Üzüm Çekirdeği Yağı

[mert]

Sarmaşık | 10-30m | 5-8 Aylar | Ça,Na | Meyve, Yaprak ve Çekirdek yağı

Üzüm, Weinrebe, Vitis Vinifera

Familyası: Üzümgillerden, Weingevaihse, Vitaceae

Drugları: Üzüm meyvesi; Vitis viniferae Fructus
Üzüm yaprağı; Vitis viniferae Foliam
Üzüm çekirdek yağı; Vitis viniferae semenoleum
Üzümün meyvesi taze olarak yenir. Sirkesi pekmezi, şırası, bulaması veya şarabı meyve kabuklarının ise; ilacı yapılmaktadır. Çekirdeklerinin yağı çıkarılır, yapraklarının çayı ne natürel ilacı yapılır.

Giriş: Üzümün asıl vatanı Anadolu Kafkaslar ve Kırım olup, zamanla bura-dan dünyanın diğer ülkelerine yayılmıştır. Takriben 5000 yıldır üzümden sirke, pekmez veya şarap yapılmaktadır. Üzümün ülkeler ve iklime göre çok çeşitli türleri vardır ve bunun 700 civarında olduğu tahmin edilmektedir. Siyah üzümün meyve kabuğu yaprakları ilaç yapımında kullanıldığından bu tür incelemeyi uygun gördük. İtalyanlar siyah üzümün meyve kabuğundan, Almanlar da siyah üzümün yapraklarında ilaç yapmalarıyla ünlüdür. Bu bitkinin de bir anda değeri artmıştır. Horasanlı Türk Hekimi Ebubekir Râzi (ölümü h.311) bundan 1100 yıl önce sirke şurubunu keşfetmiş ve bu sirke şurubu 1000 yıldır İslâm ülkelerinde kullanılmıştır. Modern tıpla birlikte unutulan sirkenin yerini çeşitli kimyasal ilaçlar almıştır. Amerika Birleşik Devletleri’nde 1995’te sirke ve sirke şurubunun faydaları üzerine bir yığın araştırma yayınlandıktan sonra Avrupa ülkeleri de halk arasında yeniden sirke ve sirke şurubu ile tedavi denemelerine başlanmış ve bu konuda raflar dolduracak kitaplar yazılmıştır. ABD’de elma, Avrupa ve İslâm ülkelerinde üzüm, Çin, Japonya ve diğer Asya ülkelerinde ise pirinç sirkesi kullanılır.

Botanik: Üzüm asmasının boyu 30 metreyi bulabilir ve kökleri oldukça derinlere gider. Yaprakları 5 loğlu olup, loplar bazen derin, bazen de küçük olur ve başlangıç kısmı kalp şeklindedir. Yaprakların üst yüzeyi koyu, alt yüzeyi ise açık yeşil renkli ve derin beyazımsı damarlara sahiptir. Yaprakların karşısında birer helizon (sarılma ipliği) bulunur ve bu helizon-larla çevresindeki ağaç veya duvarlara sarılarak, bitkinin çevresine tutunmasını sağlar. Çiçekleri topluca bir arada sarımsı yeşil renkte ve oldukça küçüktürler. Kısaca üzüm olarak adlandırılan meyveleri, üzümün türüne göre siyah, morumsu siyah, sarımsı yeşil, sarı, altın sarısı ve es-merimsi sarı renklerde ve de 1-3 cm büyüklüğünde olabilir.

Yetiştirilmesi: Oldukça çok türü olan üzümün hemen her iklime uygun türleri vardır.

Hasat zamanı: Üzüm yaprakları yaz boyunca toplanıp çayı veya yemeği yapılabilir, fakat toplanan yaprakların ilaçlanmamış olması gerekir.
Üzüm salkımı ise eylül ve ekim aylarında toplanır ve taze olarak yenir, suyu çıkarılır, suyuna şıra denir. Şıradan pekmez, pekmezden de bulama yapılır veya şıradan şarap, şaraptan sirke yapılır.
Meyve suyu çıkarıldıktan sonra geri kalan meyve kabuklarından ilaç ve çekirdeklerinden yağ elde edilir.

Birleşimi;
1) Üzüm meyvesinin birleşimindeki maddeleri şöyle sıralayabiliriz;
a) %15-20 karbonhidrat, çeşitli şeker moleküllerinden oluşur. 0,3 Sabit yağlar, 0,6-1 oranında protein içerir.
b) Organik asitlerden; Elma asidi (malikasit) ve limonasidi (sitrikasit)
c) Vitaminlerden;B1,B2(riboflavin),B3(nikotinamid)B5, B6,c,E- vitaminleri ile provitamin A(B-karotin)
d) Minerallerden; çinko, potasyum, fosfor, demir, bakır, mangan, iyot, sodyum, magnezyum, flor ve kalsiyum içerir.
2) Meyve kabuğundaki;50g,20g protein,2,44g sabityağ 12,5 C vitamini, 2,5g E vitamini, 1,97g potasyum,0,65g Magnezyum, Rutin ve resveratrol ve provitamin A(B-karotin)içerir.
3) Üzüm yapraklarında; Flavonitlerden; Quercetin 3-O-β-D-glukronit ve izoguercitrin içerir.
4) Üzüm çekirdek yağı; Doymamış yağ asitlerinden, Linolasit, Lecitihin, ve E-vitamini içerir.

Araştırmalar: Üzüm yaprağından elde edilen kapsülle ve üzüm meyve kabuğundan elde edilen kapsülle ayrı ayrı araştırmalar yapılmıştır. Üzüm yaprağından elde edilen ilaçlar genellikle Varis ve toplardamar zafiyetine karşı kullanılırken meyve kabuğundan elde edilen ilaçlar ise genellikle kandaki kolesterol ve trigliseriti düşürmek için ve de damar sertliğine karşı kullanılır.
1) İtalya’da 17 sağlık merkezinde (hastane, özel hastane ve muayenehanede) toplam 219 damar sertli (arterioskleroz), Yüksek Kolesterol ve Yüksek Trigiliseridi olan hastalar üzerinde meyve kabuğundan elde edilen kapsülle tedavi denemesi yapılmıştır. Bu hastaların sağlıklarında 3-6 ay içinde iyileşme görülmüş ve kanlarındaki kolesterol ve trigliserit oranı düşmüştür. (nhk 4.99.70)
3) Dr.Gerhard Orth, Leutkirch /Allgau’dan 800 hastası üzerinde 30 yıl süren araştırmasının sonunda; Pankreas zafiyetinin: kas erimesi, yukarı karın sancı ve şişliği, kalp rahatsızlığı, sara ve şeker hastalığına sebep olduğunu tespit etmiştir.
4) 1953 yılında tıp dalında Nobel ödülü alan Biyokimyası Sir Adolf Krebs ve Fritz Albert Lipmann, yaptıkları araştırmada Asetik asitin (=sirke asidi, sirkede %5-6 oranda) organlardaki metabolik değişiklikleri sağladığını belgelemişlerdir. (Nhp 3.98.26)
5) Dr.Schafer (Königstr: zindau) Kimya laboratuvarında sirke inhalas-yonu ile yaptığı deneyde sirke buharının bakterileri (escherichia coli, streptococcus epidermidis, proteus vulgaris ve Pseudomonas aeruginosa) tamamen yok ettiği görülmüştür. (Nhk 3.98.26) Tabii ki bu sirke kimya fabrikalarınca hazırlanan sentetik sirke değil, doğal yollarla hazırlanan tabii sirke olmalıdır.
6) Husyelerimin (TESTİS) şişmesi ve Husye kordonlarımın ağrıması üzerine hava alanındaki doktora (Frankfurt) gittim, doğrusu pek ilgilenmedi. Ben sirke şurubu kullandıktan sonra (15.04.01) şişkinlik ve ağrılar geçti. Huseye şişmesi ve kordon ağrısının kanser olma belirtisi olduğunu okudum (Nhp. 4.01.5.76). Fakat tedaviye ara verince tekrar rahatsızlandım ve sonra Gökçek iksiri ile tedavi oldum.
7) Sirke içmeye uzun bir süre izin nedeni ile ara vermek zorunda kaldım. 27.07.01 de gececi çalışmaya başlayınca Husyelerimdeki ve kordonlardaki ağrı yeniden başladı. Sirke içmeye 10.08.01 de yeniden başladım. Bugün (13.08.01) ağrılarım hemen hemen yok oldu. Husye şişmesi ve ağrıları ile husye kordonlarındaki ağrılara karşı en iyi ilaç Gökçek İksiridir.
8) Sol burun deliğinde bir kuruma ve kaşıntı hissettim. Ev doktoru Nisita isimli bir burun merhemi yazdı. Merhemi kullandığım sürece rahatsızlığım geçiyor, kullanmadığım zaman yeniden rahatsızlıklar azıyordu. Sirke kullandığım sürede burnumdaki rahatsızlıkların da yok olduğunu fark ettim. (09.10.01) Fakat tedaviye ara verince tekrar burun delikleri kuruyordu. Gökçek İksirle (ilk verisiyonu Aloxi) yaptığım tedavi ile iyileşti. (07.05.02)
9) M.Şamil’in (4,5 yaşında) grip nedeniyle bir türlü düşmeyen ateşini düşüremiyordum ve Çocuk oldukça dermansız ve huysuz bir durumda idi. Cumartesi günü saat 16.00 sıralarında baldırlarına sirkeli bez sardım ve 17.00 sıralarında Üniversite Çocuk kliniğine gittiğimizde çocuk tekrar oynamaya ve normal davranmaya başladı ve ateşi düştü. Doktorun verdiği ilaçlara gerek kalmadan sağlığına kavuştu. (Gribe karşı Gökçek İksirinin ilk versiyonu aloxiyi, ateşe karşı sirke kullandım 30.12.2001)


YAPRAKLARI
1-) Bu çalışmanın amacı, kırmızı asma yaprağı ekstresinin (AS195, Antistax ^® , Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim, Almanya) kronik hastalığı olan hastalarda bacak hacmi ve klinik semptomlar üzerindeki etkisini araştırmaktı. venöz yetmezlik (CVI).
CVI hastalarında (CEAP Derece 3-4a) ve orta ila şiddetli klinik semptomlarda 12 hafta boyunca günde 720 mg AS195 ile çok merkezli, randomize, çift kör ve plasebo kontrollü bir çalışma yürütülmüştür. Etkililik son noktaları, suyun yer değiştirme hacmi ile belirlenen uzuv hacmindeki değişiklikler, 10 cm'lik bir görsel analog skalada değerlendirilen klinik CVI semptomları ve global etkinlik değerlendirmeleridir. Tam analiz seti 248 hastayı içeriyordu (plasebo: n = 122; AS195: n = 126). 12 hafta sonra AS195, alt ekstremite hacmini plaseboya göre ortalama 19.9 standart hata (SE) 8.9 ml (%95 güven aralığı (GA): -37.5, −2.3; p = 0.0268; kovaryans analizi, ANCOVA) ile önemli ölçüde azalttı. Hacim azaltma için 0.28'lik standartlaştırılmış etki boyutu, klinik olarak ilgili bir etkiyi gösterir. 84. günde, görsel analog skala ile değerlendirilen 'bacak ağrısı' semptomu AS195 grubunda plasebo grubuna kıyasla azaldı: ortalama fark -6,6 SD 3,3 mm (%95 GA: -13.1,-0,1; p = 0,047 ). Diğer semptomlar önemli bir değişiklik göstermedi. AS195'in tolere edilebilirliği plaseboya benzerdi.
2-) 10) İtalyada Napoli ve Caglari ve daha bir kaç Üniversitenin yaptığı ortak çalımada Üzümüm yağrağı Ekstraktının SARS, COVİD ve HSV Virüsüne karşı etkili olduğunu belgelemişlerdir. Carla Zannella , ¹ Rosa Giugliano , ¹ Annalisa Chianese ,
3-) Sfax Bilimler Fakültesi, Sfax Üniversitesi, BP 1171, 3000, Sfax, Tunus. Asma yaprağı ekstraktının (Vitis vinifera) farelerde antioksidan, antienflamatuar, analjezik ve antipiretik aktiviteleri ve LC-MS/MS analizleri ile aktif bileşenlerinin tanımlanması
4-) Üzüm Yaprağı Ekstresi ile Tedavi Edilen Meme Kanseri Hücrelerinde FASN'yi Proteasomal Bozunmaya Karşı Korur ABD, İtalya ve İ,panya Üniversitelri ortak bitr çalışma yapmışlar ve etkisi ispatlanmıştır.
5-) Siyah üzüm yapraklarının ekstresinden elde edilen kapsülle kronik toplardamar zafiyeti olan 260 hasta üzerinde 4 ay süren bir tedavi denemesi yapılmıştır. Bu deney sonunda hastaların kronik toplardamar zafiyeti’nden (chronic venoz, Insuffizienz) kurtuldukları yani sağlıklarına kavuştukları görülmüştür. (ZP. 5.00.265)

Tesir şekli:; Meyve kabuğu; damar sertliğini giderici, kolesterol ve trigliseridi düşürücü
Yaprakları; toplardamarları güçlendiricidir.

Kullanılması:
1) Araştırmalara göre;
a) Meyve kabuğundan elde edilen ilaçlar; damar sertliği, Yüksek Kolesterol ve Yüksek Trigliseridi önleyici özelliğe sahip olduğu yapılan araştırmalarla tespit edilmiştir.
b) Yapraklarından elde edilen Kapsüller ise kronik toplardamar zafiyetine (chronic. Venös. Insuffizienz) karşı kullanılır.
c) Üzüm sirkesi Pankreas zafiyeti ve Bağırsak mantarlarına karşı kullanılır. (Nhk. 3.98.12)
2) Halk arasında yaygın olarak sirke çok çeşitli maksatla kullanılmaktadır. Bir yandan salata ve çorbalara hazmettirici ve tat verici olarak katılırken, diğer yandan Tedavi amacı ile kullanılmaktadır. Özellikle ABD’lerinde yeniden keşfedilen Sirke şurubu çok yaygın olarak kullanılmaktadır, bilindiği gibi Horasan Türklerinden Hekim Ebubekir Razi ( ölümü Hicri 311) bundan 1100 yıl önce bu tedavi yöntemini keşfetmiştir. Sirkenin enhalasyonla nefes yollarındaki bakterileri yok ettiği ve içildiğinde Bağırsaklardaki zararlı bakterileri ve mantarları zararsız hale getirmek için kullanılır.

Yan tesirleri:
a) Üzümün Meyvesini, Meyve kabuğunun ve de Yaprağının bilinen bir yan tesiri yoktur. Aşırı miktarda ve yüksek dozajda Sirke (sade olarak) alınırsa Mide mukozasını (Mide iç derisini) tahriş eder ve hatta Mideyi delebilir. Bir tanıdığım 4-5 ay kadar her gün sabahları aç karnına bir çay bardağı Sirke içmiş ve neticede Mide kanamasından vefat etti. 120 kg gelen bir bayan da sabahları aç karına yarım çay bardağı Sirke içmiş ( PRO 7=TV Kanalı Mart 2001) ve kadın 35 kg’a inmiş fakat bir şey yiyip içemez olmuş. Mide mukozası tamamen erimişti.
b) Üzüm Şarabının faydalı olduğunu iddia edenler de oldukça çoktur, fakat buna alışanların sonu malum Köprü altları veya duvar dipleridir. Şarap başta Karaciğer ve Sinirleri tahrip eder ve insanı düşünemez ve çalışamaz Ayaş durumuna düşürür. Alkolik olanların çoğu alkolle yetinemeyerek zamanla başka Droglara (sarhoşluk veren) alışırlar. Uzun süre alkol alanların cinsel gücünü kaybettiği ve zamanla boşanmak zorunda kaldıkları bir gerçektir. Şeker hastalarının sirkeyi sade almaları ve bal katmamaları gerekir. Alerji ve üşütme rahatsız-lıklarında limon sirkesi daha etkilidir.

Açıklama: Sirke 7000 yıldır bilinen ve kullanılan çok önemli bir besin maddesidir. Bundan 1100 yıl önce Horasanlı Türk hekimi Ebubekir Razi’nin Sirke şurubunu keşfetmiş ve bu reçete yıllarca İslam Ülkelerinde kullanılmıştır. 1938’de Penisilin ve sonra da Sulfanomitli antibiyotikleri keşfi ile eskiden antibiyotik olarak kullanılan Sirkenin kullanılması unutul-muştur. 1950’li yıllara kadar çok yaygın olarak kullanılan Sirke yerine Limonun kullanılması ile Sirkenin kullanılması daha da azalmıştır. 1953 yılında Tıp alanında Nobel ödülünü kazanan Biyokimyacılar Sir Adolf Krebs ve Fritz Albert, Sirkenin Karaciğerde metabolik değişimlerle çok önemli rol oynadığını belgelemişlerdir. Bu buluştan sonra Sirkenin değeri anlaşılmış ve sonra da Meyve kabuğunun damar sertliğini önlemesi, Kolesterol ve Trigliseridi düşürmesi ve Yapraklarının Toplardamar zafiyetini önlemesiyle Üzüm çok büyük değer kazanmıştır.
Midenin salgıladığı sert aside karşı Pankreas alkolik Sodyum bikarbonat salgılar ve onikiparmak bağırsağına günde 1,5 litre salgı gönderir ve böylece Bağırsaklardaki yarı işlenmiş besinin PH-değer hemen hemen nötrala yakın olur. Şayet Pankreas yetince salgı üretmez veya kalitesiz salgıyı üretirse Karnın yukarısında şişkinlik, karında ağrı, yağ hazımsızlığı (yağlı besinler yiyince yağlı dışkı ortaya çıkar) ve sancılar olur. Şişkinlik Diyaframı yukarı kaldırarak Kalbin sıkışmasın neden olur. Hayvansal yağ ve Proteinlerin sindirilmemesi hücrelerin (özellikle mukozanın=sümüksü iç deri) sertleşmesine bu da Besin Alerjisi, Bahar Alerjisi (Saman nezlesi) Diyabet, sinirsel rahatsızlıkla; hantal hareketler kas erimesi v.b. rahatsızlıklara neden olur. Sirke Pankreası çalıştırır, Bağırsaklardaki patojen (hastalık yapısı) bakterileri ve mantarları yok eder.Protein, Yağ ve Karbonhidratların sindirilmesini sağlar. Peygamber Efendimiz Sirke kullanılan evde kıtlık (yokluk=fakirlik) olmaz buyurmuştur. Bundan Sirkenin insanı dinamikleştirdiği ve hareketlendirdiği, sağlık ve canlılık verdiği anlaşılır. Buna göre Üzüm Sirkesi, Elma Sirkesinden daha sağlıklıdır, bunu kendi üzerinde yaklaşık olarak toplam 5 ay süren Sirkeyle Tedavide gözlemledim. Bundan Elma Sirkesi kötü veya kalitece düşük anlamı çıkmaz, çünkü her bünye değişik yapıdadır, bu nedenle benim için Üzüm Sirkesi, bir başkası içinde Elma Sirkesi ve de Güneydoğu Asyalılar için de Pirinç Sirkesi daha cazip olabilir. Sirkeyle yapılan tedavinin kalıcı olması için yemekleri yavaş yemeli ve çok çiğnemelidir. Aksi halde tam olarak Hücre mitokondrinin (hücrelerin mini atom santrali) tarafından yakılamayan Besin maddelerinden dolayı, aşırı miktarda artık madde (Cüruf) ortaya çıkar. Cürufun Ara dokularda yoğunlaşması Kanın yapısını bozar, Böbrek iltihaplanması, Bahar nezlesi, Astım, romatizma, Akne, Sivilce, Damar sertliği v.b. bütün hastalıkların zamanla ortaya çıkmasına neden olur. Yavaş yemek yeme ve lokmaları çok çiğnemekle (en az 30 defa) Cüruf oranı azalır ve Organlar görevini yapabilecek duruma gelirler. Bir tanıdığım sabahları aç karnına 4 ay süreyle 1 bardak sirke içmişti ve sonunda mide kanamasından öldü. Almanya’da da bir bayan her gün yarım bardak sirkeyi 4 ay süreyle içmişti oda aşırı zayıflamış ve midesi tahrip olmuştu. Mide mukazası eridiğinden ameliyat etmek mümkün olmamıştır. Bana ait bir buluş olan Gökçek İksir ile sirkenin yan tesiri ortadan ka l-dırdım. Böylece Gökçek İksir mide ve bağırsakları koruyucu ve güçlendiricidir. Gastrit ve hatta ülseri iyileştirici bir konuma getirdim. Gökçek İksir vücuttaki her türlü curufu (artık maddeyi: bakteri, virüs, mantar, veya ölüsü veya ölü hücreler ve de kolesterol, lipid, trigliserid vs) arttırıcıdır.



Üzüm, Weinrebe, Vitis Vinifera

[mert]

Üzüm Çekirdeği Ekstrak Yağı

Üzüm çekirdeği içeriğindeki proanthocyanidinler ile anti-ageing (hücre yenileyici), metabolizmaya destek ve anti-oksidan olarak bilinir. Diğer bir etkin olan resveratroller ise kan dolaşımını düzenleyici, kolesterol düşürücü, kalbi rahatlatıcı olarak bilinmektedir. Üzerine çok fazla bilimsel çalışma yapılmasıyla birlikte geleneksel tedavilerde de birçok hastalığa karşı kullanım alanı bulmaktadır.
Hindistan da Jamia Hamdart üniversitesinde yapılan çalışmalarda;

Üzüm çekirdeği ekstraktının, oksidatif stres ve sıçan derisindeki tümör gelişimi üzerindeki etkileri incelenmiş. İncelenen sonuçlar neticesinde uygun doz üzüm çekirdeği kullanıldığında doza bağlı olarak oksidatif strese karşı anti-oksidan görev yaptığı, lipid peroksidasyonunu ve xanthine oksidaz aktivitesini düşürdüğü belirtilmiştir. Dolayısıyla oksidatif strese bağlı kanserleşmeninde böylece önüne geçilmektedir. Ayrıca merkezi gıda teknolojileri enstitüsünün yaptığı araştırmalarda ethanolde elde edilen sıvı ekstraktınçok daha etkili olduğu belirtilmiştir.

Ankara Gazi üniversitesinde diyabetli fareler üzerinde yapılan çalışmalarda;

Üzüm çekirdeği ekstraktının anti-diyabetik ve antioksidan etkileri incelenmiş. Üzüm çekirdeği ekstraktının uygun dozda kullanıldığı da hipoglisemik (şeker düşürücü) ve anti- hiperglisemik (şeker yükselmesini önleyici) etki göstermiştir. Glikoz oksidaz metoduna göre kandaki şeker seviyesini düşürdüğü belirlenmiştir. Bununla birlikte karaciğeri koruduğu da gözlenmiştir. Detoksifikasyon ve anti-oksidan olarak diyabet hastalarında ve birçok hastalıktan korunmada tavsiye edilmektedir. Özelliklede içeriğindeki proanthocyanidin etkin maddesi pankreas salgılarını düzenleyerek hiperglisemi durumunda glisemik indeksi düzenlemektedir.

Ankara üniversitesinde ise üzüm çekirdeği ekstarktının karaciğer hasarları üzerindeki etkileri incelenmiş. Aspartat trans amilaz, alanin transferaz ve glutathione gibi bazı karaciğer enzimleri üzerinde yapılan ölçümlerde dikkate alınarak sonuçlar incelenmiş ve karaciğeri serbest radikal hasarı gibi tahribat yaratan birçok sebepten koruduğu ortaya çıkarılmıştır. Karaciğeri koruma amaçlı vekaraciğer hastalıklarında özellikle kanserli durumlarda çok büyük destek teşkil etmektedir.
İsviçre ve Brezilya da üzüm çekirdeği ekstraktının etkin maddesi olan proanthocyanidin in DNA yı deoksiribo nükleik hasardan koruduğu üzerine çalışmalar yapılmış. Antioksidan gücü sayesinde atherosclerosis (damar tıkanıklığı) ve kalp-damar hastalıklarını önlediği belirtilmiştir. DNA nın hasara uğramasıyla bedensel hücrelerin mutasyona uğramasında da DNA yı hasardan koruyucu anti-mutagenic aktivite gösterdiği belirtilmiştir. (6) Hindistan da Madras üniversitesinde ise üzüm çekirdeği ekstresinin oksidatif DNA hasarını önlediği gibi hücre yenileyici ve anti-ageing özellikleri olduğu belirtilmektedir. (8) Yine DNA hasarına karşı merkezi sinir sistemini koruyucu ve onarıcı etkileri de bilinmektedir.

İspanya da Madrid üniversitesinde

Üzüm çekirdeği ekstraktının sindirim ve bağırsak problemlerini önlemede etkili olduğu üzerine çalışmalar yapılmış. Sindirim problemleri üzerinde kullanılabileceği belirtilmiştir. Bağırsak hastalıklarında ve kanser türlerinde de kullanılmaktadır.(7) Amerika da yapılan başka bir çalışmada bunu desteklemektedir. Oksidatif stressin sebep olduğu mide hasarlarında içeriğindeki proanthocyanidin ile mide mukozasını koruduğu bilinmektedir.

Amerika da Alabama üniversitesinde üzüm çekirdeği ekstresinin beyin üzerindeki etkileri incelenmiş. Proteomics analizi yapıldığında beyin proteinlerini düzenlediği, beyin hastalıklarında kullanılabileceği açıklanmıştır. Alzheimer gibi durumlarda da önerilmektedir.

