-13 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Franquelim HG, Gaspar D., Veiga AS, Santos NC, Castanho MA (2013). Kombine bir atomik kuvvet ve floresan mikroskobu yaklaşımı kullanarak HIV-1 füzyon inhibitörlerinin farklı membran etkileşimlerinin kodunun çözülmesi . Biyokimya. Biyofiz. Açta 1828 , 1777-1785. 10.1016/j.bbamem.2013.03.006 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Garcia R., Magerle R., Perez R. (2007). Nazik kuvvetlerle nano ölçekli kompozisyon haritalama . Nat. Anne. 6 , 405-411. 10.1038/nmat1925 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Gonçalves S., Teixeira A., Abade J., de Medeiros LN, Kurtenbach E., Santos NC (2012). Bezelye defensin P sd1'in membran lipid seçiciliğinin değerlendirilmesi . Biyokimya. Biyofiz. Açta 1818 , 1420–1426. 10.1016/j.bbamem.2012.02.012 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Gray KC, Palacios DS, Dailey I., Endo MM, Uno BE, Wilcock BC, et al. . (2012). Amfoterisin öncelikle mayayı basitçe ergosterolü bağlayarak öldürür . Proc. Natl. Acad. bilim ABD 109 , 2234-2239. 10.1073/pnas.1117280109 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Halter D., Neumann S., Van Dijk SM, Wolthoorn J., De Maziere AM, Vieira OV, et al. . (2007). Glikosfingolipid sentezinde glukozilseramidin Golgi öncesi ve sonrası translokasyonu . J. Hücre Biol. 179 , 101–115. 10.1083/jcb.200704091 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Haşim S., Allison DP, Retterer ST, Hopke A., Wheeler RT, Doktycz MJ, et al. . (2016). β-(1,3)-Glukanın bazı Candida albicans mutantlarında maskelenmesi, hücre Duvarı Yüzey Pürüzlülüğündeki artışlar ve Hücre Duvarı Elastikiyetindeki Düşüşler ile ilişkilidir . Bulaş. bağışık. 85 :e00601–e00616. 10.1128/IAI.00601-16 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Johnson I., Spence MTZ (ed.). (2010). Molecular Probes® El Kitabı , 11. Baskı'da hücre canlılığı, profil oluşturma ve fonksiyon testleri . (Life Technologies Corporation), 651-729. [ Google Akademik ]
- Katzung BG, Ustalar SB, Trevor AJ (2011). Temel ve Klinik Farmakoloji, 12. Ed. (McGraw-Hill Companies, Inc.). [ Google Akademik ]
- Kim KS, Kim YS, Han I., Kim MH, Jung MH, Park HK (2011). Antifungal ajanlarla tedavi edilen Candida albicans'ta hücre ölümü sürecinin nicel ve nitel analizleri . PLoS ONE 6 :e28176. 10.1371/journal.pone.0028176 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Korting HC, Schollmann C., Stauss-Grabo M., Schafer-Korting M. (2012). Antimikrobiyal peptitler ve cilt: translasyonel tıp paradigması . Cilt Eczanesi. Fizol. 25 , 323-334. 10.1159/000341990 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Kruppa M. (2009). Çekirdek algılama ve Candida albicans . Mikozlar 52 , 1-10. 10.1111/j.1439-0507.2008.01626.x [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Lambert RJ, Pearson J. (2000). Duyarlılık testi: doğru ve tekrarlanabilir minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) ve inhibitör olmayan konsantrasyon (NIC) değerleri . J. Uygulama Mikrobiyol. 88 , 784-790. 10.1046/j.1365-2672.2000.01017.x [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Leipelt M., Warnecke D., Zahringer U., Ott C., Muller F., Hube B., et al. . (2001). Glukosilseramid sentazlar, hayvanlarda, bitkilerde ve mantarlarda glukosfingolipidlerin biyosentezinden sorumlu bir gen ailesi . J. Biol. Kimya 276 , 33621–33629. 