Arabistan da ve Japonya da üzüm çekirdeği ekstresinin kardiyovasküler sistem üzerindeki etkileri incelenmiş. İçeriğindeki proanthocyanidin etkin maddesinin kalp-damar sağlığını koruduğu özellikle serbest radikal hasarı ile ortaya çıkan doku yıpranmasının önüne geçilebildiği belirtilmiştir. Ayrıcakolesterole bağlı damar tıkanıklığını önlemede ve tedavisinde de kullanılmaktadır. Dokuların hasar görmesini önleyerek, hasar görerek normal bölünen hücrelerin anormalleşmesi ve kanser oluşumunun önüne geçilebilmesi için metabolizmaya güçlü bir destek oluşturmaktadır.


Faydalı olduğu düşünülen hastalıklar:

Damar sertiğini önleme ve damarları koruma etkisi vardır. Basur, hemoroid ve varis gibi toplardamar yetersizliklerinde kullanılır.

Şişlikler ve alerjik ödemlerde faydalıdır.

Damarların korunmasının yanında kolesterolün düşürülmesi konusunda destek sağlayarak kalbi korur. Kalp krizi riskini azaltır.

İyi kolesterolün yükselmesine kötü kolesterolün azalmasına katkıda bulunur.

Karaciğer hastalıkları ve kanın kendini yenilemesinde etkilidir.

Her türlü akciğer hastalıklarında olumlu etkileri bilinmektedir.

Yüksek tansiyonu önler. Şeker hastalığı olanlarda faydalıdır.

Sedef ve egzama gibi deri rahatsızlıklarında etkilidir.

Dişetinde kanama sorunu olanlar için faydalıdır.

Alerjik hastalıklarda kullanılabilir.

Görme gücünde yaşlanmaya bağlı bozulmayı azaltır

Antı-agıng olarak yaşlanma etkilerinden korurken, cilt dokusunun elastikliğini korur ve kırışıklıkları da önler. Yaşlanma etkilerini azaltır.

[maturidi]

Vitis vinifera Yaprağı Ekstresinin SARS-CoV-2 ve HSV-1'e Karşı Antiviral Aktivitesi

Carla Zannella , ¹ Rosa Giugliano , ¹ Annalisa Chianese , ¹ Carmine Buonocore , ^{2, 3} Giovanni Andrea Vitale , ³ Giuseppina Sanna , ⁴ Federica Sarno , ⁵ Aldo Manzin , ⁴ Angela Nebbioso , ⁵ Pasquale Termolino , ⁶ Lucia Massimiliano , ^{5, 7} Galdiero , ¹ Donatella de Pascale , ^{3, *} ve Gianluigi Franci ^8,*
Albrecht von Brunn, Akademik Editör
Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk Reddi
¹ Deneysel Tıp Anabilim Dalı, Campania Üniversitesi “Luigi Vanvitelli”, 80138 Napoli, İtalya; ti.ainapmacinu@allennaz.alrac (CZ); ti.ainapmacinu@onailguig.asor (RG); ti.ainapmacinu@esenaihc.asilanna (AC); ti.ainapmacinu@oreidlag.onailimissam (MG)
² Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü (IBBC), Ulusal Araştırma Konseyi (CNR), 80131 Napoli, İtalya; ti.nzs@eroconoub.enimrac
³ Deniz Biyoteknolojisi Bölümü, Stazione Zoologica Anton Dohrn, Villa Comunale, 80125 Napoli, İtalya; ti.nzs@elativ.aerdnainnavoig
⁴ Biyomedikal Bilimler Bölümü, Cagliari Üniversitesi, Cittadella Universitaria, 09042 Cagliari, İtalya; ti.acinu@annas.g (GS); ti.acinu@niznamodla (AM)
⁵ Hassas Tıp Bölümü, Campania Üniversitesi “Luigi Vanvitelli”, Vico Luigi De Crecchio 7, 80138 Napoli, İtalya; ti.ainapmacinu@onras.aciredef (FS); ti.ainapmacinu@osoibben.alegna (AN); ti.ainapmacinu@iccutla.aicul (LA)
⁶ Biyolojik Bilimler ve Biyolojik Kaynaklar Enstitüsü (IBBR), İtalya Ulusal Araştırma Konseyi (CNR), 80055 Portici, İtalya; ti.rnc.rbbi@onilomret.elauqsap
⁷ BIOGEM, 83031 Ariano Irpino, İtalya
⁸ Tıp, Cerrahi ve Diş Hekimliği Anabilim Dalı “Scuola Medica Salernitana”, Salerno Üniversitesi, 84081 Baronissi, İtalya
^* Yazışma: ti.nzs@elacsaped.alletanod (DdP); ti.asinu@icnarfg (GF)
Bu makale, PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır .
Git: Soyut

Vitis vinifera , önemli biyolojik aktiviteye sahip önemli ve ünlü bir bileşik kaynağını temsil eder. Üzüm posası, kabukları ve tohumları gibi şaraplar ve şaraphane biyoürünleri, bakteri, mantar ve virüsler dahil olmak üzere çok çeşitli insan patojenlerine karşı biyoaktif bileşikler açısından zengindir. Bununla birlikte, asma yapraklarının biyolojik özellikleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu çalışmanın amacı, Vitis vinifera'nın fenolik bileşimi ve antiviral aktivitesinin değerlendirilmesidir.iki insan virüsüne karşı yaprak özü: Herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1) ve pandemik ve şu anda yaygın olan şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2). Ekstraktta HPLC-MS/MS analizi ile yaklaşık 40 fenolik bileşik tanımlandı: bunların çoğu kersetin türevleriydi, diğerleri luteolin, kaempferol, apigenin, isorhamnetin, mirisetin, chrysoeriol, biochanin, isookanin ve scutellarein türevlerini içeriyordu. Yaprak özütü, viral yüzeyde zenginleştirilmiş proteinleri 10 μg/mL'lik çok düşük bir konsantrasyonda doğrudan bloke ederek enfeksiyonun erken aşamalarında hem HSV-1 hem de SARS-CoV-2 replikasyonunu inhibe edebildi. Bu sonuçlar çok umut vericidir ve doğal özlerin antiviral ilaçların tasarımında ve gelecekteki aşıların geliştirilmesinde nasıl kullanılabileceğini vurgulamaktadır.

Anahtar Kelimeler: SARS-CoV-2, HSV-1, antiviral, antimikrobiyal, Vitis vinifera , yaprak özü, doğal özü, flavonoidler, moleküler ağ oluşturma, LC-MS
Git: 1. Giriş

Asma, ekonomik değer ve ekili alan açısından dünya çapında en önemli meyve ürünlerinden biridir. Büyük bir miktar şarap üretimine tabi tutulur; ancak üzüm, moleküler biyoloji, genetik ve üreme için bir model haline geldi ve polifenollerin [ 1 , 2 , 3 ] çalışmasından dirençli genler [ 4 ] gibi spesifik gen ailelerinin araştırılmasına kadar farklı alanlarda önemli araştırma ilgisi topladı. .

Asma, terapötik etkileri ile bilinen biyoaktif bileşikler [ 5 , 6 ] açısından zengin bir bitkidir . Üzüm özü, hepatoprotektif [ 7 ], hipoglisemik [ 8 ], kardiyo-koruyucu [ 9 ], antioksidan [ 10 , 11 ], antibakteriyel [ 11 , 12 , 13 ] ve antiviral aktivitesi [ 11 , 14 ] üzüm kabuğunda, tohumlarında ve sapında bulunan yüksek seviyedeki polifenolik bileşiklerden kaynaklanmaktadır. Uzun yıllardır üzerinde çalışılan anti-kanser etkisi, bu moleküllerin tutarlı antioksidan aktivitesine atfedilebilir.15 , 16 ]. Örneğin, ekstraktlarda en bol bulunan moleküllerden biri olan resveratrol, çeşitli karsinojenez seviyelerinde etki eder [ 17 ]. Üzüm çekirdeği ekstresi, baş ve boyun kutanöz skuamöz hücreli karsinomda epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) [ 18 ] ve meme kanserinde MEPK/ERK1-2 ve MAPK/p38'in ekspresyonunu inhibe ederek, tümör invazivliğini ve ilerlemesini engeller. Quercetin ve kateşinler gibi bazı fenolik bileşikler, östrojenik hormonlara benzerlikleri göz önüne alındığında, meme kanserinde pro- ve anti-östrojenik reseptör tepkisini belirler [ 19 ]. Sharma et al. COX-2 ve prostaglandin reseptörünü (PGE2) bloke eden proantosiyanidinlerin apoptotik aktivitesini gösterdi [ 20]. Bu bağlamda, şarabın iki stilbenoidi, trans-astringin ve trans-piceatannol, siklooksijenazları ve kanser öncesi lezyonları inhibe ederek kanser önleyici bir etki de gösterir [ 21 ]. Son zamanlarda, Di Meo ve ark. iki İtalyan üzüm çeşidinin (Aglianico ve Falanghina) üzüm çekirdeği yarı polar ekstrelerinin anti-kanser aktivitesini değerlendirdi. Her iki çeşidin ekstraktlarının, apoptozu aktive ederek üç farklı mezotelyoma hücre hattının büyümesini ve göçünü engelleyebildiğini bulmuşlardır [ 22 ].

Antibakteriyel aktivite yaygın olarak bildirilmiştir [ 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ]. Andelkoviç et al. [ 29 ], flavonollerin, fenolik asitlerin ve flavan-3-ollerin, esas olarak Gram pozitif bakterileri inhibe eden, antioksidan ve antibakteriyel aktiviteyi sürdüren üzüm yaprağı ekstraktlarının ana bileşenleri olduğunu gösterdi. Benzer bir etki Rodriguez–Vaquero ve ark. [ 30 ], üç Arjantin şarabının antimikrobiyal potansiyelini analiz etti: Listeria monocytogenes büyümesi kafeik asit, rutin ve kersetin tarafından yüksek oranda azaltıldı. Bunun yerine, Papadopoulou ve ark. [ 31], alkolsüz kırmızı ve beyaz şarap özlerinin , Staphylococcus aureus'a karşı gözlemlenenden daha az güçlü olmasına rağmen, Escherichia coli ve Candida albicans'a karşı da antimikrobiyal potansiyele sahip olduğunu bildirdi .

Asma ekstraktının sahip olduğu antiviral aktivite, esas olarak hücre zarının bozulmasını indükleme ve konakçı hücreye bağlanma ve füzyon gibi viral yaşam döngüsünün ilk aşamalarını inhibe etme potansiyeli ile ilgili az sayıda çalışma analiz etmiştir [ 32 , 33 , 34 ] , 35 , 36 ]. Matias et al. [ 37 ], standart bir fenolik bileşik olarak kullanılan Portekizli beyaz şarap yapımı yan ürünlerinin ve resveratrolün anti-adenoviral aktivitesini karşılaştırdılar ve çok ilginç bir şekilde, şarap özütü, enfeksiyondan 24 saat sonra adenovirüs-5 replikasyonunu farklı şekilde inhibe edebildi. resveratrol. Diğer çalışmalar, üzüm çekirdeği ekstresinin (GSE) Hepatit C virüsüne (HCV) karşı antiviral potansiyelini bildirdi.38 ]. Hem ham özüt hem de fenolik bileşikler, Real-Time PCR'de gen ekspresyon seviyelerinin azalmasıyla gözlemlendiği gibi, HCV replikasyonunda önemli bir azalmaya neden oldu. Ayrıca, Su ve ark. [ 39 ], GSE'nin Hepatit A virüsüne (HAV) ve insan enterik virüs taşıyıcılarına karşı virüsidal aktivitesini tanımladı: 0.25, 0.50 ve 1 mg/mL GSE ile 37 °C'de tedaviden sonra viral replikasyon önemli ölçüde azaldı. Ayrıca, Vitis vinifera ( V. vinifera ) yapraklarının antiherpetik ve anti-parainfluenza aktiviteleri araştırılmıştır [ 38 ].], farklı polaritedeki fraksiyonların da farklı antiviral potansiyele sahip olduğunu gösterir. Kloroform ekstraktından elde edilen fraksiyonlu içerik, hem Herpes simplex virüs tip 1 (HSV-1) hem de Parainfluenza virüsüne (PIV) karşı daha yüksek inhibisyon kabiliyeti gösterdi. Çok yakın zamanda, Güney İtalya'nın tipik çeşitlerinden elde edilen üzüm kamışı ekstraktlarının fenolik bileşenleri, antioksidan, antibakteriyel ve esas olarak antiherpetik aktivitesini karakterize ettik .], yani Greco, Aglianico ve Fiano. Fenolik verim en yüksek olduğu için pH 13.00'de ekstraksiyonun optimal koşul olduğunu gösteren farklı pH'larda (1-13) çeşitli ekstraktlar hazırladık. Çeşitli pH'larda farklı bolluk profillerine sahip 75 bileşiğin varlığını tanımladık ve ilginç bir şekilde, üzüm kamışlarında ilk kez altı tanesi tanımlandı. Ayrıca, pH 7.00 ve 13.00'deki özütlerin, HSV-1 enfeksiyonunun erken evrelerinin inhibisyonunda oldukça etkili olduğunu kanıtladık. Bu veriler çok umut vericidir ve asma özlerinin, gıda ve insan kullanımına yönelik diğer malzemelerdeki viral kontaminasyonu azaltmak için ucuz ve çevre dostu yenilikçi antiviral ajanlar olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Bu senaryoda, bir başka önemli biyoaktif bileşik kaynağının,V. vinifera yaprak özütü, iki önemli insan patojenine, yani HSV-1 ve pandemi ve şu anda yaygın olan şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'ye (SARS-CoV-2) karşı güçlü bir antiviral potansiyele sahipti. Herpetik enfeksiyon, insanlarda en yaygın bulaşıcı hastalıklardan birini temsil eder. Virüs iki tipte sınıflandırılabilir: HSV-1 ve tip 2 (HSV-2). 50 yaşın altındaki 3,7 milyar insanın (dünya nüfusunun %66,6'sı) HSV-1 ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir [ 40 ]; ayrıca Dünya Sağlık Örgütü (WHO), 15-49 yaş arası 491.5 milyon kişinin (%13.2) HSV-2 enfeksiyonuna sahip olduğunu gözlemlemiştir. HSV-1, genellikle ağızdan ağıza temasla ve aynı zamanda genital yolla bulaşan, insanları enfekte eden yaygın bir virüstür [ 41 , 42 ]]. Nadiren keratit, yenidoğan enfeksiyonları ve ensefalit gibi en şiddetli ve ölümcül hastalıkların etken maddesi olabilir. SARS-CoV-2 günümüzde dünya çapında insan sağlığı için hem ekonomik hem de bugüne kadar 3.5 milyon kişiye ulaşan ölümler açısından ciddi bir sorun teşkil etmektedir [ 43 ]. SARS ile ilişkili koronavirüs (SARS-CoV) ve Orta Doğu Solunum Sendromu Coronavirüsünün (MERS) neden olduğu diğer pandemik salgınlardan sorumlu diğer zoonotik virüsleri içeren iyi bilinen bir viral aile olan Coronaviridae ailesine aittir . Hastalıklar çok benzerdir ve insanlarda ateş, öksürük, nefes darlığı, kas ağrısı ve ishal ile karakterize şiddetli akut solunum yolu enfeksiyonlarından oluşur [ 44 ].]. Aşıların bulunmasına rağmen ölümler artmaya devam ediyor. Bu nedenlerle, SARS-CoV-2 ve HSV-1 ile etkileşime girebilecek, özellikle doğal kaynaklı yeni umut verici ilaç adaylarının belirlenmesi esastır.

Git: 2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Bitki Malzemesi

Yeşil sağlıklı yapraklar Nisan 2019'da Portici'de (Napoli, İtalya) bir V. vinifera klonundan hasat edildi(var. Paulsen 1103, Nazikçe Napoli Üniversitesi “Federico II”den Dr. Clizia Villano tarafından sağlanmıştır). Bitki aşağıdaki tanımlayıcı özelliklere sahiptir: apeks genişler, sublusty, morumsu kenarlarla yeşil-bronzlaşır. Apikal yapraklar, alt sayfanın kenarları boyunca hafif kadife ile kaplıdır ve kırmızımsı yeşildir. 4. ila 6. yaprakçıklar katlanmamış, bütün, yuvarlak, U şeklinde bir petiolar sinüse sahip, tabanı ana damarları takip ediyor, alt sayfanın damarlarında kıllı ve açık bronz yansımalarla yeşil; kaburgalar kırmızımsıdır; yaprak sapı kısa kadifeye sahiptir. Bitki gövdesi kavisli, nervürlü, araknoid ve bir tarafta morumsu kırmızıdır. Otsu sürgün poligonal, budaklarda kısa kadife ve bir tarafında boğum kırmızısı boğumlu; düğümleri kahverengi-mordur. Tendriller menekşe rengi aralıklı, iki uçlu ve üç katlıdır; erkeksi çiçekler vardır. Yapraklar orta büyüklükte, böbrek şeklinde ve bütündür, kısa bir mesafe için ana kaburgaları takip eden taban ile çok açık petiolar sinüse sahiptirler; dalgalı flep mevcut; üst sayfa yeşil, pürüzsüz, tüysüz ve parlaktır; alt taraf açık yeşildir ve kıllı kaburgalara sahiptir; üst sayfanın alt kısmındaki damarlar pembe; dişler orta büyüklükte, mukronat ve dışbükey kenarlıdır, bu da onu oldukça düzenli kılar. Petiole kısa, kıllı ve bir tarafta şarap gibi kırmızıdır. Odunsu dal orta uzunlukta ve sağlamdır, çok dallıdır, yuvarlak bir kesite sahiptir, hemen hemen pürüzsüz bir yüzeye ve tüysüz, kahverengi benekli grimsi bir renge sahiptir; internodlar 12-14 cm'de orta mesafelidir; tomurcuklar küçüktür. Bitki çiçek açar ve yapraklar orta-geç dönemde düşer. Bitki gür bir alışkanlığa, mükemmel canlılığa, hızlı gelişmeye sahiptir, ve ahşabın iyi olgunlaşması; bitki phylloxera ve bazı mantar hastalıklarına karşı dayanıklıdır. Çoğu aşılama tekniği ile son derece uyumludur ve killi-kireçli, hafif taze, orta derecede klorlu topraklara uyum sağlar ve son olarak hafif acımsı toprakları tolere eder. Bu klonun bir fiş örneği Portici'de tutulur ve çoğaltılır. Büyüme koşulları, Campania (İtalya) bölgesinin normal açık alan koşullarıdır. Taze yapraklar buz üzerinde tutuldu ve hemen dondurularak kurutuldu ve havan tokmağı ile toz haline getirildi. Büyüme koşulları, Campania (İtalya) bölgesinin normal açık alan koşullarıdır. Taze yapraklar buz üzerinde tutuldu ve hemen dondurularak kurutuldu ve havan tokmağı ile toz haline getirildi. Büyüme koşulları, Campania (İtalya) bölgesinin normal açık alan koşullarıdır. Taze yapraklar buz üzerinde tutuldu ve hemen dondurularak kurutuldu ve havan tokmağı ile toz haline getirildi. 2.2. Polifenol Ekstraksiyonu

Polifenoller, bazı değişikliklerle Docimo ve diğerleri, 2016 [ 45 ] tarafından geliştirilen prosedür izlenerek ekstrakte edildi. 25 mg toz haline getirilmiş yaprak numunesinin ekstraksiyonu için, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübasyon yoluyla, 1.5 mL %75 ( h/h ) metanol/%0.05 ( h/h ) trifloroasetik asit (TFA) içeren bir çözelti kullanıldı. orta hızda sürekli orbital çalkalayıcı. 10 dakika boyunca 19.000 x g'de numune santrifüjünden ve 0.2 mm politetrafloroetilen filtrelerle süzüldükten sonra, özüt bir Vakum Yoğunlaştırıcı (Eppendorf, Hamburg, Almanya) içinde konsantre edildi ve liyofilize edildi. Toz, DMSO:H2 içinde 100 mg/mL'de _{çözündürüldü}O (9:1). Nihai liyofilize tozun kurutulmuş ham bitki materyaline ağırlık oranı, ekstraksiyon verimini hesaplamak için kullanıldı. 2.3. Flavonoidlerin LC-MS Analizi

Ekstrakt, 5 mg/mL'de MeOH içinde çözündürüldü ve 3 uL'lik bir kısım, donatılmış bir Q-TRAP™ 4500 (AB Sciex, Framingham, MA, ABD) üzerinde yürütülen bir Bilgiye Bağlı edinim (IDA) deneyi ile analiz edildi. ACQUITY UPLC BEH C18 kolonu ile (130 Â, 1.7 µm, 2.1 mm × 50 mm) (Waters, Milford, MA, ABD). Tam MS spektrumları, Gelişmiş MS (EMS) modunda 300-1000 m/z aralığında elde edildi, ardından en yoğun 5 iyon, Gelişmiş Ürün İyonu (EPI) modunda parçalanmaya tabi tutuldu. EPI, -40 eV çarpışma enerjisi (CE) ile 50-1000 m/z aralığında gerçekleştirilmiştir. Hem EMS hem de EPI negatif modda, 10.000 Da/s tarama hızında, kaynak sıcaklığı 200 °C'de, kılcal voltaj 4.5 kV'da ve kümeden ayırma potansiyeli -150 V'ta gerçekleştirildi.

Gradyan , sırasıyla solvent A ve solvent B olarak H20 ve asetonitril kullanılarak 200 uL/dk'lık bir akışta gerçekleştirildi, her ikisi de %0.01 formik asit ile _desteklendi . Kabul edilen gradyan şu şekilde ayarlandı: 20 dakikada %5 ila %30 B, 1 dakika boyunca %30 B'de izokratik akış, 5 dakikada %30 ila %100 B ve 3 dakika boyunca %100 B'de izokratik akış. 2.4. Moleküler Ağ Oluşturma ve Spektral Kitaplık Arama

GNPS [ 47 , 48 ] üzerinde Özelliğe Dayalı Moleküler Ağ Oluşturma (FBMN) iş akışı [ 46 ] ile bir moleküler ağ oluşturulmuştur . İlk olarak, ham MS verileri ProteoWizard tarafından MSconvert aracı aracılığıyla *.wiff'ten *.mzXML uzantısına dönüştürülmüş ve ikinci olarak sinyalleri temizlemek, gürültüyü silmek ve her bileşiğin tepe alanını hesaplamak için MZmine ile işlenmiştir [ 43 ]. Ağ oluşturma tanımı ve parametreleri, GNPS'den otomatik olarak oluşturulmuştur; Burada kısa bir alıntı sunuyoruz. Çıktı dosyaları FBMN analizi için GNPS'ye aktarıldı ve parametreler aşağıdaki verilere göre ayarlandı: öncü iyon kütlesinin toleransı 2 Da'ya ayarlandı ve MS ^{2'nin toleransı}fragman iyonu 0.5 Da'ya ayarlandı. Moleküler ağ, kenarların 3'ten fazla eşleşen tepe noktasına ve 0,7'den yüksek bir kosinüs puanına sahip olacak şekilde ayarlanmasıyla oluşturulmuştur. Bir moleküler ailenin maksimum boyutu 100'e ayarlandı. Öncü iyon değerinde 300'lük bir aralık farkı içinde MS/MS spektrumlarına karşı analoglar arandı. Son olarak, moleküler ağ Cytoscape kullanılarak görselleştirildi. Tam açıklamaya ve GNPS işine şu bağlantıdan genel olarak erişilebilir: https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/sta...c9bbb1721b92f7 (erişim tarihi 28 Haziran 2021).

Tarif edilen bileşiğin nispi bolluğu da hesaplandı. Kısaca, her bir polifenolün bolluğutablo 1alanının yüzdesi, tüm polifenol alanlarının toplamına bölünerek hesaplanmıştır. GİGM'lerin nispi bolluğu aynı şekilde ancak alanlarına göre hesaplanmıştır.
R e l a t i v e a b n d _ bir n c e =Po l yp h e n o l r e a _ To t bir l po l y _ p e nol l s a r e a s _ _ × 100
(1)
tablo 1

Real-Time PCR'da kullanılan primerler.

HSV-1 UL27 ileri	GCCTTCTTCGCCTTTCGC
HSV-1 UL27 ters	CGCTCGTGCCCCTTCTTCTT
SARS-CoV-2 S ileri	AGGTTGATCACAGGCAGACT
SARS-CoV-2 S ters	GCTGACTGAGGGAAGGAC
GAPDH ileri	CCTTTCATTGAGCTCCAT
GAPDH ters	CGTACATGGGAGCGTC

Ayrı bir pencerede aç 2.5. Hücre Hatları ve Virüs

Vero hücre hattı (ATCC CCL-81), HCT-116 (ATCC CCL-247), A549 (ATCC CCL-185), MCF7 (ATCC HTB-22), H9c2 (ATCC CRL-1446), HepG2 (ATCC HB-8065) ) ve Hacat (ATCC PCS-200-011) hücreleri American Type Culture Collection'dan (ATCC, Manassas, Virginia, Amerika Birleşik Devletleri) satın alındı. Vero hücreleri, nemli bir atmosferde %10 Fetal Bovine Serum (FBS), 100 mg/mL streptomisin, 2 mM L-glutamin ve 100 IU/mL penisilin-streptomisin solüsyonu ile takviye edilmiş Eagle's Minimal Essential Medium'da (EMEM) büyütüldü. %5 CO2 _ile37 °C'de. HepG2 karsinoma hücreleri, %10 FBS, 100 IU/mL penisilin-streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 4.5 g/L glikoz içeren RPMI-1640 Ortamında çoğaltılmıştır. Diğer hücre çizgileri, %10 FBS, 2 mM L-glutamin ve 100 IU/mL antibiyotikler ile Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde çoğaltılmıştır. Hücre kültürü uygulaması için kullanılan tüm malzemeler Euroclone, Milano, İtalya'dan satın alındı. β-galaktosidazı eksprese etmek için CMV IE-1 promotörü tarafından tahrik edilen bir lacZ genini taşıyan HSV-1 (suşu SC16), Vero hücrelerinin tek katmanları üzerinde çoğaltılmıştır. SARS-CoV-2 (klinik izolat, nazikçe Lazzaro Spallanzani Hastanesi, Roma, İtalya tarafından sağlanmıştır) daha önce bildirildiği gibi Vero hücreleri üzerinde yayılmıştır [ 49 ]. SARS-CoV-2 virüsünü içeren tüm deneysel çalışmalar, bir biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL3) muhafaza laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. 2.6. Sitotoksisite Testi

Daha sonra, 4 x 104 hücre/kuyu, ²⁴ oyuklu bir plakaya yerleştirildi ve 48 saat süreyle, 65, 125, 250 ve 500 μg/mL'de V. vinifera özütü ve 24 saat süreyle Vorinostat (SAHA) ile işleme tabi tutuldu. , pozitif kontrol olarak kullanılır. Bu moleküllerin hücre canlılığına karşı aktivitesi, Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) MTT tahlili. Doğal ekstrakt ve SAHA ile muameleden sonra, hücrelere 3 saat boyunca 0,5 mg/mL MTT su çözeltisi ilave edildi. Mor formazan kristalleri, süpernatantın çıkarılmasından sonra, izo-propanol (Carlo Erba Reagents, Cornaredo, İtalya) içinde çözündürüldü ve bir TECAN M-200 okuyucu (Tecan, Männedorf, İsviçre) ile 570 nm dalga boyunda absorbans okundu. ). 2.7. Antiviral Aktivite

Vero, kültür ortamında 12 oyuklu hücre kültürü plakalarına (her oyuk için 2 x 105 ^{hücre /mL) yerleştirildi.} Ertesi gün, yaprak özütü MEM içinde FBS olmadan aşağıdaki konsantrasyonlarda çözüldü: 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 50, 100 ve 500 ug/mL. Antiviral etki, daha önce tarif edildiği gibi farklı tedavi şemaları takip edilerek ölçülmüştür [ 50 ]. Enfektivite inhibisyonunun yüzdesi, CTRL−'dekilere göre ekstrakt varlığında elde edilen plakların sayısı sayılarak hesaplandı (sadece ekstraktsız virüs). Tüm deneyler üç kopya halinde yapıldı. Greco özütü, HSV-1 ve SARS-CoV-2 antiviral tahlilleri için bir pozitif kontrol olarak kullanıldı [ 11 ]. 2.8. gen ifadesi

Vero, 12 oyuklu hücre kültürü plakalarına (2 x ¹⁰⁵hücreler/mL hücreler) kültür ortamında. Ertesi gün, tek tabaka yukarıda tarif edildiği gibi yaprak özütü ve HSV-1 ve SARS-CoV-2 ile işlendi. 24 saat sonra, toplam RNA, TRIzol reaktifi kullanılarak izole edildi ve 260/280 nm'de absorbans ölçülerek nicelendirildi (NanoDrop 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD). Toplam 1 ug toplam RNA, 5x Hepsi Bir Arada RT MasterMix (Applied Biological Materials, Richmond, Kanada) ile cDNA'ya ters kopyalandı. Nicel bir polimeraz zincir reaksiyonu, bir CFX Termal Döngüleyici (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) kullanılarak üç kopya halinde gerçekleştirildi. Ardından, BrightGreen 2x qPCR MasterMix-No Dye (Applied Biological Materials) ve 0.1 uM primer kullanılarak 20 uL reaksiyonlarda 2 uL cDNA amplifiye edildi. UL54, UL52 ve UL27 (HSV-1 için) göreli hedef Ct (eşik çevrim) değerleri, ve S proteini (SARS-CoV-2 için) temizlik geni olarak GAPDH'ye normalleştirildi. Yaprak özü ile muamele edilen hücrelerin mRNA seviyeleri, 2 kullanılarak ifade edildi.^−ΔΔCt yöntemi [ 51 ]. Primerler Eurofins (Vimodrone, Milan, İtalya) tarafından satın alındı ve dizileritablo 1.

Git: 3. Sonuçlar ve tartışma

3.1. V. vinifera Yapraklarının Flavonoid Bileşimi

Negatif iyonizasyon modu HPLC-MS/MS, flavonoidleri karakterize etmek için güçlü yöntemlerden biridir çünkü hem aglikonlar hem de izomerleri ayırt edebilen glikosidik konjugatlar hakkında bilgi sağlar [ 47 , 52 ]. V. vinifera yapraklarının metabolik profilini araştırmak için HPLC-MS/MS IDA analizi yapıldı .

Ham MS verilerini dönüştürmek ve analiz etmek için MZmine [ 53 ] ve GNPS [ 54 ] yazılımı kullanıldı ve son olarak Cytoscape, aşağıda gösterilen karmaşık ağı kurdu.Şekil 1. Her düğüm bir öncü iyonu belirtir, düğüm boyutu örnekteki bolluğuyla (toplam öncü yoğunluğu) güçlü bir şekilde ilişkilidir ve iki düğüm arasındaki kenar boyutu doğrudan onların MS/MS spektrum benzerliğine (kosinüs puanı) bağlıdır [ 55 ]. GNPS sonuçlarının analizi, veri manuel kürasyonu ile birlikte, ağda bir büyük flavonoid kümesi ile birlikte digalaktosilmonoasilgliserol (DGMG) lipidlerine ait daha küçük bir kümenin varlığını kanıtladı; GNPS analizi sırasında diğer eşleştirilmemiş düğümler de tanımlanmıştır (Şekil 1).

Şekil 1
V. vinifera özütü GNPS analizi ve Citoscape görselleştirmesi yoluyla elde edilen ve 1-O,6-O-Digalloyl-ß-D-glucopyranose ile eşleşen iki eşleştirilmemiş düğümle birlikte flavonoidlerin ve digalaktosilmonoasilgliserol kümelerinin varlığını gösteren Özellik Tabanlı Moleküler Ağ (FBMN) özütü ve Isookanin-7-O-glukozit.

Her düğümün atanması manuel olarak küratörlüğünü yaptı ve varsayılan tanımlama şurada raporlandı:Tablo 2. Sonuçlar, bileşik 1'in bir kümede olmadığını ve GNPS açıklama aracı tarafından tanen 1-O,6-O-Digalloyl-β-D-glucopyranose olarak tanımlandığını gösterdi. Tablo 2

V. vinifera moleküler ağından düğümlerin varsayılan atamaları .

polifenoller
1	482.96	5.07	1-O,6-O-Digalloil-β-D-glukopiranoz	483; 301; 312; 271; 211	izler
2	447.22	6.34	Kaempferol-8-C-glukozit	357; 327; 297; 285	izler
3	789.63	6.63	NI	639; 613; 581; 477; 465; 463	izler
4	447.16	7.60	Luteolin-8-C-glukozit (Orientin)	357; 339; 327; 299; 298; 297; 285	izler
5	478.94	8.39	Myricetin-3-O-beta-D-galaktopiranosid	479; 317; 316; 271; 270	%0.1
6	447.03	8.47	Luteolin-6-C-glukozit (Isoorientin)	357; 339; 327; 299; 298; 297; 285	%16.0
7	561.36	8.73	NI	449; 447; 357; 327; 301; 297	izler
8	447.05	8.88	Luteolin-6-C-glukozit (Isoorientin)	357; 327; 299; 297; 285;	%4.9
9	447.00	9.16	Luteolin-4-O-glukozit	447; 327; 285; 284	izler
10	431.03	9.45	Apigenin-8-C-glukozit (Vitexin)	377; 353; 341; 323; 311; 283; 282; 268	%0.7
11	431.06	9.85	Apigenin-6-C-glukozit (Isovitexin)	341; 323; 311; 293; 283; 281; 269	%13.2
12	499.07	10.02	NI	499; 323; 301; 300	%0.1
13	477.03	10.10	Quercetin-O-glukuronid	477; 301;	%44.2
14	463.07	10.30	Quercetin-3-O-glucoside (Isoquercitrin)	463; 301; 300; 271; 255	%3.3
15	447.06	10.62	Biochanin A-7-glukozit (Astragaloside)	447; 327; 285; 284	%4.9
16	461.06	10.81	Chrysoeriol 8-C-glukozit (Scoparin)	371; 341; 326; 313; 299; 298	izler
17	477.09	10.83	Quercetin 3-O-glukuronid	477; 302; 301; 214	izler
18	447.00	10.95	Luteolin-7-O-glukozit (Sinarosit)	447; 327; 285; 284	izler
19	505.57	11.04	Quercetin-3-O-glucose-6″-asetat	505; 301; 300; 271; 255	izler
20	447.09	11.27	Kaempferol-7-O-glukozit	447; 357; 327; 285; 284; 255; 256; 227	%0.3
21	505.37	11.29	Quercetin-O-Asetil heksozit	302; 301; 300; 271; 255	izler
22	462.98	11.31	Quercetin-3-O-galaktozit (Hiperozit)	463; 301; 300; 271	izler
23	593.15	11.54	Kaempferol-3-O-(6-O-rhamnosil-galaktozit)	285; 284; 257; 255	izler
24	483.20	11.63	Luteolin-C-heksosit	483; 271	izler
25	461.05	11.86	Kaempferol 3-O-glukuronid	285; 257; 228	%0.6
26	447.08	11.94	Kaempferol-3-O-glukozit	447; 327; 284; 285; 255; 256; 227	%2,4
27	517.06	12.35	NI	517; 355; 341	izler
28	491.09	12.46	Isorhamnetin-3(7)-O-glukuronopiranosid	491; 315; 300	%8,8
29	431.01	12.95	Apigenin-7-O-glukozit	431; 283	izler
31	463.11	13.45	Quercetin-7-O-glukozit	300; 301	izler
32	475.06	14.34	6-O-Metilskutellarin	285; 284; 255; 256	%0.3
33	639.15	15.22	Quercetin-O-glukuronid-O-heksozit	463; 301	izler
34	477.06	16.24	İzorhamnetin-O-glukozit	477; 315; 314	izler
35	461,37	18.96	4-(3,4-Dihidroksifenil)-5-beta-D-glukopiranoziloksi-7-metoksikumarin	299;284	izler
36	449.26	19.90	İzookanin-7-O-glukozit	449; 431; 287; 269	izler
	Digalaktosilmonoasilgliseroller
37	675.35	24.81	GİGM 18:3	415; 397; 277; 235	%97,1
38	699.34	25.54	GİGM 20:5	653; 415; 397; 323; 255; 235	izler
39	653.81	25.55	DMGM 16:2	653; 415; 397; 277; 255; 235	%2.9

Ayrı bir pencerede aç
GNPS açıklama araçlarıyla birleştirilmiş MS ve MS ^{2 spektrumlarının ayrıntılı bir analizi, 35 flavonoid konjugatının karakterizasyonuna yol açar (bkz.}Tablo 2). Bunların çoğu kuersetin türevleri (8 bileşik), diğerleri luteolin (5 bileşik), kaempferol (4 bileşik), apigenin (3 bileşik), isorhamnetin (2 bileşik), mirisetin, chrysoeriol, biochanin, isookanin ve scutellarein türevlerini içeriyordu. 1 bileşik) (şekil 2). Dört flavonoid tanımlanmadı (NI).

şekil 2
V. vinifera'da tanımlanan flavonoid aglikonların yapıları .

Ayrıca, içinde bulunan her bir bileşiğin nispi bolluğunu hesapladık.Tablo 2Aynı kimyasal sınıf içinde. Sonuçlar, bileşik 13'ün polifenoller arasında en temsilci olduğunu ve toplamın %44'ünden fazlasını oluşturduğunu, ardından sırasıyla %16 ve %13 ile bileşik 6 ve 11'in geldiğini gösterdi. Bileşikler 8 , 14 , 15 , 26 ve 28 her biri %10'dan daha azını oluştururken, diğerleri %1'den az veya eser miktarda bulunur (Tablo 2). GİGM'ler arasında, bileşik 37 , %97 ile en temsili olanıdır, bileşik 38 ise eser miktarda bulunur ve bileşik 39 , kümenin %3'ünü temsil eder. 3.2. Kaempferol ve Luteolin Türevlerinin Tanımlanması

Bileşik 2 , 20 , 23 , 25 ve 26'nın m/z 285'teki aglikon fragmanı, bunların kaempferol veya luteolinden kaynaklandığını ileri sürdü. Bileşikler 2 , 20 ve 26 , m/z 447 [M - H] -'de ^bir yalancı moleküler iyon üretti ve MS ² profili, m/z 357 [M - H'de zirveler sergilediklerinden, tipik heksoz glikozit flavon fragmanları gösterdi. -90] ^- , 327 [M - H-120] ^- ve 297 [M - H-150] ^- . Böylece, MS ² parçalanma profiline ve RT'ye dayalı olarak, bileşik2 , kaempferol-8-C-glukozit, bileşik 20 , kaempferol-7-O-glukozit ve bileşik 26 , kaempferol-3-O-glukozit [ 52 , 56 , 57 ] olarak atanabilir.

Bileşik 23 , m/z 593, (ramnosil-hekzosid) parçasının [M − H-308] ⁻ nötr kaybı (NL) ile karakterize edilir ve MS ² modelinin literatürle karşılaştırılmasıyla kimliği şu şekilde atadık: kaempferol-3-O-(6-O-rhamnosil-galaktozid) [ 58 ]. Bileşik 25 , bir glukuronid biriminin [M - H-176] NL'sini gösterdi ^- ve kaempferol-3-O-glukuronid olarak atandı.

Bileşikler 4 , 6 , 8 , 9 ve 18 m/z 285'te aglikon fragmanının varlığı ile karakterize edilir ve bunların tümü m/z 447 [M - H] -'de ^bir parental iyona sahip izomerlerdir . Bu izomerler, GNPS veri tabanı aracılığıyla tanımlandı ve RT tarafından sırasıyla orientin, izoorientin, luteolin-4-O-glukozit ve ymarosid olarak ayırt edildi. Farklı olarak, bileşik 24 , m/z 483'te ebeveyn iyonu gösterdi ve önceki bir çalışma [ 59 ] ile karşılaştırıldığında genellikle luteolin-C-heksosit olarak atandı. 3.3. Apigenin Türevlerinin Tanımlanması

Bileşik 10 , 11 ve 29 , m/z 431'de aynı [M - H] ^- iyonunu sergiledi. Bileşik 10 ve 11 , m/z 311'de tipik bir C-glikozit [M - H-120] ^- fragmanı gösterdi. ek olarak, bunların MS ² modeli sırasıyla vitexin ve isovitexin parçalanma profillerine karşılık gelir [ 58 ]. 29 izomeri genellikle apigenin-C-glukozit olarak atanmıştır. 3.4. Quercetin Türevlerinin Tanımlanması

Bileşik 13 , 14 , 17 , 19 , 21 , 22 , 31 ve 33'ün tümü, m/z 301'de kersetin aglikon varlığı ile karakterize edilir. Bileşik 13 ve 17 , m/z 477 [M - H] 'de ebeveyn iyonu gösterdi. ^- NL 176 Da [M - H-176] ile ^- bu, glukuronil parçasının özelliğidir. Bileşik 17 , GNPS atama aracı tarafından quercetin-3-O-glukuronid olarak tanımlanırken, izomeri bileşik 13, geçici olarak quercetin-O-glucuronide [ 60 ] olarak tanımlandı.]. Bileşikler 14 , 22 ve 31 , m/z 463 [M - H] ^-'de aynı psödomoleküler iyonu gösterdi ve bir glukozit parçasının NL'sini [M - H-162] ^- gösterdi . GNPS, bileşik 14'ü izokersitrin olarak tayin ederken, bileşikler 22 ve 31 , RT ve MS ² fragmanlarının önceki çalışmalarla karşılaştırılması yoluyla geçici olarak sırasıyla hiperosid ve kersetin-7-O-glukozit olarak tahsis edildi [ 58 , 61 ]. Bileşik 19 , m/z 505 [M − H] ^, GNPS tarafından Quercetin-3-O-glucose-6″-asetat olarak tanımlanırken, izomer bileşiği21 jenerik olarak quercetin-O-acetyl hexoside [ 60 ] olarak atanmıştır.

Bileşik 33 , m/z 639 [M - H] ^- m/z 463 ve 301'de sırasıyla glukuronil ve heksosil kısımlarının kaybına karşılık gelen fragmanlar gösterdi . Bu nedenle, bu kanıt üzerine ve önceki bir çalışma ile tutarlı olarak [ 62 ], bu bileşiği quercetin-O-glucuronide-O-hexoside olarak atadık. 3.5. Isorhamnetin Türevlerinin Tanımlanması

Bileşikler 28 ve 34 , sırasıyla bir glukuronil [M - H-176] ^- ve heksoz [M - H-162] ^- parçasının NL'sinden sonra izorhamnetin aglikonunun özelliği olan m/z 315'te bir fragman iyonu gösterdi . Literatürle uyumlu olarak, bileşik 28'i izorhamnetin3(7)-O-glukuronopiranosid ve bileşik 34'ü izorhamnetin-O-glukozit [ 63 ] olarak atadık. 3.6. Diğer Flavonoidler Ataması

Bileşikler 5 , 15 , 16 , 32 , 35 ve 36 , GNPS tarafından mirisetin-3-O-β-D-galaktopiranosid, astragalosid, scoparin, 6-O-metilskutellarin, 4-(3,4-Dihidroksifenil)- olarak tanımlandı. Sırasıyla 5-beta-D-glukopiranoziloksi-7-metoksikumarin ve izokanin-7-0-glukozit.

Bileşik 3 , 7 , 12 ve 27'ye herhangi bir tanımlama atayamadık . 3.7. GİGM Ataması

Bileşik 37 , GNPS açıklama aracı ile digalaktosilmonoasilgliserol (DGMG) 18:3 olarak atandı. Karşılaştırıldığında, bileşikler 38 ve 39 geçici olarak sırasıyla DGMG 20:5 ve DGMG 16:2 olarak atanmıştır. 3.8. Antiviral Aktivite

Yaprak polifenol ekstraktının antiviral bir potansiyele sahip olup olmadığını ve viral enfeksiyonun hangi aşamasında etki edebileceğini değerlendirmek için dört koşulda deneyler yaptık: (a) hücrelere aynı anda ekstrakt ve virüs eklenmesi (“birlikte tedavi” ); (b) önce virüsle inkübe edilen ve ardından hücrelere eklenen ekstrakt (“virüs ön tedavisi”); (c) enfekte hücrelere eklenen ekstrakt ("tedavi sonrası"); ve (d) daha önce ekstrakt ile tedavi edilen ve ardından virüs ile enfekte olan hücreler (“hücre ön tedavisi”). Test edilen ekstrakt konsantrasyonları aralığı, sırasıyla zarflı DNA ve RNA virüsleri için bir virüs modeli olarak kullanılan HSV-1 ve SARS-CoV-2 için 0,625 ila 500 µg/mL idi. Viral inhibisyon yüzdesi, tedavi edilmemiş enfekte kontrole (CTRL−) göre hesaplandı.Figür 3veŞekil 4), doğrudan viral zarf üzerinde tezahür eden erken bir etkiyi gösterir. Ekstrakt, hedef hücrelere eklendikten sonra HSV-1 ve SARS-CoV-2 ile inkübe edildiğinde en etkiliydi (birlikte tedavi,Figür 3bir veŞekil 4A) veya virüsle (virüs ön tedavisi,Figür 3BantŞekil 4B) hücre tek tabakasında enfeksiyondan önce. HSV-1 enfeksiyonundan sonra ekstrakt eklendiğinde hiçbir aktivite kaydedilmedi (tedavi sonrası,Figür 3C veŞekil 4C), hücreler ilk önce ekstrakt ile tedavi edildiğinde ve daha sonra enfekte edildiğinde (hücre ön tedavisi,Figür 3D veŞekil 4D). Ayrıntılı olarak, yaprak özütü, 10 µg/mL'lik bir konsantrasyon elde edilene kadar virüs ön tedavi deneyinde HSV-1 replikasyonunu tamamen inhibe edebildi, ancak virüs daha az verimle olsa da 5 µg/mL'de büyümeye devam etti (Figür 3B). Bunun yerine, V. vinifera özütünün antiviral aktivitesi , 10 µg/mL'de %80 olarak ayarlandığından SARS-CoV-2'ye karşı biraz daha düşüktü. HSV-1 olarak, ekstraktın konsantrasyonu 5 µg/mL'ye düşürüldüğünde ilgili herhangi bir inhibisyon tespit edilmedi.

Figür 3
Farklı plak azaltma deneylerinde HSV-1'e karşı yaprak özütünün (μg/mL) antiviral etkisi (% inhibisyon olarak ifade edilir): ( A ) birlikte tedavi; ( B ) virüs ön tedavisi; ( C ) tedavi sonrası; ( D ) hücre ön işlemi. Sunulan sonuçlar üç bağımsız deneyden elde edildi. Veriler ortalama ± SD'dir. İstatistiksel farklılıklar Student t -testi ile analiz edildi, p ≤ 0.05 değeri anlamlı kabul edildi, * p ≤ 0.05.


Şekil 4
Farklı plak azaltma deneylerinde SARS-CoV-2'ye karşı yaprak özütünün (μg/mL) antiviral etkisi (% inhibisyon olarak ifade edilir): ( A ) birlikte tedavi; ( B ) virüs ön tedavisi; ( C ) tedavi sonrası; ( D ) hücre ön işlemi. Sunulan sonuçlar üç bağımsız deneyden elde edildi. Veriler ortalama ± SD'dir. İstatistiksel farklılıklar Student t -testi ile analiz edildi, p ≤ 0.05 değeri anlamlı kabul edildi, * p ≤ 0.05.

Yaprak özütü, HSV-1 ve SARS-CoV-2'ye karşı pozitif kontrol (CTRL+) olarak kullanılan Greco özünden kesinlikle daha güçlü bir antiviral potansiyel gösterdi [ 11 , 64 , 65 , 66 ].

Bu veriler çok ilginçtir ve yaprak özütünün doğrudan viral partiküller üzerinde etki ederek hücre zarı ile etkileşimi bloke edebileceğini gösterir. Viral inaktivasyon mekanizmasını derinleştirmek için, bağlanma testi gibi başka bir antiviral test yapıldı (Şekil 5veŞekil 6), enfeksiyon sırasında sıcaklığı 4 °C'de değiştirerek.

Şekil 5
HSV-1'e karşı yaprak özütünün (μg/mL) erken viral bağlanma deneyi. Antiviral aktivite, inhibisyonun %'si olarak ifade edilir. Sunulan sonuçlar üç bağımsız deneyden elde edildi. Veriler ortalama ± SD'dir. İstatistiksel farklılıklar Student t -testi ile analiz edildi, p ≤ 0.05 değeri anlamlı kabul edildi, * p ≤ 0.05.


Şekil 6
SARS-CoV-2'ye karşı yaprak özütünün (μg/mL) erken viral bağlanma testi. Antiviral aktivite, inhibisyonun %'si olarak ifade edilir. Sunulan sonuçlar üç bağımsız deneyden elde edildi. Veriler ortalama ± SD'dir. İstatistiksel farklılıklar Student t -testi ile analiz edildi, p ≤ 0.05 değeri anlamlı kabul edildi, * p ≤ 0.05.

Ekstraktın virüs-hücre bağlanma olayı üzerindeki inhibitör etkileri, her iki virüsün de konakçı hücreye bağlanmasını engelleyebildiğini ortaya çıkardı. Yaprak özütünün, füzyona tahsis edilen viral glikoprotein içindeki bazı etkileşim alanlarını, yani HSV-1 glikoprotein B ve SARS-CoV- engelleyerek viral zarfın hücre zarı ile bağlanmasını ve sonraki tüm enfeksiyon aşamalarını engellemesi muhtemeldir. 2 başak proteini.

Plak tahlilleriyle elde edilen verileri doğrulamak için , viral enfeksiyonda yer alan ekspresyon genleri üzerindeki V. vinifera etkisini analiz ettik (Şekil 7veŞekil 8).

Şekil 7
Vero hücrelerinde UL27 (glikoprotein B) gen ekspresyon analizi. 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 50, 100 ve 500 µg/ mL'deki V.vinifera yaprak ekstresi HSV-1 ile 1 saat inkübe edildi ve ardından karışım 1 saat daha Vero hücrelerine eklendi. Enfeksiyondan 2 gün sonra RNA özütlendi ve Real-Time PCR gerçekleştirildi. Göreceli ekspresyon gen seviyesi, CTRL−'ye göre hesaplandı.