10.1074/jbc.M104952200 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Li Y., Xiang Q., Zhang Q., Huang Y., Su Z. (2012). Antimikrobiyal peptitlerin son çalışmasına genel bakış: kökenler, işlevler, göreceli mekanizmalar ve uygulama . Peptitler 37 , 207–215. 10.1016/j.peptides.2012.07.001 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Lobo DS, Pereira IB, Fragel-Madeira L., Medeiros LN, Cabral LM, Faria J., et al. . (2007). Antifungal Pisum sativum defensin 1 , hücre döngüsü ile ilgili olarak Neurospora crassa siklin F ile etkileşime girer . Biyokimya 46 , 987-996. 10.1021/bi061441j [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Magonov SN, Elings V., Whangbo M.-H. (1997). Dokunma modu atomik kuvvet mikroskobunda faz görüntüleme ve sertlik . Sörf. bilim 375 , L385–L391. 10.1016/S0039-6028(96)01591-9 [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Martinez NF, Garcia R. (2006). Genlik modülasyonlu atomik kuvvet mikroskobu ile faz kaymalarını ve enerji yayılımını ölçme . Nanoteknoloji 17 , S167–S172. 10.1088/0957-4484/17/7/S11 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- McPhee JB, Scott MG, Hancock RE (2005). Antimikrobiyal ve bağışıklık arttırıcı aktiviteler için konak savunma peptidlerinin tasarımı . Tarak. Kimya Yüksek Verimli Ekran. 8 , 257-272. 10.2174/1386207053764558 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Morizane S., Gallo RL (2012). Sedef hastalığının patogenezinde antimikrobiyal peptitler . J. Dermatol. 39 , 225–230. 10.1111/j.1346-8138.2011.01483.x [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Ulusal Klinik Laboratuvar Standardı Komitesi (1997). Mayanın Et Suyu Seyreltme Antifungal Duyarlılık Testi için Referans Yöntemi. Onaylı Standart M27-A. Wayne PA: Klinik Laboratuvar Standardı Ulusal Komitesi. [ Google Akademik ]
- Nie HY, Taylor AR, Lau WM, Macfabe DF (2011). Faz görüntüleme ile sabitlenmemiş sıçan beyin bölümlerinde ortaya çıkan hücre altı özellikler . Analist 136 , 2270–2276. 10.1039/c1an15125h [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Nimrichter L., Rodrigues ML (2011). Fungal glukosilseramidler: yapısal bileşenlerden yeni antimikrobiyallerin biyolojik olarak aktif hedeflerine . Ön. Mikrobiyol. 2 :212. 10.3389/fmicb.2011.00212 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Ören Z., Hong J., Shai Y. (1997). Seçici sitolitik aktiviteye sahip yeni antibakteriyel diastereomerik peptitlerin bir repertuarı . J. Biol. Kimya 272 , 14643–14649. 10.1074/jbc.272.23.14643 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Pierce CG, Uppuluri P., Tristan AR, Wormley FL, Jr., Mowat E., Ramage G., et al. . (2008). Mantar biyofilmlerinin oluşumu ve bunun antifungal duyarlılık testine uygulanması için basit ve tekrarlanabilir 96 oyuklu plaka tabanlı bir yöntem . Nat. protokol 3 , 1494–1500. 10.1038/nprot.2008.141 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Rittershaus PC, Kechichian TB, Allegood JC, Merrill AH, Jr., Hennig M., Luberto C., et al. . (2006). Glukosilseramid sentaz, Cryptococcus neoformans'ın patojenitesinin temel bir düzenleyicisidir . J. Clin. Yatırım. 116 , 1651-1659. 10.1172/JCI27890 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Rollin-Pinheiro R., Singh A., Barreto-Bergter E., Del Poeta M. (2016). Mantar enfeksiyonlarının tedavisi için hedef olarak sfingolipidler . Gelecek Med. Kimya 8 , 1469-1484. 