Şekil 8
Vero hücrelerinde S geni ekspresyon analizi. 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 50, 100 ve 500 µg/mL'de V.vinifera yaprak ekstresi 1 saat SARS-CoV-2 ile inkübe edildi ve ardından karışım 1 saat daha Vero hücrelerine eklendi. Enfeksiyondan 2 gün sonra RNA ekstrakte edildi ve Real-Time PCR gerçekleştirildi. Göreceli ekspresyon gen seviyeleri, CTRL−'ye göre hesaplandı.

HSV-1 antiviral etkisi ile ilgili olarak, yapısal glikoprotein B'yi (gB) kodlayan geç bir gen olan UL27 geni, moleküler tahlil (Şekil 7). Kısaca, daha önce belirtildiği gibi bir virüs ön tedavi deneyi yapıldı ve enfeksiyondan 48 saat sonra RNA toplandı. Sonuçlar, ekstraktın, viral gen ekspresyonunun çoğunu bloke ederek HSV-1 replikasyonunu inhibe ettiğini gösterdi, bu da 10 µg/mL'lik bir konsantrasyonda neredeyse yarıya indi. Replikasyonla ilgili sonuçlar literatüre uygundur [ 67 , 68 , 69 , 70 , 71 ], yaprak ekstraktının virüsidal bir etkiye sahip olduğunu ve herpetik enfeksiyonlar için profilaktik bir tedavi olarak kullanılabileceğini gösterir. V. vinifera yaprak özütünün anti-SARS-CoV-2 aktivitesi de spike protein (S) gen ekspresyonu yoluyla araştırıldı (Şekil 8). S proteini, insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (hACE2) reseptörü [ 72 , 73 , 74 ] yoluyla konakçı hücreye bağlanmak için gerekli olan viral zarfa yerleştirilen anti-reseptörü temsil eder .

V. vinifera özütü, SARS-CoV-2 enfeksiyonundan sonra 10 µg/mL'lik bir konsantrasyona ulaşılana kadar S ifadesini güçlü bir şekilde azalttı ve daha düşük konsantrasyonlarda doza bağlı bir şekilde ifade edilmeye devam etti. Hep birlikte, bu veriler, V. vinifera yaprak özütünün, SARS-CoV-2'ye karşı rapor edilen, büyük bir antiviral ve daha önce hiç araştırılmamış aktiviteye sahip olduğunu gösterdi. Bugüne kadar, flavonoidlerin SARS-CoV-2'ye karşı aktivitesi, biyoinformatik yaklaşımlarla silico'da umut verici sonuçlarla analiz edildi [ 46 , 48 , 75 ]]; ek olarak, bu moleküllerin Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüsü (SARS-CoV) ve Orta Doğu Solunum Sendromu Coronavirüsü (MERS) gibi diğer koronavirüslere karşı aktivitesi yaygın olarak bildirilmiştir [ 76 ]. Yaprak ekstraktında tanımlanan bazı fenolik bileşiklerin halihazırda klinik deney aşamasında olan kersetin gibi antiviral ajanlar olarak rapor edilmiş olmasına rağmen, bu sonuçlar hep birlikte dikkate değerdir [ 77 ]. Bu çalışma, COVID-19 tedavisinde etkili olan quercetin'in yüksek anti-inflamatuar yeteneğine odaklanmaktadır ve dozu, tedavinin türüne bağlıdır: profilaktik kullanım için 500 mg ve iyileştirici tedavi için 1000 mg. 3.9. Sitotoksisite Değerlendirmesi

Yaprak ekstraktının toksikolojik aktivitesini tamamlamak için V. vinifera kolon, akciğer, meme, kardiyomiyosit, hepatosit kanser hücreleri ve ölümsüzleştirilmiş insan keratinosit hücre hattında 65 μg/mL'den 500 μg'ye kadar dört farklı konsantrasyonda 48 saat boyunca test edildi. /mL (Şekil 9A-F). V. vinifera [ 78 ] üzümünün, tohumlarının veya kabuğunun bilinen yayınlanmış antikanser etkisi ile ilgili olarak, yaprak özütü hücre kanseri canlılığında herhangi bir önemli değişiklik indüklemedi. Bu farklı tepki, daha önce bildirilen [ 79 ] ile karşılaştırıldığında, farklı ekstraksiyon metodolojileri veya kullanılan V. vinifera çeşitleri ile açıklanabilir . Bu veriler, bu koşullarda, bu karmaşık polifenolik özütün, diğer hücresel mekanizmaları değiştirmeden belirli bir hedef üzerinde seçici olarak nasıl hareket edebildiğini göstermektedir.

Şekil 9
( A – F ) 500, 250, 125 ve 65 μg/mL'de V. vinifera ile 48 saat tedaviden sonra HCT-116, A549, MCF7, kardiyomiyositler, Hep-G2 ve Hacat hücrelerinin MTT testi ile hücre canlılığı değerlendirmesi . SAHA, 24 saat boyunca 5 μM'de kontrol olarak kullanıldı.

Git: 4. Sonuçlar

Bitkiler, yüksek tıbbi önemi olan önemli bir doğal ürün kaynağını temsil eder [ 51 ]. Flavonoidler olarak polifenoller, bitkiler aleminde yaygın bileşiklerdir ve antioksidan, antimikrobiyal, antikanser, antienflamatuar ve antiviral özellikler dahil olmak üzere farklı biyolojik aktivitelerle karakterize edilirler. Bu çalışmada, V. vinifera'nın ham ekstraktlarını hazırlamak için sulu metanol çözücü kullanılmıştır.yaprakları ve kimyasal profili, negatif iyonizasyon modunda HPLC-MS ile analiz edildi. Bu analiz, çoğu kuersetin türevleri olan 35 flavonoidin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna yol açtı. Diğerleri, luteolin, kaempferol, apigenin, isorhamnetin, mirisetin, chrysoeriol, biochanin, isookanin ve scutellarein türevlerini içeriyordu. Ayrıca, ekstraktın HSV-1 ve SARS-CoV-2'ye karşı antiviral potansiyelini çok ilginç sonuçlarla test ettik ve flavonoidlerin SARS-CoV-2'yi ilk kez inhibe etme kabiliyetini gösterdik. Mevcut pandemik acil durum göz önüne alındığında, sonuçlarımız farmasötik endüstriyel uygulamalar için umut verici bir kaynağı temsil etmektedir.

Git: Teşekkür

Yazarlar, PRIN 2017 “Viral replikasyonun erken fazının doğal ve farmakolojik inhibisyonu (VirSudNet)” N° 2017M8R7N9'a minnettardır.

Git: Yazar Katkıları

Kavramsallaştırma, GF ve DdP; metodoloji, CZ, RG ve AC; yazılım, CB ve GAV; biçimsel analiz, CB; araştırma, CZ, RG ve AC; kaynaklar, MG, PT ve DdP; veri iyileştirme, GS ve FS; yazı—orijinal taslak hazırlama, CZ ve RG; yazma—inceleme ve düzenleme, GF, DdP, GS ve AM; görselleştirme, CB ve AN; denetim, GF, MG ve DdP; fon alımı, MG, LA ve DdP Tüm yazarlar makalenin yayınlanmış versiyonunu okumuş ve kabul etmiştir.

Git: Finansman

CM1406/EPİCHEMBİO; B63D18000560007/Campania Bölgesel Yönetim FASE2: İDEAL; B21C17000030007/Campania Bölgesel Yönetim Teknoloji Platformu Lotta alle Patologie Oncologiche: iCURE.

Git: Çıkar çatışmaları

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Git: Dipnotlar


Yayıncının Notu: MDPI, yayınlanmış haritalarda ve kurumsal bağlantılarda yargı yetkisi iddiaları konusunda tarafsız kalır.



Git: Referanslar

1. Rinaldi A., Villano C., Lanzillo C., Tamburrino A., Jr., Jourdes M., Teissedre PL, Moio L., Frusciante L., Carputo D., Aversano R. Metabolik ve RNA profili oluşturma, proantosiyanidin birikimini açıklar Aglianico üzümünde. Gıda Kimyası 2017; 233 :52-59. doi: 10.1016/j.foodchem.2017.04.093. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
2. Gratl V., Sturm S., Zini E., Letschka T., Stefanini M., Vezzulli S., Stuppner H. Kuzey İtalya'daki 17 yeni tür de dahil olmak üzere umut verici dirençli asma melezlerinde kapsamlı polifenolik profil oluşturma. J. Sci. Gıda Tarımı. 2021; 101 :2380–2388. doi: 10.1002/jsfa.10861. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
3. Sikuten I., Stambuk P., Andabaka Z., Tomaz I., Markovic Z., Stupic D., Maletic E., Kontic JK, Preiner D. Grapevine as a Rich Source of Polyphenolic Compounds. Moleküller. 2020; 25 :5604. doi: 10.3390/moleküller25235604. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
4. Ju YL, Yue XF, Min Z., Wang XH, Fang YL, Zhang JX VvNAC17, strese duyarlı yeni bir asma ( Vitis vinifera L.) NAC transkripsiyon faktörü, absisik aside duyarlılığı artırır ve tuzluluğu, donmayı ve Transgenik Arabidopsis'te kuraklık toleransı. Bitki. Fizyol. Biyokimya. 2020; 146 :98-111. doi: 10.1016/j.plaphy.2019.11.002. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
5. Batiha GE, Beshbishy AM, Ikram M., Mulla ZS, El-Hack MEA, Taha AE, Algammal AM, Elewa YHA Başlıca Doğal Polifenolik Flavonoidin Farmakolojik Aktivitesi, Biyokimyasal Özellikleri ve Farmakokinetiği: Quercetin. yiyecekler. 2020; 9 :374. doi: 10.3390/foods9030374. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
6. Duan J., Zhan JC, Wang GZ, Zhao XC, Huang WD, Zhou GB Kırmızı şarap bileşeni ellagik asit, otofajiyi indükler ve in vitro ve in vivo olarak akciğer kanseri karşıtı aktivite sergiler. J. Hücre Mol. Med. 2019; 23 :143–154. doi: 10.1111/jcmm.13899. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
7. Saadaoui N., Weslati A., Barkaoui T., Khemiri I., Gadacha W., Souli A., Mokni M., Harbi M., Ben-Attia M. İki çeşit asma yaprağı ekstresinin mide koruyucu etkisi ( Vitis vinifera L.) sıçanlarda etanolün neden olduğu oksidatif strese karşı Tunus'un kuzeyinde yetiştirilen doğal yabani ve çeşit. Biyobelirteçler. 2020; 25 :48-61. doi: 10.1080/1354750X.2019.1691266. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
8. Fujita K., Aoki Y., Suzuki S. Asmadan oluşturulan yeni hücre kültürünün antidiyabetik etkileri, Vitis vinifera cv. Koshu. sitoteknoloji. 2018; 70 :993–999. doi: 10.1007/s10616-018-0203-y. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
9. Kim HY, Hong MH, Yoon JJ, Kim DS, Na SW, Jang YJ, Lee YJ, Kang DG, Lee HS Spontan Hipertansif Sıçanlarda HMGB1-TLR4-NFkappaB Sinyali Yoluyla Vitis labrusca Yaprakları Ekstraktının Kardiyovasküler Disfonksiyon Üzerindeki Koruyucu Etkisi. Besinler. 2020; 12:10 . [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
10. Li L., Zhang M., Zhang S., Cui Y., Sun B. Model Şarap Solüsyonlarından Etil Bağlantılı Antosiyanin-Flavanol Pigmentlerinin Hazırlanması ve Antioksidan Aktivitesi. Moleküller. 2018; 23 :1066. doi: 10.3390/moleküller23051066. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
11. Squillaci G., Zannella C., Carbone V., Minasi P., Folliero V., Stelitano D., Cara FL, Galdiero M., Franci G., Morana A. Campania'nın Tipik Çeşitlerinden (Güney İtalya) Üzüm Bastonları ) Yüksek Değerli Biyoaktif Bileşiklerin Kaynağı Olarak: Fenolik Profil, Antioksidan ve Antimikrobiyal Aktiviteler. Moleküller. 2021; 26 :2746. doi: 10.3390/moleküller26092746. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
12. Aliano-Gonzalez MJ, Richard T., Cantos-Villar E. Asma Kamışı Ekstraktları: Ham Bitki Malzemesi, Ekstraksiyon Yöntemleri, Sayım ve Uygulamalar. Biyomoleküller. 2020; 10 :1195. doi: 10.3390/biom10081195. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
13. Sanchez MC, Ribeiro-Vidal H., Esteban-Fernandez A., Bartolome B., Figuero E., Moreno-Arribas MV, Sanz M., Herrera D. Kırmızı şarabın antimikrobiyal aktivitesi ve oenolojik ekstraktlar periodontal patojenlere karşı onaylanmış oral biyofilm modeli. BMC Tamamlayıcı. Alternatif Med. 2019; 19 :145. doi: 10.1186/s12906-019-2533-5. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
14. Lee JW, Kim YI, Im CN, Kim SW, Kim SJ, Min S., Joo YH, Yim SV, Chung N. Üzüm Çekirdeği Proantosiyanidin, AP-1 ve NF-kappaB'nin Bastırılmasıyla Musin Sentezini ve Viral Replikasyonu Engeller p38 MAPKs/JNK Solunum Sinsityal Virüsüyle Enfekte A549 Hücrelerinde Sinyal Yolları. J. Agric. Gıda Kimyası 2017; 65 :4472–4483. doi: 10.1021/acs.jafc.7b00923. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
15. Zhang XY, Li WG, Wu YJ, Zheng TZ, Li W., Qu SY, Liu NF Üzüm tohumlarından elde edilen proantosiyanidin, immünomodülatör mekanizma yoluyla doksorubisinin anti-tümör aktivitesini güçlendirir. Int. İmmünofarmakol. 2005; 5 :1247–1257. doi: 10.1016/j.intimp.2005.03.004. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
16. Lin YS, Chen SF, Liu CL, Nieh S. Üzüm çekirdeği prosiyanidinlerinin ağız kanseri hücrelerinde p53 ile ilişkili hücre ölümü üzerindeki kemoadjuvan potansiyeli. J. Oral Pathol. Med. 2012; 41 :322–331. doi: 10.1111/j.1600-0714.2011.01103.x. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
17. Zykova TA, Zhu F., Zhai X., Ma WY, Ermakova SP, Lee KW, Bode AM, Dong Z. Resveratrol, karsinojenezi engellemek için doğrudan COX-2'yi hedefler. Mol. Kanserojen. 2008; 47 :797-805. doi: 10.1002/mc.20437. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
18. Sun Q., Prasad R., Rosenthal E., Katiyar SK Üzüm çekirdeği proantosiyanidinleri, EGFR ekspresyonunu ve epitelyal-mezenkimal geçişi hedefleyerek baş ve boyun kutanöz skuamöz hücreli karsinom hücrelerinin istilacı potansiyelini inhibe eder. BMC Tamamlayıcı. Alternatif. Med. 2011; 11 :134. doi: 10.1186/1472-6882-11-134. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
19. Schlachterman A., Valle F., Wall KM, Azios NG, Castillo L., Morell L., Washington AV, Cubano LA, Dharmawardhane SF Kombine resveratrol, kersetin ve kateşin tedavisi, çıplak bir fare modelinde meme tümörü büyümesini azaltır. Tercüme Onkol. 2008; 1 :19-27. doi: 10.1593/tlo.07100. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
20. Cai W., Chen G., Luo Q., Liu J., Guo X., Zhang T., Ma F., Yuan L., Li B., Cai J. PMP22 Gastrik Kendini Yenilemeyi ve Kemo Direnci Düzenler Kanser hücreleri. Mol. Kanser Var. 2017; 16 :1187–1198. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-16-0750. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
21. Borai IH, Ezz MK, Rizk MZ, Aly HF, El-Sherbiny M., Matloub AA, Fouad GI AlCl3 kaynaklı Alzheimer hastalığında üzüm yaprağı polifenollerinin belirli biyokimyasal ve nörolojik belirteçler üzerindeki terapötik etkisi. Biyomedikal. Eczacı. 2017; 93 :837-851. doi: 10.1016/j.biopha.2017.07.038. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
22. Di Meo F., Aversano R., Diretto G., Demurtas OC, Villano C., Cozzolino S., Filosa S., Carputo D., Crispi S. Üzüm çekirdeği yarı kutuplu özlerinin insanda anti-kanser aktivitesi mezotelyoma hücre hatları. J. Fonksiyon. yiyecekler. 2019; 61 :103515. doi: 10.1016/j.jff.2019.103515. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
23. Radulescu C., Buruleanu LC, Nicolescu CM, Olteanu RL, Bumbac M., Holban GC, Simal-Gandara J. Organik ve Konvansiyonel Bağlardan Üzüm ( Vitis vinifera L.) Tohumlarının ve Derilerinin Fitokimyasal Profilleri, Antioksidan ve Antibakteriyel Aktiviteleri . Bitkiler. 2020; 9 :1470. doi: 10.3390/bitkiler9111470. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
24. Al-Mousawi AH, Al-Kaabi SJ, Albaghdadi AJH, Almulla AF, Raheem A., Algon AAA Kara Üzüm Çekirdeği Ekstresinin ( Vitis vinifera ) Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus ve Staphylococcus haemolyticus'un Biyofilm Oluşumu Üzerinde Etkisi. Curr Mikrobiyol. 2020; 77 :238–245. doi: 10.1007/s00284-019-01827-0. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
25. Pavic V., Kujundzic T., Kopic M., Jukic V., Braun U., Schwander F., Drenjancevic M. Yaprak Dökülmesinin Blaufrankisch ve Merlot Çeşitlerinin Üzüm Derisi Ekstraktlarının Fenolik Konsantrasyonları, Antioksidan ve Antibakteriyel Aktiviteleri Üzerindeki Etkileri ( Vitis vinifera L.) Moleküller. 2019; 24 :2444. doi: 10.3390/moleküller24132444. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
26. Olejar KJ, Ricci A., Swift S., Zujovic Z., Gordon KC, Fedrizzi B., Versari A., Kilmartin PA Serin İklimden Antioksidan ve Antimikrobiyal Ekstrakt Karakterizasyonu, Beyaz Üzüm Marc. Antioksidanlar. 2019; 8 :232. doi: 10.3390/antiox8070232. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
27. Santella B., Folliero V., Pirofalo GM, Serretiello E., Zannella C., Moccia G., Santoro E., Sanna G., Motta O., De Caro F., et al. Sepsis-Kan Dolaşımı Enfeksiyonlarının Retrospektif Kohort Çalışması. Antibiyotikler. 2020; 9 :851. doi: 10.3390/antibiyotikler9120851. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
28. Zannella C., Shinde S., Vitiello M., Falanga A., Galdiero E., Fahmi A., Santella B., Nucci L., Gasparro R., Galdiero M., et al. Ağız Hastalıklarında İndolisidin Kaplı Gümüş Nanopartiküllerin Antibakteriyel Aktivitesi. Uygulama bilim 2020; 10 :1837. doi: 10.3390/app10051837. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
29. Andelkovic M., Radovanovic B., Andelkovic AM, Radovanovic V. Kırmızı Çeşitlerden Merlot ve Vranac ( Vitis vinifera L.) Bitki Besinlerinden Sağlıklı ve Enfekte Asma Yaprağı Ekstraktlarının Fenolik Bileşikleri ve Biyoaktivitesi Hum. Nutr. 2015; 70 :317-323. doi: 10.1007/s11130-015-0496-3. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
30. Rodríguez Vaquero MJ, Alberto MR, Manca de Nadra MC Şaraplardan fenolik bileşiklerin Listeria monocytogenes büyümesi üzerindeki etkisi. Gıda Kontrolü. 2007; 18 :587–593. doi: 10.1016/j.foodcont.2006.02.005. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
31. Papadopoulou C., Soulti K., Roussis I. Kırmızı ve Beyaz Şarap Fenolik Ekstraktlarının Staphylococcus aureus, Escherichia coli ve Candida albicans Suşlarına Karşı Potansiyel Antimikrobiyal Aktivitesi . Gıda Teknolojisi. Biyoteknoloji. 2005; 43 :41-46. [ Google Akademik ]
32. Lin SC, Ho CT, Chuo WH, Li S., Wang TT, Lin CC Resveratrol ile MERS-CoV enfeksiyonunun etkili inhibisyonu. BMC Enfeksiyonu. Dis. 2017; 17 :144. doi: 10.1186/s12879-017-2253-8. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
33. Yang T., Li S., Zhang X., Pang X., Lin Q., Cao J. Resveratrol, sirtuins ve virüsler. Rev. Med. Virol. 2015; 25 :431–445. doi: 10.1002/rmv.1858. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
34. Friedman M. Şarapların ve şaraphane yan ürünlerinin flavonoid içeriğine göre antibakteriyel, antiviral ve antifungal özellikleri. J. Agric. Gıda Kimyası 2014; 62 :6025–6042. doi: 10.1021/jf501266s. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
35. Vazquez-Calvo A., Jimenez de Oya N., Martin-Acebes MA, Garcia-Moruno E., Saiz JC Doğal Polifenoller Delphinidin ve Epigallocatechin Gallate'in Flavivirüsler Batı Nil Virüsü, Zika Virüsü ve Dang Virüsü'ne Karşı Antiviral Özellikleri . Ön. Mikrobiyol. 2017; 8 :1314. doi: 10.3389/fmicb.2017.01314. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
36. Madeddu S., Marongiu A., Sanna G., Zannella C., Falconieri D., Porcedda S., Manzin A., Piras A. Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV): Bazı Aromatiklerin Antiviral Özellikleri Üzerine Bir Ön Çalışma ve Şifalı Bitkiler. Patojenler. 2021; 10 :403. doi: 10.3390/patojenler10040403. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
37. Matias AA, Serra AT, Silva AC, Perdigao R., Ferreira TB, Marcelino I., Silva S., Coelho AV, Alves PM, Duarte CM Doğal anti-adenoviral ajanların potansiyel bir kaynağı olarak Portekiz şarapçılık kalıntıları. Int. J. Gıda Bilimi. Nutr. 2010; 61 :357–368. doi: 10.3109/09637480903430990. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
38. Sharaf M., El-Deeb N., Eladawi H. Yeni Bir Anti-hepatit C virüsü Ajanı Olarak Üzüm Çekirdeği Ekstraktının Potansiyeli. J. Med. bilim 2012; 12 :107. doi: 10.3923/jms.2012.107.113. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
39. Su X., D'Souza DH İnsan enterik virüslerinin kontrolü için üzüm çekirdeği ekstresi. Uygulama Çevre. Mikrobiyol. 2011; 77 :3982–3987. doi: 10.1128/AEM.00193-11. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
40. Dünya Sağlık Örgütü . Dünya Nüfusunun Büyük Bir Kısmı Herpes Enfeksiyonu İle Yaşıyor. Dünya Sağlık Örgütü; Cenevre, İsviçre: 2020. [ Google Akademik ]
41. Dünya Sağlık Örgütü . Küresel olarak, 50 Yaş Altı Nüfusun Tahmini Üçte İkisine Herpes Simplex Virüsü Tip 1 Bulaşmıştır. Dünya Sağlık Örgütü; Cenevre, İsviçre: 2015. [ Google Akademik ]
42. Stelitano D., Franci G., Chianese A., Galdiero S., Morelli G., Galdiero M. Amino Asitler, Peptitler ve Proteinler: Cilt 43. Cilt 43. Royal Society of Chemistry; Londra, İngiltere: 2019. HSV membran glikoproteinleri, viral girişteki işlevleri ve aşı çalışmalarında kullanımları; s. 14–43. [ Google Akademik ]
43. Dünya Sağlık Örgütü . DSÖ Coronavirus (COVID-19) Panosu. Dünya Sağlık Örgütü; Cenevre, İsviçre: 2021. [ Google Akademik ]
44. Martines RB, Ritter JM, Matkovic E., Gary J., Bollweg BC, Bullock H., Goldsmith CS, Silva-Flannery L., Seixas JN, Reagan-Steiner S., et al. Ölümcül Koronavirüs Hastalığı ile İlişkili SARS-CoV-2 Patolojisi ve Patogenezi, Amerika Birleşik Devletleri. Acil. Bulaş. Dis. 2020; 26 :2005–2015. doi: 10.3201/eid2609.202095. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
45. Docimo T., Francese G., Ruggiero A., Batelli G., De Palma M., Bassolino L., Toppino L., Rotino GL, Mennella G., Tucci M. Patlıcan Meyvesinde Fenilpropanoidler Birikimi: Biyosentetik Karakterizasyonu Bir MYB Transkripsiyon Faktörü ile Genler ve Düzenleme. Ön. Bitki. bilim 2015; 6 :1233. doi: 10.3389/fpls.2015.01233. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
46. Pandey P., Khan F., Rana AK, Srivastava Y. COVID-19 spike protein inhibitörleri olarak flavonoidlerin potansiyelini aydınlatmaya yönelik bir ilaç yeniden kullanım yaklaşımı. Biyoarayüz Arş. Uygulama Kimya 2021; 11 :8482–8501. [ Google Akademik ]
47. Sukovic D., Knezevic B., Gasic U., Sredojevic M., Ciric I., Todic S., Mutic J., Tesic Z. Asma Çeşitleri Vranac'ın Yaprak, Üzüm ve Şarabının Fenolik Profilleri ( Vitis vinifera L. ) Karadağ'dan. yiyecekler. 2020; 9 :138. doi: 10.3390/foods9020138. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
48. Mouffouk C., Mouffouk S., Mouffouk S., Hambaba L., Haba H. SARS-CoV-2 proteazlarını (3CL(pro) ve PL(pro)) hedef alan potansiyel antiviral ilaçlar olarak flavonoller, spike protein, RNA- bağımlı RNA polimeraz (RdRp) ve anjiyotensin dönüştürücü enzim II reseptörü (ACE2) Eur. J. Pharmacol. 2021; 891 :173759. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173759. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
49. Yao X., Ye F., Zhang M., Cui C., Huang B., Niu P., Liu X., Zhao L., Dong E., Song C., et al. Şiddetli Akut Solunum Sendromu Coronavirüs 2 (SARS-CoV-2) Tedavisi için Hidroksiklorokinin Optimize Dozaj Tasarımının İn Vitro Antiviral Aktivitesi ve Projeksiyonu Kliniği . Bulaş. Dis. 2020; 71 :732–739. doi: 10.1093/cid/ciaa237. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
50. Singh M., Zannella C., Folliero V., Di Girolamo R., Bajardi F., Chianese A., Altucci L., Damasco A., Del Sorbo MR, Imperatore C., et al. Yeşil 2D Malzemelerin Gram Pozitif ve Negatif Bakteriler ve Zarflı Virüsler Üzerindeki Eylemleriyle Mücadele. Ön. Biyomüh. Biyoteknoloji. 2020; 8 :569967. doi: 10.3389/fbioe.2020.569967. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
51. Ferhi S., Santaniello S., Zerizer S., Cruciani S., Fadda A., Sanna D., Dore A., Maioli M., D'Hallewin G. Üzüm Yapraklarından Toplam Fenoller Hücre Proliferasyonunu Önler ve Apoptozu Modüle eder -MCF-7 ve HepG2 İnsan Kanser Hücre Hatlarında İlgili Gen Ekspresyonu. Moleküller. 2019; 24 :612. doi: 10.3390/moleküller24030612. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
52. Hassan WHB, Abdelaziz S., Al Yousef HM Suudi Arabistan'da Büyüyen Parkinsonea aculeata L.'nin Sulu Fraksiyonunun Kimyasal Bileşimi ve Biyolojik Aktiviteleri. Arap. J. Chem. 2019; 12 :377–387. doi: 10.1016/j.arabjc.2018.08.003. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
53. Pluskal T., Castillo S., Villar-Briones A., Oresic M. MZmine 2: Kütle spektrometrisi tabanlı moleküler profil verilerinin işlenmesi, görselleştirilmesi ve analizi için modüler çerçeve. BMC Biyoinform. 2010; 11 :395. doi: 10.1186/1471-2105-11-395. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
54. Wang M., Carver JJ, Phelan VV, Sanchez LM, Garg N., Peng Y., Nguyen DD, Watrous J., Kapono CA, Luzzatto-Knaan T., et al. Küresel Doğal Ürünler Sosyal Moleküler Ağ ile kütle spektrometrisi verilerinin paylaşılması ve topluluk küratörlüğü. Nat. Biyoteknoloji. 2016; 34 :828-837. doi: 10.1038/nbt.3597. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
55. Vitale GA, Sciarretta M., Cassiano C., Buonocore C., Festa C., Mazzella V., Nunez Pons L., D'Auria MV, de Pascale D. Molecular Network and Culture Media Variation, Kompleks Metabolik Profili Ortaya Çıkarıyor Pantoea'da bkz. eucrina D2 Asitli Deniz Süngeri ile İlişkili. Int. J. Mol. bilim 2020; 21 :6307. doi: 10.3390/ijms21176307. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
56. Brito A., Ramirez JE, Areche C., Sepulveda B., Simirgiotis MJ HPLC-UV-MS fenolik bileşiklerin profilleri ve Kuzey Şili'de tüketilen üç narenciye türünden meyvelerin antioksidan aktivitesi. Moleküller. 2014; 19 :17400-17421. doi: 10.3390/moleküller191117400. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
57. Geng P., Sun J., Zhang M., Li X., Harnly JM, Chen P. UPLC-PDA-ESI/HRMS(n) kullanılarak buğday ( Triticum aestivum L.) tohumundaki C-glikosil flavonların kapsamlı karakterizasyonu ) ve kütle kusur filtreleme. J. Kütle Spektromu. 2016; 51 :914-930. doi: 10.1002/jms.3803. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
58. Elsadig Karar M., Kuhnert N. UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS Crataegus monogyna ve Crataegus laevigata (Alıç) Yapraklarından, Meyvelerinden ve Bitkisel Türetilmiş Damlalarından (Crataegutt Tropfen) Fenoliklerin Karakterizasyonu J. Chem. Biol. orada. 2016; 1 :102. doi: 10.4172/2572-0406.1000102. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
59. Spinola V., Llorent-Martinez EJ, Castilho PC Madeira kuzukulağının antioksidan polifenolleri (Rumex maderensis): İn vitro simüle edilmiş gastrointestinal sindirimde nasıl hayatta kalırlar? Gıda Kimyası 2018; 259 :105–112. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.03.112. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
60. Dueñas M., Mingo-Chornet H., Pérez-Alonso J., Di Paola R., Gonzalez-paramas AM, Santos Buelga C. Kuersetin glukuronidlerin hazırlanması ve HPLC-DAD-ESI/MS ile karakterizasyonu. Avro. Gıda Araş. Teknoloji. 2008; 227 :1069-1076. doi: 10.1007/s00217-008-0821-2. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
61. Chen G., Li X., Saleri F., Guo M. Rhamnus davurica'daki Flavonoidlerin Analizi ve Antiproliferatif Aktiviteleri. Moleküller. 2016; 21 :1275. doi: 10.3390/moleküller21101275. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
62. Roriz CL, Barros L., Carvalho AM, Santos-Buelga C., Ferreira IC İnfüzyonların hazırlanması için ticarileştirilmiş Cymbopogon citratus ve Pterospartum tridentatum veya Gomphrena globosa karışımlarında sinerjik antioksidan etkilerin bilimsel olarak doğrulanması. Gıda Kimyası 2015; 185 :16–24. doi: 10.1016/j.foodchem.2015.03.136. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
63. Marczak Ł., Znajdek-Awiżeń P., Bylka W. Axyris amaranthoides'ten İzobarik ve İzomerik Flavonoid Konjugatlarını Ayırmak için Kütle Spektrometrik Tekniklerinin Kullanımı. Moleküller. 2016; 21 :1229. doi: 10.3390/moleküller21091229. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
64. Dünya Sağlık Örgütü . Coronavirus Hastalığı (COVID-19) Pandemisi. Dünya Sağlık Örgütü; Cenevre, İsviçre: 2020. [ Google Akademik ]
65. Chianese A., Santella B., Ambrosino A., Stelitano D., Rinaldi L., Galdiero M., Zannella C., Franci G. Epigenetik Modülatörlerle Kombinasyon Terapötik Yaklaşımlarda Onkolitik Virüsler: Geçmiş, Şimdi ve Gelecek Perspektifler . Kanserler. 2021; 13 :2761. doi: 10.3390/kanserler13112761. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
66. Falanga A., Del Genio V., Kaufman EA, Zannella C., Franci G., Weck M., Galdiero S. Janus-Benzeri Dendrimerlerin Herpes Simplex Virüsünün Glikoproteinlerinden Türetilen Peptitler ile Mühendisliği Tip 1: Çok Yönlü Bir Şeye Doğru ve Roman Antiviral Platformu. Int. J. Mol. bilim 2021; 22 :6488. doi: 10.3390/ijms22126488. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
67. Monda V., Valenzano A., Monda M. Hormon Replasman Tedavisi Kullanan Kadınlarda Otonom Sinir Sistemi Aktivitesi ve Dinlenme Enerji Harcamalarındaki Değişiklikler. Biol. Med. 2016; 8 :1. [ Google Akademik ]
68. Schiattarella A., Riemma G., La Verde M., Franci G., Chianese A., Fasulo D., Fichera M., Gallo P., De Franciscis P. Polikistik over sendromu ve probiyotikler: Doğal bir yaklaşım İltihaplı hastalık. Kör. Kadın Sağlığı Rev. 2021; 17 :14–20. doi: 10.2174/1573404816999200601162506. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
69. Russo M., Moccia S., Spagnuolo C., Tedesco I., Russo GL Koronavirüs enfeksiyonuna karşı flavonoidlerin rolleri. Kimya Biol. Etkileşime girmek. 2020; 328 :109211. doi: 10.1016/j.cbi.2020.109211. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
70. Urmenyi FG, Saraiva GD, Casanova LM, Matos AD, de Magalhaes Camargo LM, Romanos MT, Costa SS Anti-HSV-1 ve HSV-2 Flavonoidler ve Kalanchoe daigremontiana Tıbbi Bitkisinden Yeni Kaempferol Triglycoside. Kimya Biyodiverler. 2016; 13 :1707-1714. doi: 10.1002/cbdv.201600127. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
71. Abdallah HM, El-Halawany AM, Sirwi A., El-Araby AM, Mohamed GA, Ibrahim SRM, Koshak AE, Asfour HZ, Awan ZA Bazı Doğal Ürün İzolatlarının In yoluyla SARS-COV-2 Ana Proteaz İnhibitörleri Olarak Yeniden Amaçlanması Vitro Hücresiz ve Hücre Bazlı Antiviral Değerlendirmeler ve Moleküler Modelleme Yaklaşımları. İlaç. 2021; 14 :213. doi: 10.3390/ph14030213. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
72. Conceicao C., Thakur N., Human S., Kelly JT, Logan L., Bialy D., Bhat S., Stevenson-Leggett P., Zagrajek AK, Hollinghurst P., et al. SARS-CoV-2 Spike proteini, memeli ACE2 proteinleri için geniş bir tropizme sahiptir. PLoS Biol. 2020; 18 :e3001016. doi: 10.1371/journal.pbio.3001016. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
73. Hoffmann M., Kleine-Weber H., Schroeder S., Kruger N., Herrler T., Erichsen S., Schiergens TS, Herrler G., Wu NH, Nitsche A., et al. SARS-CoV-2 Hücre Girişi ACE2 ve TMPRSS2'ye Bağlıdır ve Klinik Olarak Kanıtlanmış Proteaz İnhibitörü Tarafından Engellenir. Hücre. 2020; 181 :271–280.e8. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.052. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
74. Zhao P., Praissman JL, Grant OC, Cai Y., Xiao T., Rosenbalm KE, Aoki K., Kellman BP, Bridger R., Barouch DH, et al. Glikosile SARS-CoV-2 Spike ve İnsan ACE2 Reseptörünün Virüs-Reseptör Etkileşimleri. Hücre Konak Mikrobu. 2020; 28 :586-601.e6. doi: 10.1016/j.chom.2020.08.004. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
75. Jain AS, Sushma P., Dharmashekar C., Beelagi MS, Prasad SK, Shivamallu C., Prasad A., Syed A., Marraiki N., Prasad KS Spike glikoprotein üzerinde etkili antiviral ajanlar olarak flavonoidlerin siliko değerlendirmesi SARS-CoV-2. Suudi J. Biol. bilim 2021; 28 :1040–1051. doi: 10.1016/j.sjbs.2020.11.049. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
76. Taban AK, Suntar İ. Koronavirüs Enfeksiyonlarına Karşı Potansiyel Antiviral Stratejiler Olarak Flavonoidlere Genel Bir Bakış. Gazi Med. J. 2020 doi: 10.12996/gmj.2020.117. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
77. Quercetin'in COVID-19'un Profilaksisi ve Tedavisine Etkisi. [(28 Haziran 2021'de erişildi)];Çevrimiçi olarak erişilebilir: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT04377789
78. Grace Nirmala J., Evangeline Celsia S., Swaminathan A., Narendhirakannan RT, Chatterjee S. A431 cilt kanseri hücrelerinde Vitis vinifera kabuğu ve tohum özleri tarafından indüklenen sitotoksisite ve apoptotik hücre ölümü . sitoteknoloji. 2018; 70 :537-554. doi: 10.1007/s10616-017-0125-0. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
79. Abed A., Harb J., Khasib S., Saad B. Filistin'in kurak ve ılıman bölgelerinden toplanan iki üzüm çeşidinin yapraklarının sitotoksik, antioksidan ve antimikrobiyal aktivitelerinin in vitro değerlendirilmesi. QSci. Bağlamak. 2015; 2015 : 4. [ Google Akademik ]

[maturidi]

Asma yaprağı ekstraktının (Vitis vinifera) farelerde antioksidan, antienflamatuar, analjezik ve antipiretik aktiviteleri ve LC-MS/MS analizleri ile aktif bileşenlerinin tanımlanması

Bahta Aouey¹, Amira Mahjoubi Samet², Hamadi Fetui³, Monique SJ Simmonds⁴, Muhammed Buaziz⁵
Bağlantılar yıkılmak Bağlantılar

• ¹Toksikoloji-Mikrobiyoloji ve Çevre Sağlığı Laboratuvarı, UR11ES70, Sfax Bilimler Fakültesi, Sfax Üniversitesi, BP 1171, 3000, Sfax, Tunus.
• ²Toksikoloji-Mikrobiyoloji ve Çevre Sağlığı Laboratuvarı, UR11ES70, Sfax Bilimler Fakültesi, Sfax Üniversitesi, BP 1171, 3000, Sfax, Tunus; Sfax Biyoteknoloji Enstitüsü, Sfax Üniversitesi, BP 1175, 3038, Sfax, Tunus.
• ³Toksikoloji-Mikrobiyoloji ve Çevre Sağlığı Laboratuvarı, UR11ES70, Sfax Bilimler Fakültesi, Sfax Üniversitesi, BP 1171, 3000, Sfax, Tunus. Elektronik adres: fetoui_hamadi@yahoo.fr.
• ⁴Kraliyet Botanik Bahçeleri, Kew, Richmond, Surrey TW9 3 AB, Birleşik Krallık.
• ⁵Sfax Biyoteknoloji Enstitüsü, Sfax Üniversitesi, BP 1175, 3038, Sfax, Tunus; Elektrokimya ve Çevre Laboratuvarı. Sfax Ulusal Mühendislik Okulu, BP 1173, 3038, Sfax Üniversitesi, Sfax, Tunus.

• PMID: 27780137
• DOI: 10.1016/j.biopha.2016.10.033

Soyut

Etnofarmakolojik uygunluk: Vitis vinifera'nın yaprakları, geleneksel tıpta ishal, hepatit ve karın ağrıları için kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, Vitis vinifera'nın (EVV) hidroalkolik yaprak ekstraktının antioksidan, antienflamatuar, analjezik ve antipiretik özelliklerini deneysel modeller üzerinde araştırmak ve kullanımına bilimsel temel sağlamaktı.

Malzemeler ve yöntemler: EVV, LC-MS/MS analizleriyle kimyasal olarak karakterize edildi. EVV özütünün in vitro antioksidan aktiviteleri, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) radikal süpürme deneyi ve Ferrik indirgeyici antioksidan güç deneyi (FRAP) kullanılarak ölçüldü. Farelerde asetik asit ile indüklenen kıvranma ve formalin testi kullanılarak analjezik aktivite, farelerde karagenan ile indüklenen pençe ödemi ve asetik asit ile indüklenen vasküler geçirgenlik kullanılarak anti-inflamatuar aktivite ve sıçanlarda Brewer mayası ile indüklenen pyrexia kullanılarak antipiretik aktivite 100mg/kg, 200mg olarak değerlendirildi. /kg ve 400mg/kg ekstrakt dozları.

Sonuçlar: Ekstraktın (EVV) resveratrol, kersetin, kateşin, flavon, flavonoller, antosiyanin, gallik asit ve epikateşin içerdiği bulundu. EVV, karagenan kaynaklı pençe ödemine karşı önemli doz yanıtlı anti-inflamatuar aktivite üretti. 100, 200 ve 400 mg/kg/kg dozlarındaki EVV, carrageenan enjeksiyonundan 5 saat sonra carrageenan kaynaklı pençe ödemini sırasıyla %34,48 (P<0,05), %36,20 (P<0,05) ve %41,37 (P<0,05) oranında azalttı. . Ayrıca EVV özütü, farelerde doza bağlı olarak asetik asit kaynaklı vasküler geçirgenliği önemli ölçüde azaltır. EVV (100, 200 ve 400mg/kgbw), formalin testinde önemli doz-tepki analjezik aktivite üretti. Bununla birlikte, düşük yüzdeli inhibisyon (%50), bunun merkezi etkili bir analjezik olmadığını düşündürür. 100, 200 ve 400mg/kg vücut ağırlığı dozlarında özüt, po asetik asit kaynaklı kıvranmayı sırasıyla %48.15 (p<0.05), %57.97 (p<0.05) ve %68.09 (p<0.05) ile önemli ölçüde azalttı. Ekstrakt ayrıca ikinci fazda formalin kaynaklı ağrının belirgin doza bağlı inhibisyonuna neden oldu (p<0.05). Standart grupta 21. ve 23. saatte ve ekstraktın 200mg/kg ve 400mg/kg dozlarında 23. saatte (p<0.05) 19 saate kıyasla rektal sıcaklıklarda istatistiksel olarak anlamlı azalma gözlendi.

Sonuçlar: Elde edilen sonuçlar, çeşitli enflamatuar ve ağrılı hastalıkların tedavisinde bitkinin geleneksel kullanımı iddiasını destekleyen test edilen dozlarda gözlemlenen V. vinifera'nın hidroalkolik yaprak ekstraktının potansiyel analjezik, antienflamatuar ve antipiretik etkilerini gösterdi.

[maturidi]

SUMOylation, Üzüm Yaprağı Ekstresi ile Tedavi Edilen Meme Kanseri Hücrelerinde FASN'yi Proteasomal Bozunmaya Karşı Korur

Andrea Floris , ^{1, 2} Michael Mazarei , ^{1, 2} Xi Yang , ^{1, 2} Aaron Elias Robinson , ^{2, 3} Jennifer Zhou , ^{1, 2} Antonio Barberis , ^{4, 5} Guy D'hallewin , ^{4, 5} Emanuela Azara , ^{5, 6} Ylenia Spissu , ^{4, 5} Ainhoa Iglesias-Ara , ⁷ Sandro Orrù , ⁸ ve Maria Lauda Tomasi ^{1, 2, *}
Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk Reddi
¹ Tıp Departmanı, Los Angeles, CA 90048, ABD; moc.liamg@9711sirolfaerdna (AF); gro.shsc@ierazam.leahcim (MM); gro.shsc@gnay.ix (XY); moc.oohay@7914uohz.j (JZ)
² Cedars-Sinai Tıp Merkezi, Los Angeles, CA 90048, ABD; moc.liamg@nosnibor.noraa
³ Tıp Bölümü, İleri Klinik Biyosistemler Araştırma Enstitüsü, Smidt Kalp Enstitüsü, Los Angeles, CA 90048, ABD
⁴ Gıda Üretimi Bilimleri Enstitüsü (ISPA), 07100 Sassari, İtalya; ti.rnc@sirebrab.oinotna (AB); ti.rnc.apsi@niwellahd.yug (GD); ti.ssinu@ussipsy (YS)
⁵ Ulusal Araştırma Konseyi (CNR), 07100 Sassari, İtalya; ti.rnc.bci@araza.aleuname
⁶ Biyomoleküler Kimya Enstitüsü (ICB), 07100 Sassari, İtalya
⁷ Genetik, Fiziksel Antropoloji ve Hayvan Fizyolojisi Bölümü, Bask Ülkesi Üniversitesi (UPV/EHU), 48940 Bilbao, İspanya; se.uhe@saiselgi.aohnia
⁸ Tıp Bilimleri ve Halk Sağlığı Bölümü, Cagliari Üniversitesi, 09042 Cagliari, İtalya; ti.acinu@urro.s
^* Yazışma: gro.shsc@isamot.adualairam ; Tel.: +310-423-6347; Faks: +310-423-0653
Bu makale, PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır . İlişkili Veriler

Ek Malzemeler Veri Kullanılabilirlik Bildirimi
Git: Soyut

Meme kanseri için mevcut terapötik stratejiler, tümör nüksü ve ilaç direnci ile sınırlıdır. Flavonoidler gibi antioksidan bitki kaynaklı bileşikler olumsuz sonuçları azaltır ve daha az istenmeyen yan etkileri olan potansiyel bir antineoplastik ajan kaynağı olarak tanımlanmıştır. Burada, de novo yağ asidi sentezindeki anahtar enzim olan yağ asidi sentazının (FASN) yeni düzenlemesini açıklıyoruz, bu sayede Vitis viniferaL. cv Vermentino yaprağı hidroalkolik özü, küçük ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO)ilasyon tarafından düzenlenen protein stabilitesini düşürür. Fenolik bileşiklerin karakterizasyonu sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS), kütle spektrometrisi (LC-MS/MS), Western blot/ko-immünopresipitasyon (Co-IP) ve RT-PCR, 3-(4,) ile gerçekleştirilmiştir. 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT), klonojenisite deneyleri ve FACS analizi, hedeflerin ekspresyonunu ve tümörijenisiteyi ölçmek için kullanıldı. Vermentino özütü, antitümorijenik etkiler sergiler ve SUMOylation için gerekli tek E2 enzimi olan FASN ve ubikuitin-konjuge edici enzim 9'un (UBC9) önemli ölçüde azaldığını belirlemeye devam ettik. Ayrıca, FASN'nin insan meme kanseri dokularında ve hücre dizilerinde SUMOillenmiş bulundu. ve SUMO2 susturmanın neden olduğu SUMOylation eksikliği, FASN protein stabilitesini azalttı. Bu sonuçlar, SUMOylation'ın FASN'yi proteasomal bozulmaya karşı koruduğunu ve lipid metabolizmasının değiştirilmesi yoluyla onkojenik aktivite uygulayabileceğini, buna karşın Vermentino özütünün, bu bileşiğin meme kanserinde terapötik değerinin ek doğrulamasını destekleyen bu etkileri engellediğini göstermektedir.

Anahtar Kelimeler: antioksidan, meme kanseri, FASN, lipid metabolizması, polifenoller, protein degradasyonu, protein stabilitesi, ubiquitination, SUMOylation
Git: 1. Arkaplan

Meme kanseri, dünya çapında kadınlarda en sık görülen malign kanserdir [ 1 ]. Ameliyat, endokrin tedavisi ve kemoterapiyi içeren meme kanseri için mevcut terapötik stratejiler, tümör nüksü ve ilaç direnci ile sınırlıdır [ 2 ]. Bu nedenle, mevcut terapötik ajanların etkinliğini artırmak ve mevcut klinik protokolleri iyileştirmek için yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır.

Adjuvan tedaviler genellikle tümör hücrelerinde sitotoksisiteyi indüklemeye çalışır. Tümör hücrelerinin de novo yağ asidi sentezi gibi alternatif metabolik süreçlere dayandığı bilindiğinden, bu yollar birçok potansiyel terapötik hedefi barındırır. Aslında, yağ asidi sentezinin inhibisyonu apoptozu teşvik eder ve hücre ölümünü tetikleyebilen sitotoksisite üretir [ 3 ]. De novo yağ asidi sentezindeki anahtar enzim, yağ asidi sentazıdır (FASN). FASN, palmitat ve 16 karbonlu bir yağ asidi oluşturmak için asetil koenzim A (CoA) ve malonil-Co'yu katalize eder [ 4 ]. FASN, SKBR-3 gibi hormondan bağımsız çizgiler ve MCF-7 gibi hormona bağımlı çizgiler dahil olmak üzere çeşitli meme kanseri hücre dizilerinde yüksek oranda eksprese edilir [ 5]. FASN, bir SREBF1 izoformunun (sterol düzenleyici element bağlayıcı transkripsiyon faktörü 1), SREBP1c'nin (sterol düzenleyici element bağlayıcı protein 1c) genetik modülasyonu ve/veya nükleer olgunlaşması yoluyla düzenlenebilir. SREBP1c, FASN promotörünü bağlayan ve FASN'nin transkripsiyon hızını artıran bir transkripsiyon faktörüdür [ 6 ]. Ek olarak, FASN, AKT serin/treonin kinaz 1'in (AKT1) ekspresyonunu pozitif olarak düzenler ve düzenler. AKT1 aktivasyonu, yağ asidi sentezinin inhibisyonunu takiben hücreleri hücre ölümünden korur [ 7 ].