10.4155/fmc-2016-0053 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Saito K., Takakuwa N., Ohnishi M., Oda Y. (2006). Mayada glukozilseramid varlığı ve mayanın alkali toleransı ile ilişkisi . Uygulama Mikrobiyol. Biyoteknoloji. 71 , 515-521. 10.1007/s00253-005-0187-3 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Silva PM, Goncalves S., Santos NC (2014). Defensinler: ökaryotlardan antifungal dersler . Ön. Mikrobiyol. 5:97 . 10.3389/fmicb.2014.00097 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Srinivasan A., Uppuluri P., Lopez-Ribot J., Ramasubramanian AK (2011). Yüksek verimli bir Candida albicans biyofilm çipinin geliştirilmesi . PLoS ONE 6 :e19036. 10.1371/journal.pone.0019036 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Stephens C. (2002). Mikrobiyoloji: biyofilmlerin parçalanması . Kör. Biol. 12 , R132–R134. 10.1016/S0960-9822(02)00706-6 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Sullan RM, Li JK, Zou S. (2009). Seramid ile zenginleştirilmiş alanların nanomekanik stabilitesinin ölçülmesi . Langmuir 25 , 12874–12877. 10.1021/la903442s [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Thevissen K., Ferket KK, Francois IE, Cammue BP (2003). Mantar önleyici bitki defensinlerinin mantar zarı bileşenleri ile etkileşimleri . Peptitler 24 , 1705-1712. 10.1016/j.peptids.2003.09.014 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Thevissen K., Tavares PD, Xu DM, Blankenship J., Vandenbosch D., Idkowiak-Baldys J., et al. . (2012). Bitki defensin RsAFP2, Candida albicans'ta hücre duvarı stresini, septin yanlış yerleşimini ve seramid birikimini indükler . Mol. Mikrobiyol. 84 , 166-180. 10.1111/j.1365-2958.2012.08017.x [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Thevissen K., Warnecke DC, Francois EJA, Leipelt M., Heinz E., Ott C., et al. . (2004). Böceklerden ve bitkilerden gelen defensinler, mantar glukosilseramidleri ile etkileşime girer . J. Biol. Kimya 279 , 3900–3905. 10.1074/jbc.M311165200 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Torrent M., Pulido D., Rivas L., Andreu D. (2012). Parazitler üzerinde antimikrobiyal peptit etkisi . Kör. İlaç Hedefleri 13 , 1138-1147. 10.2174/138945012802002393 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Tyagi AK, Malik A. (2010a). Limon otu yağının sıvı ve buhar fazında Candida albicans'a karşı antimikrobiyal aktivitesinin yerinde SEM, TEM ve AFM çalışmaları . Mikron 41 , 797-805. 10.1016/j.micron.2010.05.007 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Tyagi AK, Malik A. (2010b). Candida albicans'a karşı seçilmiş uçucu yağların sıvı ve buhar fazlı antifungal aktiviteleri : mikroskobik gözlemler ve Cymbopogon citratus'un kimyasal karakterizasyonu . BMC Tamamlayıcı. Alternatif. Med. 10:65 . 10.1186/1472-6882-10-65 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Van Der Weerden NL, Bleackley MR, Anderson MA (2013). Doğal olarak oluşan mantar önleyici peptitlerin özellikleri ve etki mekanizmaları . Hücre. Mol. Hayat Bilimi. 70 , 3545–3570. 10.1007/s00018-013-1260-1 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
- Wu ZB, Hoover DM, Yang D., Boulegue C., Santamaria F., Oppenheim JJ, et al. . (2003). İnsan beta-defensin 3'ün antimikrobiyal ve kemotaktik aktivitelerini incelemek için mühendislik disülfid köprüleri . Proc. Natl. Acad. bilim ABD 100 , 8880–8885. 10.1073/pnas.1533186100 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Yorum yap