Mevcut klinik protokollere bir başka çekici ilave, doğal olarak oluşan antioksidanlarda yüksek bir diyet tavsiyesidir. Antioksidatif vitaminler, karotenoidler ve kemo-koruyucu aktiviteye sahip diğer küçük moleküller içeren meyve ve sebzelerin yüksek tüketimi, birincil kanser önlemenin önemli bir unsuru olabilir [ 8 ]. Bitki farmakolojik aktivitesi, doğal antioksidanlarla güçlü bir şekilde ilişkilidir [ 9 ]. Flavonoidler gibi bitki kaynaklı antioksidan bileşikler, reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin olumsuz sonuçlarını azaltır ve daha az istenmeyen yan etkiye sahip potansiyel bir antineoplastik ve sitotoksik ajan kaynağıdır [ 10 , 11]. Çeşitli epidemiyolojik çalışmalar, yüksek flavonoid alımının kanser riskinin azalmasıyla ilişkili olduğunu göstermektedir [ 12 ]. İn vitro çalışmalar, hücre proliferasyonunun inhibisyonu, adezyon, invazyon, eşzamanlı hücre döngüsü arresti inhibisyonu ile hücre farklılaşması ve apoptoz dahil olmak üzere flavonoid aracılı sitotoksisite ile bağlantılı birkaç mekanizmanın olduğunu göstermektedir [ 13 , 14 ]. Flavonoidler, meyve ve yapraklarda önemli miktarlarda doğal olarak üretilen mükemmel antioksidan özelliklere sahip 5000'den fazla polifenolik bileşiğin bir alt grubudur [ 15 ]. Orto- ve para-kinonlara oksidasyon, antioksidan özelliklere katkıda bulunan fenolik hidroksilin varlığı ile ilgili standart aromatik dönüşümdür.16 ].

Burada, Vitis vinifera L. cv'yi araştırdık. Vermentino, Sardunya bölgesinin üretken faaliyetlerini temsil ettiği ve kuzey İtalya'da yaygın olarak üretilen diğer asmalarla karşılaştırıldığında benzersiz bir fenolik profile sahip olduğu için. Bu çalışmanın amacı, Vermentino yapraklarının hidroalkolik ekstraktının potansiyel sitotoksisitesinin yanı sıra herhangi bir potansiyel farmakolojik etkide yer alan hücre sinyal yollarını araştırmaktı.

Git: 2. Yöntemler

2.1. Hücre Kültürü ve Tedavileri

İnsan meme kanseri hücre dizileri MCF-7 ve SKBR-3'ün yanı sıra MCF-12A normal meme epitel hücre dizisi, American Type Culture Collection'dan (ATCC, Rockville, MD, ABD) elde edildi ve tarafından sağlanan talimatlara göre büyütüldü. ATCC. Bu epitel hücre hatları rutin olarak 4.5 g/L D-glukoz içeren ve %10 fetal sığır serumu ve penisilin (100 U/mL)/streptomisin (100 U/mL) ile takviye edilmiş yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde kültürlendi. %5 CO2 altında ₃₇ °C. Bu çalışmada hücreler, 100, 200 ve 400 µg/mL konsantrasyonlarında 16 ve 24 saat boyunca Vermentino yaprağı hidroalkolik özüne maruz bırakıldı. Aşağıda açıklanan deneylerde hücreler, 60 μg/mL sikloheksimit (CHX) veya 0.5 μM MG132 (karbobenzoksi-Leu-Leu-leucinal) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) ile 4, 18 ve 24 saat Ortam, 15 dakikalık MG132 ön işleminden sonra değiştirildi. 2.2. İnsan Meme Doku Örnekleri

Sırasıyla cerrahi indirgeyici mamoplastiden üç normal meme dokusu ve beş meme kanseri dokusu ve primer meme kanserinin cerrahi rezeksiyonu kullanıldı ( Ek Tablo S1 ). Tüm dokular, sonraki protein ekstraksiyonu için hemen sıvı nitrojen içinde donduruldu. Her hastadan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Çalışma protokolü, Cedars-Sinai Tıp Merkezi'nin insan araştırmaları inceleme komitesi tarafından çalışmanın önceden onaylanmasıyla yansıtıldığı üzere, 1975 Helsinki Bildirgesi'nin etik yönergelerine uygundur. 2.3. Bitki Malzemesi ve Ekstraksiyon Prosedürü

Vitis vinifera L. cultivar Vermentino'nun olgun yaprakları, Ağustos ayında İtalya, Oristano'daki Gıda Üretimi Bilimleri Enstitüsü'nün (ISPA) toplama alanında yetiştirilen bitkilerin apikal kısmından toplanmıştır. Yapraklar hemen portatif bir buzdolabına konuldu ve ISPA laboratuvarlarına taşınmak üzere 4 °C'ye soğutuldu. Orada, yapraklar musluk suyuyla durulandı, ısıya dayanıksız bileşiklerin bozunmasını önlemek için sıvı nitrojen içinde ince bir toz halinde öğütüldü ve polifenol ekstraksiyonu için işlendi.

Bazı modifikasyonlarla, önceden oluşturulmuş bir metodoloji [ 17 ] izlenerek hızlandırılmış bir solvent ekstraksiyonu yapıldı . Yaprak tozundan polifenol ekstraksiyonu için bir hidroalkolik (etanol/su %40/60) çözücü kullanıldı. Üç kopya halinde gerçekleştirildi. Yaprak tozu, 16 saat boyunca hidroalkolik çözücü ile temas ettirildi, böylece bir süspansiyon elde edildi. Süspansiyon daha sonra 4629 g'de santrifüjlendi.4 °C'de 10 dakika (ALC-4227R, ALC srl, Milan, İtalya). Sadece süpernatan, polifenolik fraksiyonu içeren hidroalkolik ekstrakt, -80 °C'de donduruldu ve etanolün çıkarılması için gaz halinde nitrojen akışına tabi tutuldu. Daha sonra tüm su ve etanol kalıntılarını ortadan kaldırmak için liyofilize edildi. Sonuç, analizler ve tedaviler için kullanılan polifenolik etanol içermeyen bir özüt tozuydu. Bu ekstrakt, hücre tedavilerini gerçekleştirmek için kültür ortamında uygun şekilde seyreltildi.

Ekstraksiyon verimi, "dondurularak kurutulmuş geri kazanımın ağırlığı" ile "kullanılan yaprak tozunun başlangıç ağırlığı" arasındaki oran olarak hesaplandı ve yüzde olarak ifade edildi. 2.4. Asma Ekstresinin Fenolik Karakterizasyonu

2.4.1. HPLC-UV Analizi

Vermentino özütü, 0.2 um rejenere selüloz membran şırınga filtrelerinden (Phenomenex, Torrence, CA, ABD) süzüldü. Fenolik bileşikler, daha önce tarif edilen koşullara göre LC-MS (sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi) ile belirlendi [ 18 ]. Kantitatif analizler için 280, 320 ve 520 nm'de bir DAD (diyot dizisi HPLC dedektörü) kullanıldı. Fenolik bileşiklerin miktar tayini, ticari standartlara göre harici kalibrasyon eğrileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir; kuersetin 3-O-(6 asetil) glukozit içeriği, bir kuersetin 3-O glukozit standart eğrisi kullanılarak hesaplandı.

2.4.2. LC-HRMS Analizi

Yüksek çözünürlüklü (HR) MS analizleri, ikili pompa, termostatik otomatik numune alma cihazı ve bir kolon ile donatılmış 1200 serisi HPLC'ye (Agilent Technologies, Santa Clarita, CA, ABD) bağlı bir QExactive Orbitrap (Thermo Scientific, Bremen, Almanya) üzerinde gerçekleştirilmiştir. 39 °C'ye ayarlanmış fırın.

İkincil metabolit profilini araştırmak için QExactive, hem pozitif hem de negatif iyon modunda çalışan bir ısıtılmış elektrosprey iyonizasyon kaynağı (HESI) ile donatıldı. HESI parametreleri, püskürtme voltajı, 3.2 kV; kılıf gazı akış hızı, 35 (keyfi birimler); yardımcı gaz, 10 (keyfi birim); süpürme gazı, 2 (keyfi birimler); ve kılcal sıcaklık, 300 °C. Tam MS edinimi, ana iyonlar için yarı maksimumda (FWHM) 70.000 tam genişlikte ve 5 ppm kütle doğruluğu ile parça iyonları için 17.500 çözünürlük gücüyle gerçekleştirildi. MS parametreleri Otomatik Kazanç Kontrolü hedefi 1e6, maksimum enjeksiyon süresi (IT) 200 ms ve tarama aralığı 100–1200 m/z idi. Cihazları kontrol etmek ve verileri işlemek için Xcalibur 3.1.66 yazılımı (Thermo Scientific, Bremen, Almanya) kullanıldı. Bir İkizler C18 (Phenomenex, Torrance, CA, ABD; 100 × 2. Kromatografik ayırma için 1 mm, 3 um, 100Â) kullanıldı. Akış hızı, 5 μL enjeksiyon hacmi ile 55 dakikalık bir süre boyunca 0.2 mL/dk idi. Aşağıdaki programla solvent asetik asit %0.2 (A) ve asetonitril (B) doğrusal gradyanlı bir elüsyon uygulandı: 0 dak, %10 B; 0–20 dakika, %10–20 B; 20-40 dakika, %20-40 B; ve 40-50 dakika, %40-70 B. Her analizden önce kolon 8 dakika dengelendi. Bu koşullar önceki çalışmamızdan uyarlanmıştır [ Kolon, her analizden önce 8 dakika boyunca dengelendi. Bu koşullar önceki çalışmamızdan uyarlanmıştır [ Kolon, her analizden önce 8 dakika boyunca dengelendi. Bu koşullar önceki çalışmamızdan uyarlanmıştır [18 ].

Zirveler, dış standartlara (tR), UV-VIS spektrumlarına (200-650 nm), yüksek çözünürlüklü kütle spektrumlarına, fitokimyasal kitaplıklara ve referans literatürüne göre alıkonma süreleri temelinde tanımlandı. Tek fenolik bileşiğin miktar tayini, ilgili referans bileşiğin kalibrasyon eğrileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Referans bileşik mevcut olmadığında, kalibrasyon yapısal olarak ilişkili moleküllere dayanıyordu. 2.5. Western Blot ve Eş İmmünopresipitasyon (Co-IP)

MCF-7 ve SKBR-3 hücreleri, soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı ve ardından toplam proteinler, 100 uL radyoimmünopresipitasyon deneyi (RIPA) tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl) ile özümlendi. , ₁ mM Na2 EDTA, 1 mM EGTA, %1 NP-40, %1 sodyum deoksikolat) içeren 1X proteaz inhibitörleri içeren Sigma (kat.# P8340; (St. Louis, MO, ABD). Spesifik antikorlarla immünopresipitasyon, daha önce bildirildiği gibi gerçekleştirildi [ 19]. İmmün çökeltilmiş proteinler, standart protokoller (Amersham BioSciences, Piscataway, NJ, ABD) takip edilerek Western blot'a (WB) tabi tutuldu ve membranlar FASN, AKT1, p-AKT1, küçük ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO)1, SUMO2/ için problandı. 3, ubiquitin-konjuge enzim 9 (UBC9) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ABD), Ubiquitin (UBC) (Proteintech, Rosemont, IL, ABD), kaspaz-3 (CASP-3), kaspaz-9 (CASP) -9) ve β-aktin (Sigma-Aldrich). Bantlar, geliştirilmiş bir kemilüminesans saptama sistemi (Millipore Corporation, Billerica, MA, ABD) kullanılarak saptandı. Göreceli bant yoğunluğunun ölçümü Quantity One sürüm 4.6.6 kullanılarak yapıldı. bazik (Bio-Rad, Hercules, ABD) ve β-aktin normalleştirme faktörü olarak kullanıldı. 2.6. Gerçek Zamanlı PCR (RT-PCR) Analizi

Toplam RNA, üreticinin protokolüne göre bir Quick-RNA Kiti (Zymo Research, Irvine, CA, ABD) kullanılarak ekstre edildi. İlk cDNA dizisi, M-MLV ters transkriptaz (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) tarafından ters transkripsiyon yoluyla sentezlendi. Kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi, 2 uL PCR ürünü kullanılarak yapıldı. İnsan FASN'si (yağ asidi sentazı) için TaqMan probları ve Universal PCR Master Mix, ABI'den (Foster City, CA, ABD) satın alındı. Bir temizlik geni olarak hipoksantin fosforibosil-transferaz 1 (HPRT1) kullanıldı. Elde edilen delta Ct (ΔCt), aşağıdaki formüle göre genlerin bağıl ifadesini bulmak için kullanıldı: bağıl ifade = 2–ΔΔCt, burada ΔΔCt = ΔCt deney gruplarındaki ilgili genlerin – ΔCt kontrol grubundaki aynı genlerin. 2.7. Hücre Canlılığı

Üretici tarafından tarif edildiği gibi kültürdeki canlı hücre sayısını belirlemek için MTT tahlili (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür; Bimake, Houston, TX, ABD) yapıldı. . MCF-7 ve SKBR-3 hücreleri, 1 mL DMEM içinde 1 x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda 12 oyuklu plakalara kaplandı. Hücreler daha sonra 16 ve 24 saat boyunca Vermentino yapraklarının (100, 200 ve 400 µg/mL) hidroalkolik ekstraksiyonunun çeşitli konsantrasyonları ile işlendi. Hücre proliferasyon oranları, her bir oyuğa 10 uL MTT etiketleme reaktifi eklenerek ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edilerek belirlendi. Absorbans, 450 nm'de formazan turuncu boya oluşumunu okumak için bir plaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. 2.8. Akış Sitometri Testi

^{Vermentino ekstraktının hücre apoptozu üzerindeki etkilerini belirlemek için MCF-7 ve SKBR-3 hücreleri 2} x 105 yoğunlukta ekildi.6 kuyulu bir plaka içinde kuyu başına hücreler ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edildi. Hücreler, 100, 200 ve 400 ug/mL konsantrasyonlarda 16 veya 24 saat boyunca Vermentino özütü ile işleme tabi tutuldu ve akış sitometrisi kullanılarak apoptoz için analiz edildi. Muamele edilmemiş hücreler bir kontrol olarak kullanıldı (taşıyıcı, su mevcudiyetinde uyarılmış hücreler). Daha sonra hücreler tripsinize edildi, soğutulmuş PBS ile yıkandı ve ardından 5 uL anneksin V-floresein izotiyosiyanat (FITC) ve 10 uL propidyum iyodür (PI) (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü, Jiangsu, Çin) içeren 200 uL bağlama tamponunda yeniden süspanse edildi. üreticinin önerdiği şekilde oda sıcaklığında karanlık bir odada 15 dakika inkübe edildi. Analizi gerçekleştirmek için bir floresanla aktive olan hücre sıralayıcı (FACS) Calibur analizörü (BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) kullanıldı. 2.9. Klonojenisite Test Analizi

Vermentino'nun hidroalkolik ekstraktının meme kanseri hücre dizileri üzerindeki sitotoksik etkisini belirlemek için klonojenisite deneyleri yapıldı. Kısaca, MCF-7 ve SKBR-3 hücreleri bir stok kültüründen hasat edildi ve hücreler tedavi başlamadan 1 gün önce oyuk başına 250 hücre yoğunluğunda 12 oyuklu plakalara ekildi. Ertesi gün, hücreler ya 100, 200 ya da 400 ug/mL konsantrasyonlarında hidroalkolik özüt ile muamele edildi ve 16 ya da 24 saat süreyle inkübe edildi. Yaklaşık 7-10 günlük koloni oluşumundan sonra, koloniler sabitlendi (PBS'de %4 paraformaldehit) ve kristal mor solüsyonla (Cell Biolab SNC, San Diego, CA, ABD) boyandı. Daha sonra kolonilerin sayısı sayıldı. Hücre-hayatta kalma oranı, tedaviden sonra elde edilen kolonilerin sayısının kontroldeki kolonilerin sayısına bölünmesiyle hesaplandı. 2.10. Proteomik Numune Hazırlama

Elli mikrogram toplam protein, SKBR-3 ve MCF-7 hücre hatlarında kontrol ve 400 ug/mL Vermentino hidroalkolik ekstre ile muamele edilmiş numunelerden ekstre edildi. Proteinler, 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8 ve 8 mol/L üre solüsyonunda denatüre edildi. Numuneler daha sonra 10 s açık ve 10 s kapalı (QSonica, Newtown, CT, ABD) aralıklarla 10 dakika boyunca ultrasonikleştirildi ve 16.000 x g'de santrifüjlendi.Çözünmeyen peletleri uzaklaştırmak için 4 °C'de 10 dakika. Çözünür fraksiyon daha sonra oda sıcaklığında 1 saat ditiyotreitol (15 mM) ile indirgendi ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika iyodoasetamid (15 mmol/L) ile alkillendi. Daha sonra, 50 μg protein, 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8 ile 2 mol/L üre nihai konsantrasyonuna seyreltildi ve gece boyunca 3 μg tripsin/Lys-C karışımı içinde 37 °C'de bir çalkalayıcıda sindirildi ( Promega, Madison, WI, ABD). Numunelerin tuzu giderildi ve hidrofobik-lipofilik denge (HLB) plakaları (Oasis, HLB 3 0 um, 5 mg sorbent; Waters Corporation, Milford, MA, ABD) kullanılarak temizlendi. 2.11. LC–MS/MS Ayarları

LC–MS/MS, bir EasySpray iyon kaynağı ile donatılmış bir Orbitrap Elite'e (Thermo Fisher, Waltham, MA, ABD) bağlı bir Dionex Ultimate 3000 NanoLC üzerinde gerçekleştirildi. Mobil faz A, %0.1 sulu formik asitten ve mobil faz B, asetonitril içinde %0.1 formik asitten oluşuyordu. Peptitler analitik kolona (PepMap RSLC C18 2 µm, 100 Â, 50 µm id × 15 cm) 300 nL/dk'lık bir akış hızında, 185 dakika boyunca %2-25 A'dan oluşan bir lineer AB gradyanı kullanılarak yüklendi, 25 5 dakika boyunca -%90 B ve ardından 10 dakika boyunca %2 A'da yeniden dengeleme ile 5 dakika boyunca %90'da izokratik bir tutma. Sıcaklık, her iki sütun için 40 °C'ye ayarlandı. Nano kaynaklı kılcal sıcaklık 275 °C'ye ayarlandı ve püskürtme voltajı 2 kV'a ayarlandı. MS1 taramaları Orbitrap Elite'de 60 çözünürlükte elde edildi,Maksimum 500 ms üzerinde ^{6 iyon. 1} x 104 iyon hedef ayarı , 100 ms birikim süresi ve 2 Da izolasyon genişliği ile iyon tuzağındaki normal tarama modunda her MS1 taramasından ilk 15 iyon için MS2 spektrumları elde edildi . Normalleştirilmiş çarpışma enerjisi %35'e ayarlandı ve her spektrum için bir mikro tarama elde edildi. 2.12. Hazırlayıcı Veri Analizi ve Peptit Tanımlama Araması

Ham MS dosyaları, MSConvert kullanılarak mzXML'ye dönüştürüldü ve COMET, X! Tandem yerli ve X! Tandem k-skor arama algoritmaları [ 20 , 21 ]. Bu arama algoritmalarının tümü için öncül ve parça kütle toleransı 10 ppm'ye ayarlandı. Sistein karbamidometil, sabit bir modifikasyon olarak ayarlandı ve tüm arama algoritmaları için metioninin oksidasyonu, değişken bir modifikasyon olarak ayarlandı. Tüm triptik peptitler için en fazla iki eksik bölünmeye izin verildi ve PeptideProphet [ 22 ] ile peptit spektral eşleşmelerinin Hedef-yem modellemesi yapıldı. Tüm deneysel veri setinden >%95 olasılık puanına sahip peptitler Skyline yazılımına aktarıldı [ 23 ,24 ] öncül ekstraksiyonlu iyon yoğunluklarının (XIC'ler) miktar tayini için bir kütüphane kurmak. Her deney dosyasından öncül XIC'ler Skyline kitaplığına karşı çıkarıldı ve izotop nokta ürün skorları >0.8 olan ve protein başına minimum iki prototipik peptit içeren peptit XIC'ler, proteomik farklılıkların nihai istatistiksel analizi için filtrelendi [ 25 ]. Ham peptit yoğunluklarının normalleştirilmesi ve protein seviyesi bolluğu çıkarımı, açık kaynaklı MSSTATs (v3.2.2) yazılım paketinde yerleşik lineer karışık etkiler modeli kullanılarak hesaplandı [ 26 ]. Kütle spektrometrisi proteomik verileri, veri kümesi tanımlayıcısı PXD016748 ile PRIDE [ 27 ] ortak deposu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumuna yatırıldı. 2.13. Protein Stabilite Testi ve Yarı Ömür Tayini

Sikloheksimid (60 ug/mL), 4, 18 ve 24 saat boyunca kuyu başına 400 ug/mL Vermentino hidroalkolik özü ile birlikte tedavide SKBR-3 hücrelerine ilave edildi. Protein seviyeleri, belirtilen zaman noktalarında, yukarıda açıklandığı gibi, anti-FASN antikoru kullanılarak Western blotlama ile belirlendi. Göreceli FASN proteini miktarı dansitometri ile değerlendirildi ve β-aktine normalize edildi. Protein yarı ömrü, lineer regresyon analizi kullanılarak her deney için belirlendi. 2.14. Proteazomal Aktivite Deneyleri

MCF-7 ve SKBR-3 hücre hatlarındaki proteasomal aktivite, üreticinin protokolüne göre Proteasome-Glo tahlili (Promega) kullanılarak ışıldayan bölgeye özgü substratlarla belirlendi. ^{Kısaca, hücreler, oyuk başına 5 x 103} hücre olacak şekilde 96 oyuklu plakalara yerleştirildi ve 24 saat inkübe edildi. Hücreler, 16 ve 24 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlarda (100, 200 ve 400 µg/mL) Vermentino hidroalkolik özü ile işlendi. Hücreler, üreticinin protokolüne göre kimotripsin benzeri (Chym-L), tripsin benzeri (Tr-L) ve kaspaz benzeri (Casp-L) aktivite için Proteasome-Glo kiti kullanılarak test edildi. 2.15. RNA Girişimi

RNAi deneylerini gerçekleştirmek için, insan SUMO1'ini hedefleyen altı farklı önceden tasarlanmış küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNA'lar) (#1 duyu dizisi: 5'-GGAUAGCAGUGAGAUUCACtt-3', antisens: 3'-GUGAAUCUCUCUGCUAUCCtc-5'), (#2 duyu dizisi 5' -AAGGUGAAUAUUAAACUCA-3' ve antisens: 3'-UGAGUUUAAUAUUCACCUU-5'), insan SUMO2 (#1 duyu dizisi: 5'-CCACAUCCUGACUACUACCtt -3', antisens: 3'-GGUAGUAGUCAGGAUGGGtg-5'), (#2 duyu dizisi: 5'-GCUGUUACAUGUAGGGCAATT-3', antisens: 3'-UUGCCCUACAUGUAACAGCTA -5') ve insan SUMO3 (#1 duyu dizisi: 5'-GGCAGAUCAGAUUCAGGUUtt -3', antisens: 3'-AACCUGAAUCUGAUCUGCCtc -5') (Austin, Teksas, ABD). SUMO3 #2'nin susturulması için kullanılan siRNA dizisi, daha önce açıklandığı gibi, 161-179 kodlama bölgesine (başlangıç kodonuna göre) karşılık gelir [ 28 ].] (Dharmacon Research, Inc., Boulder, CO, ABD). MCF-7 ve SKBR-3 hücreleri 6 oyuklu plakada (0.5 x 106 ^hücre /çukur) kültürlendi ve SUMO1 siRNA (10 nM) ile RNAiMax (5 uL/kuyu) (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak transfekte edildi. mRNA veya protein ekspresyon analizleri için 48 saat boyunca SUMO2 siRNA (10 nM) veya SUMO3 siRNA (10 nM). 2.16. İstatistiksel analiz

Veriler, ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası veya ortalama ± standart sapmanın (SD) olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz, varyans analizi ve Fisher'in kesin testi ve t -testi kullanılarak yapıldı. Önem, p < 0.05 ile tanımlandı.

Git: 3. Sonuçlar

3.1. Polifenol Fitokimyasal Bileşimi

Vermentino'nun fenolik profilini belirlemek için ham yaprak ekstresini HPLC kromatografisine tabi tuttuk. Vermentino yapraklarının, öncelikle quercetin 3-O glukozit ve isorhamnetin glukozit içeren biyoaktif bileşiklerin bir karışımını içerdiğini bulduk.tablo 1). tablo 1

HPLC-UV analizi ile elde edilen Vermentino asma yapraklarının hidroalkolik ekstraktındaki fenollerin miktarı (g/kg ± SD).

Myricetin 3-O glukozit	0.11 ± 0.01
Eridictyol 7-glukozit	0.25 ± 0.03
Quercetin 3-O rutinosid	0,20 ± 0,02
Quercetin 3-O galaktozit	1,29 ± 0,06
Quercetin 3-O glukozit	5,92 ± 0,10
Kaempferol 3-O galaktozit	0,68 ± 0,03
Kaempferol 3-O rutinosit	0,08 ± 0,01
Kaempferol 3-O glukozit	1.64 ± 0.07
Quercetin 3-O-(6 asetil) glukozit	0.19 ± 0.03
isorhamnetin glukozit	8.00 ± 0.22
Toplam	18.36

Ayrı bir pencerede aç 3.2. Vermentino Özü Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Canlılığını Düşürüyor

Flavonoidler gibi fenolik bileşiklerin kanser hücre dizilerinde sitotoksisiteyi indüklediği gösterildiğinden, Vermentino hidroalkolik özü ile tedaviden sonra hücre canlılığını değerlendirdik. MCF-7 ve SKBR-3 göğüs kanseri hücre hatlarının yanı sıra MCF-12A insan göğüs epitel hücre hattını tedavi ettik ve ortaya çıkan sitotoksisiteyi karşılaştırdık. Üç hücre hattının tümü, 16 ve 24 saat boyunca artan 100, 200 ve 400 µg/mL konsantrasyonlarında Vermentino hidroalkolik özü ile muamele edildi. Vermentino bileşiği, kontrole kıyasla 400 µg/mL hidroalkolik özüt ile MCF-7 ve SKBR-3 hücre hatlarının işlenmesini takiben %50'lik bir canlılık azalması ile her konsantrasyonda önemli sitotoksik aktivite gösterdi (Şekil 1A). Önemli olarak, MCF-12A hücreleri, Vermentino hidroalkolik özü ile zaman içinde canlılıkta hiçbir azalma göstermedi. Bu nedenle, Vermentino hidroalkolik özü, MCF-7 ve SKBR-3 meme kanseri hücreleri üzerinde hafif apoptotik etkiler gösterdi, ancak MCF-12A epitelyal meme hücreleri üzerinde göstermedi.

Şekil 1
Vermentino özü, doza özel bir yanıtta meme kanseri hücrelerinin canlılığını ve klonojenisitesini düşürür. ( A ) Vermentino'nun hidroalkolik özü ile muamele edilmiş MCF-12A, SKBR-3 ve MCF-7 hücrelerini gösteren MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür) tahlili (100, 200 veya 400 µg/mL) 16 ve 24 saat. Formazan boyasının absorbansı 450 nm'de ölçülmüştür. Sonuçlar, üç kopya halinde gerçekleştirilen üç bağımsız deneyden hücre büyümesinin yüzdesi (%) ± SE olarak ifade edilir. * p < 0.05 ve kontrol. ^Ɨ p < 0,005, kontrole karşı. ( B ) MCF-7 ve ( C ) SKBR-3, 0.1 × 10 ⁶hücreler (6 oyuklu plakalar), 100, 200 ve 400 ug/mL'lik konsantrasyonlarda 16 ve 24 saat boyunca Vermentino hidroalkolik özü ekleyerek klonojenisite deneyi yapmak üzere plakalandı. Petri kaplarının temsili bir deneydeki fotoğrafları histogramların altında gösterilmektedir. Tüm veriler, üç kopya halinde gerçekleştirilen üç bağımsız deneyde tabak başına koloniler olarak ifade edilir. * p < 0.05, ** p < 0,001, ^Ɨ p < 0,0001 ve kontrol grubu. 3.3. Vermentino Özü, Meme Kanseri Hücre Hatlarında Klonojenisiteyi Engeller

Vermentino hidroalkolik yaprak özü ile tedavi edilen MCF-7 ve SKBR-3 insan meme kanseri hücrelerinin hayatta kalmasını ve çoğalmasını değerlendirmek için klonojenisite deneyleri yaptık. Koloni oluşumu kristal mor boyama ile değerlendirildi ve temsili kolonilerŞekil 1M.Ö. Vermentino bileşiği, 16 ve 24 saat boyunca 100, 200 ve 400 ug/mL'lik konsantrasyonlarda kullanıldı. 24 saatte 200 ve 400 µg/mL'lik saf hidroalkolik dilüsyonlar oldukça toksikti ve kontrol kolonilerine kıyasla MCF-7 hücrelerinde koloni oluşumunda sırasıyla %48 ve %80 azalma ile sonuçlandı (Şekil 1B). Ek olarak, 200 ve 400 µg/mL'lik etanolik dilüsyonlar, kontrol kolonilerine kıyasla 24 saatte SKBR-3 hücrelerinde koloni oluşumunda sırasıyla %39.1 ve %78.3 azalma gösterdi (Şekil 1C). Bu sonuçlar, Vermentino bileşiğinin test edilen meme kanseri hücrelerinde umut verici bir sitotoksisite destekleyicisi olduğunu göstermektedir. 3.4. Vermentino Özü Meme Kanseri Hücre Hatlarında Geç Apoptoz/Nekroz ile İndüklendi

Vermentino yaprağı hidroalkolik ekstresinin sitotoksik aktivitesinin apoptoz indüklenmesinden kaynaklanıp kaynaklanmadığını incelemek için hücreler, 16 ve 24 saat boyunca 100, 200 ve 400 µg/mL hidroalkolik ekstreye maruz bırakıldı ve annexin V-FITC ve propidium iyodür ile boyandı. PI) ve daha sonra sitoflorometri ile analiz edildi. 200 ve 400 μg/mL Vermentino yaprağı hidroalkolik ekstresi ile 16-24 saatlik tedavi, kontrole kıyasla MCF-7 ve SKBR-3 hücrelerinin %20'sinde erken apoptozda önemli bir artışı tetikledi (şekil 2A,B). Ek olarak, MCF-7 ve SKBR-3 hücrelerinde 16 ve 24 saat boyunca 100 μg/mL yaprak hidroalkolik ekstraktına maruz kaldıktan sonra hücre nekrozu yüzdesi kontrole kıyasla önemli ölçüde arttı (Figür 3A,B). Toplu olarak, 24 saat boyunca Vermentino yaprağı hidroalkolik özütü ile inkübasyon, her iki hücre hattında kontrole kıyasla geç apoptotik hücreleri %20 ve nekrozu %25 oranında önemli ölçüde artırdı, en büyük etki 400 μg/mL'lik bir dozajda gözlendi. Vermentino özü ile tedavi, her iki meme kanseri hücre hattında geç apoptoz ve nekroz yoluyla hücre ölümünü arttırır.

şekil 2
Hidroalkolik Vermentino özü, geç apoptoz ve nekroz yoluyla hücre ölümüne neden olur. 100, 200 ve 400 µg/mL konsantrasyonlarda 16 ve 24 saat sonra Vermentino yaprağı hidroalkolik özü ile muameleden sonra MCF-7 ( A ) ve SKBR-3 ( B ) hücrelerinin apoptotik hücre ölümü. Apoptotik hücreler, annexin V-FITC ve propidium iyodür boyama deneyi kullanılarak ölçüldü. Sol alt kadran canlı hücreleri (V), sol üst kadran nekrozu (N), sağ üst kadran geç apoptotik hücreleri (LA) ve sağ alt kısım erken apoptotik hücreleri (EA) gösterir. Histogramda değerler, üç kopya halinde gerçekleştirilen üç bağımsız deneyin ortalama ± SE olarak rapor edilir. * p < 0.05, ** p < 0.001, ^Ɨ p< 0,004 ve kontrol grubu.


Figür 3
Vermentino özü, kaspaz-3 (CASP-3) ve kaspaz-9 (CASP-9) aktivasyonunu indükledi ve yağ asidi sentaz (FASN) protein seviyesini düşürdü. MCF-7 ve SKBR-3 hücreleri, 6 oyuklu plakalarda 0.4 x 106 hücre yoğunluğunda kaplandı ^ve 24 saat boyunca Vermentino yapraklarının (100, 200 ve 400 ug/mL) çeşitli konsantrasyonlarda hidroalkolik ekstraktı ile işlendi. ( A ) Hidroalkolik ekstrakt ile muamele edilmiş MCF-7 ve SKBR-3 hücrelerinde procaspaz-9, yarılmış kaspaz-9, procaspaz-3 ve klevajlı kaspaz-3 ekspresyonunun Western blot analizi. Aktine normalize edilmiş dansitometrik oranlar, her Western blotun altında gösterilmektedir. Sonuçlar, beş bağımsız deneyden elde edilen kontrol katı (ortalama ± SE) olarak ifade edilir. * p < 0.05, ** p < 0.005, ^Ɨ p< 0,001 kontrole karşı. ( B ) Temsili bir FASN peptidi VTAIHIDPATHR'nin (MCF-7 hücreleri) ekstre edilmiş öncü izotopik zarfının (M, M + 1, M + 2) yoğunluğu. Hepsi teorik izotop dağılımıyla eşleşti. ( C ) FASN'nin mRNA seviyesi, RT-PCR kullanılarak gerçekleştirilirken, protein seviyesi, FASN, AKT ve p-AKT (MCF-7 hücreleri) için Western blot analizi ile analiz edildi. β-aktine normalize edilmiş dansitometrik oranlar Western blot'un altında gösterilmiştir. Sonuçlar, sırasıyla mRNA ve protein analizi için üç kopya halinde gerçekleştirilen dört ve üç bağımsız deneyden bir kontrol katı (ortalama ± SE) olarak ifade edilir. * p < 0.05, ** p < 0,002, ^Ɨ p < 0,001 kontrole karşı.

Vermentino özütü ile muameleden sonra meydana gelen değişiklikleri değerlendirmek için, hangi hücre sinyal yollarının sitotoksisiteye neden olduğunu araştırmak için LC-MS/MS analizi ile tarafsız bir proteomik tarama gerçekleştirdik. Proteomik sonuçlara göre, apoptoz yollarının çoğu, Vermentino bileşiği ile tedaviden sonra meme kanseri hücre hatlarında düzensizleştirildi ( Ek Şekil S1 ; Ek Tablolar S2 ve S3 ). 3.5. Meme Kanseri Hücre Hatlarında Vermentino Özü İndüklenmiş CASP-9 ve CASP-3

Vermentino özütünün MCF-7 ve SKBR-3 meme kanseri hücre dizileri üzerindeki apoptotik potansiyelini daha fazla araştırmak için, yakından ilişkili olan kaspaz-9 (CASP-9) ve kaspaz-3'ün (CASP-3) ekspresyonunu ve bölünmesini değerlendirdik. apoptoz yoluyla hücre ölümü ile ilişkilidir. Da gösterildiği gibiFigür 3A, pro-kaspaz-9 protein seviyeleri, kontrole kıyasla MCF-7 hücrelerinde 24 saat sonra 200 ve 400 µg/mL Vermentino hidroalkolik özüt konsantrasyonlarında sırasıyla %32 ve %45'e düşürüldü. Sonuç olarak, bölünmüş kaspaz-9 ekspresyonu, kontrole kıyasla 400 µg/mL hidroalkolik özüt konsantrasyonunda 1.2 arttı. Kaspaz-9'un bölünmesi, apoptozun Vermentino özütü tarafından indüklendiğini ima etti. Ayrıca, pro-kaspaz-3 aktivasyonu, Vermentino'nun fitokimyasal hidroalkolik ekstraktına maruz bırakılarak indüklendi ve sırasıyla 200 ve 400 µg/mL konsantrasyonlarda kontrole kıyasla pro-kaspaz-3'te %25 ve %45 azalma ile sonuçlandı, 24 saat sonra Kaspaz kaskadının aktivasyonu ile uyumlu olarak, bölünmüş kaspaz-3, 2.23- ve 2 ile belirgin şekilde arttı.

MCF-7 hücre hattındaki gözlemlerimizle uyumlu olarak, Vermentino özütü, SKBR-3 hücrelerinde kaspaz kaskadı üzerinde güçlü bir aktivasyon etkisine sahipti. Bu sonuçlar, Vermentino hidroalkolik özütünün 200 µg/mL'lik bir konsantrasyonda %35'lik bir düşüş ve 400 µg/mL'lik bir konsantrasyonda %56'lık bir düşüş gösteren güçlü bir şekilde aktive edilmiş pro-kaspaz-9'u göstermektedir. kontrol. Bölünmüş kaspaz-9, kontrole kıyasla 400 µg/mL Vermentino hidroalkolik özütü konsantrasyonunda 2.4 kat artış gösterdi. Pro-kaspaz-3 aktivasyonu, 24 saat sonra 200 ve 400 µg/mL konsantrasyonlarda sırasıyla %20 ve %60 pro-kaspaz-3 azalmalarıyla kanıtlandığı üzere, Vermentino'nun hidroalkolik özüne maruz bırakılarak indüklenmiştir. kontrol. Bölünmüş kaspaz-3 ekspresyonu arttı, 3.6. Vermentino Özü, FASN Protein Seviyesini Düşürüyor ve Meme Kanseri Hücre Hatlarında AKT1 Sinyalini Destekliyor

Proteomik analizimiz, FASN'nin, Vermentino özütü ( Ek Tablolar S2 ve S3 ) tarafından aşağı regüle edilmesine neden olan apoptoz ile ilgili anahtar proteinlerden biri olduğunu ortaya koydu.Figür 3B ve Ek Şekiller S2 ve S3 , 24 saat sonra MCF-7 ve SKBR-3'te kontrolde temsili bir FASN peptidinin ve Vermentino hidroalkolik özütünün çıkarılan öncül izotopik zarfının (M, M + 1, M + 2) yoğunluğunu gösterir. 400 µg/mL tedavi. Vermentino hidroalkolik özü ile muamele edilen MCF-7 ve SKBR-3 hücreleri, FASN peptit yoğunluğunda sırasıyla %70 ve %20 azalma gösterdi.

Vermentino yaprağı ekstraktının hücre apoptozu üzerindeki etkisini daha da doğrulamak için, MCF-7 ve SKBR-3 hücre hatlarına 24 saat boyunca 100, 200 ve 400 µg/mL hidroalkolik ekstrakt uyguladık ve FASN, AKT1 ve protein ekspresyonunu inceledik. p-AKT1. MCF-7 hücrelerinde gösterildiği gibiFigür 3C, FASN protein seviyeleri, protein seviyesinde 400 µg/mL'lik bir konsantrasyonda %37'ye kadar azalırken, AKT1 seviyeleri kontrole kıyasla nispeten sabit kalmıştır. Buna karşılık, p-AKT1, kontrole kıyasla sırasıyla 200 ve 400 µg/mL'de 2,6 ve 4,17 kat artış gösterdi. Bununla birlikte, FASN mRNA seviyeleri, kontrole kıyasla sırasıyla 200 ve 400 µg/mL'de 1.2 ve 1.6 kat hafif bir artış gösterdi (Figür 3C, sol panel). SKBR-3 hücrelerinde de benzer etkiler gözlendi ( Ek Şekil S2B ). FASN protein seviyeleri 200 ve 400 µg/mL konsantrasyonlarda sırasıyla %9 ve %35 azalırken, p-AKT1 kontrole kıyasla aynı ilgili konsantrasyonlarda 3,6 ve 4,8 kat arttı. Yukarıda açıklanan verilerle uyumlu olarak, SKBR-3 hücreleri, kontrole kıyasla AKT1'in protein seviyelerinde çok az değişiklik gösterdi. Bununla birlikte, FASN mRNA seviyeleri her iki hücre hattında da önemli ölçüde yükseldi ( Ek Şekil S2B , sol panel). Birlikte, bu sonuçlar Vermentino hidroalkolik özütünün FASN'yi transkripsiyondan ziyade çeviri düzeyinde etkilediğini göstermektedir.

Ek olarak, proteomik analiz, Vermentino özütü ( Ek Tablolar S2 ve S3 ) ile muameleden sonra önemli ölçüde aşağı regüle edilen TRAP1'i (tümör nekroz faktörü (TNF) reseptörü ile ilişkili protein 1) ortaya çıkardı. TRAP1, solunum kompleksleri ile doğrudan etkileşime giren, apoptotik uyaranlara yanıt olarak mitokondriyal geçirgenlik geçişini düzenleyen ve mitokondriyal ölüme aracılık eden ısı şoku protein 90 (HSP90) ailesinin mitokondriyal üyesidir [ 29 ]. 3.7. Vermentino Özü Proteasomal Bozunmayı Aktive Ederek FASN Protein İfadesini Düşürdü

FASN'nin transkripsiyon sonrası seviyede düzenlendiği ve Vermentino özü ile muamele edilerek azaldığı gözlemine dayanarak, daha sonra FASN proteininin protein sentezini ve bozulmasını inceledik. İlk olarak, artan süreler için MCF-7 ve SKBR-3 hücrelerini 400 µg/mL Vermentino hidroalkolik özü ile tedavi ettik. FASN seviyelerinin zamanla kademeli olarak azaldığını bulduk. MCF-7 hücrelerinde gösterildiği gibiŞekil 4A, FASN protein seviyeleri, kontrole kıyasla 18 ve 24 saatlik maruziyetten sonra sırasıyla %16 ve %26 düştü. Benzer şekilde, 18 ve 24 saatlik bileşik maruziyetinden sonra SKBR-3 hücrelerinde FASN protein seviyeleri kontrole kıyasla sırasıyla %29 ve %60 azaldı (Şekil 4A, sağ panel). Sikloheksimid (CHX) ile muamele edilmiş numunelerde 42.8 ± 7 saatten CHX ve Vermentino hidroalkolik ekstresi ile muamele edilmiş numunelerde 23.7 ± 3 saate düşen MCF-7 hücrelerinde FASN protein yarı ömrünü hesaplamaya devam ettik. Sentez Vermentino özünden etkilenmedi (Şekil 4B, sol panel). İlginç bir şekilde, FASN proteininin kaybı, proteazom inhibitörü MG132 ile ön tedavi ile önemli ölçüde azaldı (Şekil 4B, sağ panel), protein bozulmasının etkilenmiş olabileceğini gösterir.

Şekil 4
Vermentino hidroalkolik özü, FASN'nin protein stabilitesini düşürür. ( A ) MCF-7 ve SKBR-3 hücreleri, zaman içinde 400 ug/mL Vermentino hidroalkolik özü ile işlendi. Western blot sonuçları, üç bağımsız deneyden kontrole göre kat olarak ifade edilir ve p-aktin ile normalleştirilir. * p < 0.05. ( B ) FASN protein stabilitesi, MCF-7 hücrelerinde sikloheksimid (CHX) ve belirtildiğinde MG132 tedavileri ile Metotlar bölümünde tarif edildiği gibi belirlendi. Yarı ömrü hesaplamak için doğrusal regresyon denklemi kullanıldı. Sonuçlar, ilgili 0 saat seviyesinin yüzdesi olarak ifade edilen üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SEM'i temsil eder. * p < 0.05, ** p < 0.008, NC 0.71 ≤ p≤ 0.91. ( C ) FASN'nin ubiquitination'ı immünopresipitasyon ile analiz edildi. Western blot'un yanında β-aktine normalize edilmiş dansitometrik oranlar gösterilmektedir. Sonuçlar, üç kopya halinde gerçekleştirilen üç bağımsız deneyden bir kat kontrol (ortalama ± SE) olarak ifade edilir. * p < 0,005 ve kontrol (WB). ** p < 0,01 vs. kontrol (IP).

Daha sonra FASN protein bozulmasının ubiquitination durumuna bağlı olup olmadığını araştırdık.Şekil 4C, 24 saat boyunca 400 µg/mL Vermentino hidroalkolik özüt ile tedavinin, kontrole kıyasla FASN yaygınlaşmasını üç kat arttırdığını göstermektedir. Ek olarak, MG132 ile tedavi, MCF-7 ve SKBR-3 hücre dizilerinde FASN protein seviyelerinin Vermentino aracılı bozulmasını önledi ve her yerde bulunan FASN'nin hücre içi birikimi ile sonuçlandı. 3.8. Vermentino Ekstraktının Proteazomal Aktivite Üzerine Etkileri

MG132, Vermentino kaynaklı FASN bozulmasına karşı koruduğu için, daha sonra, tripsin benzeri (Tr-L), kaspaz benzeri (Casp-L) ve kimotripsin benzeri (Chym) ölçerek Vermentino bileşikleri ile muamele edilerek proteazomal aktivitenin değişip değişmediğini araştırdık. -L) proteazomal aktivite. 16 ve 24 saat boyunca hidroalkolik özüt ile muamele, MCF-7 ( Ek Şekil S4A ) ve SKBR-3 ( Ek Şekil S5A ) hücre hatlarında Tr-L aktivitesini doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde azalttı. 16 ve 24 saatlik tedaviden sonra, Tr-L aktivitesi her iki hücre hattında her bir bileşikten 400 ug/mL ile tedavi edildiğinde en belirgin şekilde azaldı. Vermentino ekstraktlarının hiçbiri MCF-7'deki ( Ek Şekil S4B ) veya SKBR-3'teki Casp-L aktivitesi üzerinde bir etkiye sahip değildi (Ek Şekil S5B ) hücre hatları. Kontrollere kıyasla MCF-7 ve SKBR-3 hücre hatlarında Chym-L aktivitesi %50 azalmış olsa da, dozlar veya süreler arasında anlamlı bir fark yoktu ( sırasıyla Ek Şekiller S4C ve S5C ). 3.9. Vermentino Hidroalkolik Özü, İnsan Meme Kanseri Hücre Hatlarında UBC9 Protein Seviyesini Düşürdü

Her iki Vermentino yaprağı ekstresi ile de Casp-L proteasomal aktivitesinde herhangi bir değişiklik gözlemlenmediği için, ubiquitination ile çapraz konuşmada proteazomal bozunmaya neden olan bir post-translasyonel modifikasyon olan SUMOylation'ı araştırmaya başladık [ 30 ]. Proteomik verilerimiz, SUMOylation'ı çalıştıran tek E2 enziminin, ubikuitin-konjuge enzim E2 I'nin (UBC9), her iki hücre hattında da Vermentino tedavisi ile aşağı regüle edildiğini gösterdi ( Ek Tablolar S2 ve S3 ). İlginç bir şekilde, UBC9, hedef proteinlerinin stabilitesine aracılık eder ve premalign koşullarda yukarı regüle edilir [ 30 , 31]. Bu nedenle, UBC9'un protein seviyesini değerlendirdik ve MCF-7 ve SKBR-3 hücre hatlarında 400 µg/mL Vermentino hidroalkolik ekstraktına 24 saat maruz kalmaya yanıt olarak UBC9'un sırasıyla %80 ve %50 azaldığını bulduk (Şekil 5). Temsili bir UBC9 peptidinin ekstre edilmiş öncü izotopik zarfının (M, M + 1, M + 2) yoğunluğu MCF-7 hücrelerinde gösterilir (Şekil 5, sol üst panel) ve SKBR-3 hücreleri (Şekil 5, sol alt panel) 24 saat boyunca 400 µg/mL Vermentino hidroalkolik özü ile muameleden sonra. MCF-7 ve SKBR-3 Vermentino ile tedavi edilen hücre hatlarının her ikisi de UBC9 M + 2 peptit yoğunluğunda %40'lık bir azalma gösterdi.

Şekil 5
Vermentino hidroalkolik özü, MCF-7 ve SKBR-3 hücrelerinde ubikuitin-konjuge enzim 9 (UBC9) protein seviyesini azaltır. Hücreler, 24 saat boyunca 400 ug/mL özüt ile işlendi. Toplam proteinler ekstrakte edildi ve kütle spektrometrisi ve Western blot UBC9 protein seviyesi ile analiz edildi. (Üst ve alt sol paneller) Vermentino hidroalkolik özü ile muamele edilmiş MCF-7 ve SKBR-3 hücrelerinde temsili bir UBC9 peptidi MLFKDDYPSSPPK'nın ekstre edilmiş öncü izotopik zarfının (M, M + 1, M + 2) yoğunluğu. Hepsi teorik izotop dağılımıyla eşleşti. (Üst ve sağ alt paneller) UBC9'un Western lekelenmesi. Aktine normalize edilmiş dansitometrik oranlar, her Western blotun altında gösterilmektedir. Sonuçlar, beş bağımsız deneyden elde edilen kontrol katı (ortalama ± SE) olarak ifade edilir. * p < 0.03 (MCF-7 hücreleri), ** p< 0.05 (SKBR-3 hücreleri) vs. kontrol. 3.10. SUMOilasyon Aracılı FASN Protein Stabilitesi

Protein SUMOylation veya deSUMOylation modifikasyonunun modülasyonu, meme kanserinde karsinogenezin düzenlenmesi ile ilişkilendirilmiştir [ 32 ]. Üç farklı tahmin yazılımı kullanarak, FASN'nin SUMOylation için oldukça olası bir hedef olduğunu bulduk (Tablo 2), bu nedenle bu, FASN'nin in vivo ve in vitro SUMOilasyonunu incelememize neden oldu. İnsan meme kanseri dokularının normal meme dokusuna kıyasla yüksek FASN SUMOilasyonu sergilediğini bulduk (Şekil 6A). MCF-7 hücrelerinde SUMO1, SUMO2 ve SUMO3'ün bireysel susturulması, FASN mRNA seviyelerini etkilemedi, bu da SUMOylation'ın translasyon sonrası seviyede FASN protein stabilitesini etkilediğini düşündürdü (Şekil 6B). Western blot analizi ayrıca SUMO2'yi FASN protein seviyesinin aşağı regülasyonu ile ilişkilendirdi. Spesifik olarak, SUMO2'nin susturulması, MCF-7 hücrelerinde kontrole kıyasla FASN protein seviyesinde %70'lik bir düşüşle sonuçlandı (Şekil 6C).Şekil 6D, MCF-7 hücrelerinin 400 µg/mL'de 24 saat boyunca Vermentino hidroalkolik özü ile muamele edilmesinin, SUMO2 protein ekspresyonunu etkilemeden UBC9 protein seviyesini düşürerek SUMOylation kompleksinin oluşumunu inhibe ettiğini gösterir. FASN'nin stabilizasyon ve proteazom tarafından bozulmaya karşı koruma için SUMO2 gerektirdiğine dair kanıt sağlamak için MCF-7 hücreleri, SUMO2 susturma ile kombinasyon halinde 18 ve 24 saat boyunca CHX ile işlendi (Şekil 6E, sol panel). Birlikte tedavi edilen hücreler, kontrol ile karşılaştırıldığında, FASN protein seviyelerinde sırasıyla %70 ve %80'lik azalmalar sergiledi. Buna karşılık, SUMO2 susturma ile kombinasyon halinde 18 ve 24 saat boyunca MG132 ile tedavi edilen MCF-7 hücreleri, FASN protein seviyelerinde önemli bir düşüş sergilemedi (Şekil 6E, sağ panel). Birlikte, bu sonuçlar SUMO2'nin FASN stabilizasyonu için gerçekten gerekli olduğunu göstermektedir.

Şekil 6
FASN, in vitro ve in vivo olarak SUMOillendi ve Vermentino hidroalkolik özü, MCF-7 hücrelerinde SUMOylation makinesini inhibe etti. ( A ) İnsan meme normalinden ( n = 3) ve kanser dokularından ( n = 5) 700 ug proteinde FASN immünopresipitasyon UBC9'a karşı lekelendi. ( B , C ) Hücreler, 48 saat boyunca siSUMO-1, siSUMO-2 ve siSUMO-3 ile transfekte edildi. SUMO ve FASN ekspresyon seviyeleri, RT-PCR ve Western blot ile analiz edildi. ( D ) MCF-7 hücreleri, 24 saat boyunca 400 ug/mL ekstrakt ile muamele edildi ve UBC9 ile kompleks oluşumunu analiz etmek için FASN immüno-çökeltildi. ( E) SUMO-2'nin susturulması (48 saat), son 18 ve 24 saat boyunca CHX ve MG132 ile birlikte tedavi edildi. FASN ve SUMO-2 protein seviyeleri Western blot ile analiz edildi. Dansitometrik oranlar aktine normalleştirildi ve sonuçlar, üç ( B , E ) ve dört ( C ) bağımsız deneyden kontrol katı (ortalama ± SE) olarak ifade edildi . * p < 0.01, ** p < 0.04, *** p < 0.0003, † p < 0.002 - Sc. Tablo 2

Öngörülen FASN küçük ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO)ilasyon siteleri.

K706	QELKKVIREPKPRSARWLSTS	X		X
K786	KPSCTIIPLMKKDHRDNLEFF	X	X	X
K835	RGTPLISPLIKWDHSLAWDVP	X	X	X
K1523	AFRHFLLEEDKPEEPTAHAFV	X	X	X
K1752	DLVLNSLAEEKLQASVRCLAT	X		X
K2206	EASELACTPKEDGLAQQQTQ	X	X	X
K2471	DYNLSQVCDGKVSVHVIEGDH	X		X

Ayrı bir pencerede aç
Git: 4. Tartışma

Birçok çalışma, kanser hücrelerinde sitotoksisite ile kuersetin, asit gallik ve isorhamnetin gibi bitki kaynaklı bileşiklerin antioksidan aktiviteleri arasında pozitif ilişkiler olduğunu göstermiştir [ 33 , 34 ]. Bu çalışmada, Vermentino yapraklarının hidroalkolik ekstraktının potansiyel sitotoksik etkilerini değerlendirdik.

HPLC-UV analizi ile elde edilen fenolik profil, Vermentino yaprak ekstraktının sitotoksik kapasiteye sahip olabileceğini düşündürmektedir. Gerçekten de, ekstre ile yapılan tedavinin, MCF-7 ve SKBR-3 meme kanseri hücre dizilerinde hücre canlılığını ve hayatta kalmasını baskıladığını ve MCF-12A normal meme epitel hücreleri üzerinde önemli bir etki göstermediğini bulduk. Ayrıca, sitoflorometrik analizler, meme kanseri hücrelerinin doza ve zamana bağlı bir şekilde geç apoptoza ve nekroza doğru yönlendirildiğini ileri sürdü. Apoptotik yolun katılımı, en çok etkilenen kanonik biyolojik yolun apoptoz olduğunu gösteren IPA yazılımı [ 35 ] tarafından daha da doğrulandı.

Sitotoksik aktivitenin altında yatan potansiyel yolları araştırmak için, tedavi edilen hücreler üzerinde proteomik analizler yaptık ve Vermentino yaprağı ekstresinin protein seviyesinde yağ asidi sentaz (FASN) ekspresyonunu aşağı regüle ettiğini belirledik. FASN, yağ asidi biyosentezinde anahtar bir enzimdir ve β-oksidasyon yoluyla enerji homeostazında önemli bir rol oynar [ 36 ]. Lipitler hücre zarının ana bileşenidir ve hücre bölünmesi için gereklidir. Tümör hücreleri, daha yüksek proliferasyon oranlarını ve daha hızlı büyümeyi sürdürmelerini sağlayan de novo yağ asidi sentezi yoluyla ekstra yağ asitlerini endojen olarak sentezler [ 37 ]. FASN'nin inhibisyonu apoptozu indükler ve malonil-CoA birikimi nedeniyle hücre ölümünü tetiklemesi muhtemel olan sitotoksisite yaratır [ 38 ,39 ]. Vermentino yaprağı ekstresine maruz bırakılan MCF-7 ve SKBR-3 hücrelerinde apoptoz indüksiyonunun altında yatan mekanizmayı değerlendirmek için kaspaz-3 ve kaspaz-9 aktivitesini değerlendirdik. Vermentino yaprağı ekstresinin, kaspaz bağımlı yolun modülasyonu yoluyla meme kanseri hücrelerinde programlanmış hücre ölümünü indüklediğini bulduk. Sonuçlarımızla uyumlu olarak, parçalanmış kaspazların yükselmesi, kemoprevensiyonda çok önemli bir moleküler hedeftir [ 40 , 41 ]. FASN ile indüklenen apoptozda kaspaz aktivasyonunun katılımı Western blot ile değerlendirildi. Vermentino yaprağı ekstresi ile 16 ve 24 saatlik tedavilerden sonra bölünmüş kaspazların doza bağlı bir şekilde arttığını bulduk.

FASN ekspresyonu, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), reseptör tirozin-kinaz (ERBB2) ve steroid hormon reseptörleri (östrojen reseptörü, progesteron reseptörü ve androjen reseptörü) dahil olmak üzere çeşitli büyüme faktörleri tarafından düzenlenir [ 42 ]. Büyüme faktörlerinin ve reseptörlerin bağlanması, fosfoinositid 3-kinaz (PI3K)-AKT transdüksiyon yolunun aktivasyonu ile sonuçlanır. FASN aktivitesi ve AKT1 aktivasyonu, ortak düzenleyici bir yolda modüle edilir - FASN, AKT1'i düzenler ve aktive edilmiş AKT1, FASN'yi düzenler. AKT1 aktivasyonu, FASN transkripsiyonunu artırarak hücreleri FASN inhibisyonunun neden olduğu hücre ölümüne karşı korur [ 43 , 44 ]]. Verilerimiz, Vermentino yaprağı ekstraktının, fosforilasyon yoluyla AKT1'in aktivasyonunu tetiklediğini ve ayrıca MCF-7 ve SKBR-3 hücrelerinde FASN mRNA seviyelerini arttırdığını göstermektedir. Aktive edilmiş AKT1, promotör bölgesine bağlanarak FASN'yi aktive eden bir transkripsiyon faktörü olan sterol düzenleyici element bağlayıcı protein 1c'nin (SREBP1C) gen modülasyonu yoluyla FASN ekspresyonunu uyarır [ 45 ]. Burada, artan AKT1 aktivasyonunun ve FASN mRNA'sındaki ilgili artışın, Vermentino kaynaklı FASN aşağı regülasyonunu telafi ettiğine dair kanıtlar sunuyoruz.

FASN indirgeme mekanizmasını daha iyi anlamak için iki yolu araştırdık: protein sentezi ve proteasomal bozunma. Bilinen bir protein sentezi inhibitörü olan sikloheksimid (CHX) ile tedavi, protein döngüsünü kilitleyerek FASN protein ekspresyonunu azalttı. Bununla birlikte, CHX ve Vermentino yaprak özütü ile birlikte işleme, tek başına CHX'e kıyasla FASN'nin azalmasını arttırdı, bu da FASN'nin bileşik tarafından aşağı regülasyonunun protein sentezinden bağımsız olduğunu ortaya koydu. Buna karşılık, proteasomal bozunma inhibitörü MG132 ile ön-muamele, Vermentino yaprak ekstresi ile birlikte muamele sırasında FASN'yi bozunmadan korumuştur, bu, ekstrenin proteasomal bozunmanın aktivasyonu yoluyla FASN birikimini aşağı regüle ettiğini düşündürmektedir. Gerçekten de, önceki çalışma, kemoterapötik ajanlarla tedavinin 20'li yaşların alt biriminin proteazomal aktivitesini azalttığını göstermiştir [46 ].

Verilerimizle uyumlu olarak, kontrollere kıyasla Tr-L ve Chym-L aktivitesinde bir aşağı regülasyonu ve her iki hücre hattında da Casp-L aktivitesinde değişiklik olmadığını bulduk. Bu sonuçlar, Casp-L aktivitesi Vermentino kaynaklı aşağı regülasyondan etkilenmediğinden, FASN aşağı regülasyonunun Casp-L aktivitesinin aracılık ettiğini göstermektedir. FASN inhibitörleri, belirsiz bir mekanizma yoluyla her yerde bulunan proteinlerin birikmesine neden olur [ 47 ]. Benzer şekilde, Vermentino yaprak özütü, FASN'nin yaygınlaşmasını arttırdı. Proteazomal aktivitede genel bir azalma gözlemlememize rağmen, proteazomal 20s alt ünitesine afinite artmış ve FASN bozunması, proteasomal Casp-L aktivitesi ile desteklenmiştir.

Birlikte, bu veriler, yağ asidi sentezi ve proteazomal yollar arasında, FASN azalmasına artan yaygınlaşmanın aracılık ettiği bir çapraz karışma düzeyi önerir. Bu nedenle, Vermentino yaprak özütü, iki farklı mekanizma yoluyla FASN ekspresyonunu ve bozulmasını modüle etme görevi görür. İlk mekanizma, FASN mRNA'nın transkripsiyonunu indükleyen AKT1 aktivasyonunu içerir. İkinci mekanizma, ubikuitin-proteazom yolu yoluyla FASN bozulmasını destekler. Bulgularımız, meme kanseri hücrelerindeki homeostatik dengenin ikinci yolu desteklediğini ve Vermentino'nun neden olduğu FASN bozulmasının, FASN mRNA transkripsiyonunun indüklenmesinden daha ağır basmasına izin verdiğini göstermektedir.

Kanser hücreleri, glikolize ek olarak de novo yağ asidi sentezine güvenerek yüksek çoğalma seviyelerini sürdürür. Burada, meme kanseri hücrelerinin Vermentino yaprağı ekstresi ile tedavisinin FASN seviyelerini değiştirdiğini ve enerjik metabolizmayı bozarak apoptoza yol açtığını gösterdik. Ek olarak, meme kanseri dahil olmak üzere birçok kanserde [ 29 ] enerjik metabolizmanın düzenlenmesinde rol oynayan moleküler bir şaperon olan TRAP1 (TNF reseptörü ile ilişkili protein 1), proteomik sonuçlara göre [ 28 , 48 ], Vermentino özü ile tedaviden sonra önemli ölçüde aşağı regüle edildi. ]. Warburg fenotipindeki bu bozulma [ 49] kanser hücrelerinin artan oksijen tüketim oranlarına yol açar, bu da sürdürülemez ve sonuçta hücre ölümüne yol açar. Vermentino kaynaklı FASN ve TRAP1 aşağı regülasyonunun sinerjistik etkileri, meme kanseri hücrelerini apoptotik hücre ölümüne yönlendirebilir ve normal hücreler üzerinde hiçbir etki göstermedi.

Proteomik analizimiz ayrıca SUMOylation'ı yönlendiren tek E2 enzimi olan UBC9'da güçlü bir azalma olduğunu ortaya koydu. SUMOylation, ubiquitination'a benzer küçük bir ubikuitin (UB) ile ilgili değiştirici (SUMO) konjugasyonudur [ 30 , 31 ]. Bununla birlikte, normalde bozulma için proteinleri hedefleyen ubiquitination'dan farklı olarak, SUMOylation protein stabilitesini düzenler. UBC9, aktive edilmiş SUMO'yu hedef proteine transfer eden SUMOylation döngüsünde iyi karakterize edilmiş tek E2 enzimidir [ 30 ]. UBC9 ve SUMO, düşük dereceli, uzun süreli oksidatif strese yanıt olarak insan premalign koşullarında yüksek oranda eksprese edilir, bu da SUMOilasyonun yukarı regülasyonunun oksidatif strese adaptif bir yanıt olabileceğini düşündürür [ 31 , 50]. Bu nedenle, antioksidan tedavilerin SUMOylation seviyelerini düşürmesi beklenebilir. Proteomik sonuçlarımıza dayanarak, FASN'nin SUMOylation için bir hedef olabileceğini ve protein stabilitesine katkıda bulunabileceğini varsaydık; ayrıca, yüksek oranda SUMOylated olduğu tahmin edilmiştir. Vermentino özü ile ve olmadan tedavi edilen meme kanseri hücrelerinde FASN'nin immüno-çökeltilmesi, UBC9 aşağı regülasyonunun azaltılmış SUMOylation kompleksi oluşumu ile sonuçlandığı hipotezimizi doğruladı. Hangi SUMO proteininin FASN ile etkileşime girdiğini anlamak için SUMO1, SUMO2 ve SUMO3'ü susturduk ve yalnızca SUMO2 susturmasının bireysel SUMO ekspresyonunu etkilemeden FASN protein seviyesini azalttığını bulduk. Bu, UBC9'un FASN'nin SUMOylation'ını SUMO2 aracılığıyla yönlendirdiğini ve SUMO2'nin FASN'nin bozulma için hedeflenmesini önlemek için koruyucu bir mekanizmada hareket ettiğini gösterir. Susturma SUMO'nun, FASN mRNA'nın transkripsiyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadı ve bu, FASN aşağı regülasyonunun translasyon sonrası seviyede meydana geldiğini gösterdi. SUMO2'nin FASN'yi proteasomal bozulmaya karşı koruduğunu göstermek için, meme kanseri hücre çizgilerini SUMO2 susturma ile kombinasyon halinde bir protein sentezi inhibitörü (CHX) ve bir proteasomal bozunma inhibitörü (MG132) ile tedavi ettik. CHX tedavisi ile kombinasyon halinde SUMO2 susturma işleminin FASN protein seviyelerini tek başına SUMO2 susturma işleminden daha fazla azalttığını bulduk. Proteazomal bozunmayı inhibe etmenin, FASN protein ekspresyonu üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. meme kanseri hücre dizilerini SUMO2 susturma ile birlikte bir protein sentezi inhibitörü (CHX) ve bir proteazomal bozunma inhibitörü (MG132) ile tedavi ettik. CHX tedavisi ile kombinasyon halinde SUMO2 susturma işleminin FASN protein seviyelerini tek başına SUMO2 susturma işleminden daha fazla azalttığını bulduk. Proteazomal bozunmayı inhibe etmenin, FASN protein ekspresyonu üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. meme kanseri hücre dizilerini SUMO2 susturma ile birlikte bir protein sentezi inhibitörü (CHX) ve bir proteazomal bozunma inhibitörü (MG132) ile tedavi ettik. CHX tedavisi ile kombinasyon halinde SUMO2 susturma işleminin FASN protein seviyelerini tek başına SUMO2 susturma işleminden daha fazla azalttığını bulduk. Proteazomal bozunmayı inhibe etmenin, FASN protein ekspresyonu üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır.

Git: 5. Sonuçlar

Özetle, ilk kez sadece FASN'nin SUMOillenmiş olduğunu değil, aynı zamanda Vermentino yaprak ekstraktının UBC9 protein seviyesini düşürerek meme kanseri hücrelerinin FASN'yi SUMOylate etme yeteneğini azalttığını gösterdik. Bu sonuçlar, meme kanserinde Vermentino yaprağı ekstresinin yeni terapötik yetenekleri için kanıt sağlar.

Git: Kısaltmalar

FASN	yağ asidi sentazı
Asetil-CoA	asetil koenzim A
malonil-CoA	malonik asit
SREBF1	sterol düzenleyici eleman bağlayıcı transkripsiyon faktörü 1
SREBP1c	sterol düzenleyici eleman bağlayıcı protein 1c
AKT	protein kinaz B
CHX	sikloheksimit
HPLC-UV	yüksek performanslı sıvı kromatografi ultraviyole
LC–MS	sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi
LC-HRMS	sıvı kromatografisi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi
HANIM	kütle spektrometrisi
FWHM	Tam genişlik yarı maksimum
BT	enjeksiyon zamanı
PBS	fosfat tamponlu salin
RIPA	radyoimmünopresipitasyon tahlil tamponu
SUMO	küçük ubikuitin benzeri değiştirici
UBC9	Ubiquitin-konjuge enzim 9
CASP-3	kaspaz-3
CASP-9	kaspaz-9
PCR	polimeraz zincirleme reaksiyonu
HPRT1	hipoksantin fosforibosil-transferaz
MTT	3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür
V-FITC	annexin V floresein izotiyosiyanat
PI	propidyum iyodür
FASTA	protein dizilerini temsil etmek için metin tabanlı format
Kim-L	kimotripsin benzeri
Tr-L	tripsin benzeri
Casp-L	kaspaz benzeri
siRNA	küçük enterferans yapan RNA
M	öncü izotop
PI3K	fosfoinositid 3-kinaz
HSP90	ısı şoku proteini 90
TRAP-1	tümör nekroz faktörü reseptörü ilişkili protein 1

Git: Ek Malzemeler

Aşağıdakiler çevrimiçi olarak https://www.mdpi.com/2218-273X/10/4/529/s1 adresinde mevcuttur.: Şekil S1: Vermentino hidroalkolik özü, MCF-7 ve SKBR-3 hücre hatlarındaki proteomik profili değiştirir. Şekil S2: Vermentino hidroalkolik özü, SKBR-3 hücrelerinde FASN protein seviyesini düşürür. Şekil S3: Vermentino hidroalkolik özler, MCF-7 ve SKBR-3 hücre dizilerinde FASN protein seviyesini düşürür. Şekil S4: Vermentino hidroalkolik özler, MCF-7 hücrelerinde tripsin benzeri ve kimotripsin benzeri proteazomal bozunmayı inhibe eder. Şekil S5: Vermentino hidroalkolik özler, SKBR-3 hücrelerinde tripsin benzeri ve kimotripsin benzeri proteazomal bozunmayı inhibe eder. Tablo S1: ErbB2-pozitif hastalardan alınan meme kanseri dokularının özellikleri. Tablo S2: Vermentino etanol özü ile muamele edilmiş MCF-7 hücrelerinin proteinlerinin listesi. Tablo S3: Vermentino etanol özü ile muamele edilmiş SKBR-3 hücrelerinin proteinlerinin listesi.
Ek veri dosyası için buraya tıklayın. ^{(1,5M, fermuarlı)}
Git: Veri ve Materyallerin Kullanılabilirliği

Proteomik verileri, veri kümesi tanımlayıcısı PXD016748 ile PRIDE (1) ortak deposu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumuna yatırıldı.

Git: Yazar Katkıları

AF deneylerin çoğunu gerçekleştirdi, verileri analiz etti ve makaleyi yazdı. MLT, çalışma için finansman sağladı ve tüm şekillerde sunulan verilerin oluşturulmasına ve analiz edilmesine katkıda bulundu. MM ve XY, Şekil 8-10'da sunulan verileri üretti. JZ, verileri şu şekilde oluşturdu:Şekil 4veŞekil 5. SO, insan göğsü örnekleri sağladı ve tüm şekillerde istatistiksel analiz yaptı. AB, YS, GD ve EA, asma ekstraktlarını ve fenolik karakterizasyonunu hazırladı. AI-A. tüm şekillerde sunulan verilerin üretilmesine ve analiz edilmesine katkıda bulunmuştur. Tüm yazarlar, makalenin yayınlanan versiyonunu okudu ve kabul etti.

Git: Finansman

Bu araştırma, Cedars-Sinai Tıp Merkezi, ACB&P Bölümü'nden bir hibe ile desteklenmiştir.

Git: Çıkar çatışmaları

Yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Git: Referanslar

1. Pilleron S., Sarfati D., Janssen-Heijnen M., Vignat J., Ferlay J., Bray F., Soerjomataram I. Yaşlı erişkinlerde küresel kanser insidansı, 2012 ve 2035: Nüfusa dayalı bir çalışma. Int. J. Kanser. 2019; 144 :49-58. doi: 10.1002/ijc.31664. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
2. Guarneri V., Conte P. Metastatik meme kanseri: Moleküler alt tiplere ve önceki adjuvan tedaviye göre terapötik seçenekler. Onkolog. 2009; 14 :645–656. doi: 10.1634/theoncologist.2009-0078. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
3. Giró-Perafita A., Sarrats A., Pérez-Bueno F., Oliveras G., Buxó M., Brunet J., Viñas G., Miquel TP Yağ asidi sentaz ekspresyonu ve üçlü olarak kliniko-histopatolojik özelliklerle ilişkisi -negatif meme kanseri. Oncotarget. 2017; 8 :74391–74405. doi: 10.18632/oncotarget.20152. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
4. Zhou W., Tu Y., Simpson PJ, Kuhajda FP Malonil-CoA dekarboksilaz inhibisyonu, insan meme kanseri hücrelerine seçici olarak sitotoksiktir. Onkogen. 2009; 28 :2979–2987. doi: 10.1038/onc.2009.160. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
5. Chen Y., Huang W., Zheng M., Xue Y., Yang J., Liu W., Han S. mTOR inhibitörü rapamisin, ER/HER2 pozitif memede sitotoksisiteyi indüklemek için bir yağ asidi sentaz inhibitörü ile sinerji oluşturur kanser hücreleri. PLoS BİR. 2014; 9 :e97697. doi: 10.1371/journal.pone.0097697. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
6. Zhao X., Feng D., Wang Q. SREBP1'in sikline bağımlı kinaz 8 aracılı kontrolü ile lipogenezin düzenlenmesi. J. Clin. Araştırın. 2012; 122 :2417–2427. doi: 10.1172/JCI61462. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
7. Wang H., Luo QF, Peng AF, Long XH, Wang TF, Liu ZL, Zhang GM, Zhou RP, Gao S., Zhou Y., et al. Osteosarkomda Akt fosforilasyonu ve yağ asidi sentaz ekspresyonu arasındaki pozitif geri besleme düzenlemesi. Int. J. Mol. Med. 2014; 33 :633-639. doi: 10.3892/ijmm.2013.1602. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
8. Filaire E., Dupuis C., Galvaing G., Aubreton S., Laurent H., Richard R., Filaire M. Akciğer kanseri: Oksidatif stres, fiziksel aktivite ve beslenme ile bağlantılar nelerdir. Akciğer kanseri. 2013; 82 :383-389. doi: 10.1016/j.lungcan.2013.09.009. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
9. Tan BL, Norhaizan ME, Chan LC ROS Aracılı Mitokondriyal Yol Manilkara zapota (L.) için Gereklidir P. Royen Yaprağı Metanol Özü Kaspaz Aktivasyonunun Modülasyonunda Apoptozu İndükler ve HeLa İnsan Rahim Ağzı Kanserinin EGFR/NF-KB Aktiviteleri Hücreler. Kötü. Temelli Tamamlayıcı. Alternatif. Med. 2018; 2018 :6578648. doi: 10.1155/2018/6578648. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
10. Sathishkumar P., Gu FL, Zhan Q., Palvannan T., Mohd Yusoff AR Flavonoidler, “Yeşil nanomalzemeler: Hastalıkla ilgili çeşitli eğilimleri ve gelecek perspektifini tedavi etmek için yeni bir nanotıp sistemi. Önemli olmak. Lett. 2018; 210 :26–30. doi: 10.1016/j.matlet.2017.08.078. [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
11. Govindaraju K., Ingels A., Hasan MN, Sun D., Mathieu V., Masi M., Evidente A., Kornienko A. Apoptoza dirençli kanser hücrelerine karşı aktiviteye sahip montanin tipi alkaloidlerin sentetik analogları. Bioorg. Med. Kimya Lett. 2018; 28 :589–593. doi: 10.1016/j.bmcl.2018.01.041. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
12. Sun LR, Zhou W., Zhang HM, Guo QS, Yang W., Li BJ, Sun ZH, Gao SH, Cui RJ Kanserde Bitki Türevli Doğal Ürünlerin Çoklu Sinyal Yollarının Modülasyonu. Ön. Onkol. 2019; 9 :153. doi: 10.3389/fonc.2019.01153. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
13. Yang L., Xiao B., Hou L., Zhou G., Mo B., Yao D. Biyoaktif molekül Icariin, sıçan hava yolu düz kas hücrelerinin in vitro apoptozu ve otofajisini arttırırken proliferasyonu inhibe etti. sitoteknoloji. 2019; 71 :1109-1120. doi: 10.1007/s10616-019-00348-9. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
14. Abd El Maksoud AI, Taher RF, Gaara AH, Abdelrazik E., Keshk OS, Elawdan KA, Morsy SE, Salah A., Khalil H. Selective Regulation of B-Raf Dependent K-Ras/Mitogen-Activated Protein by Natural Kanser Hücrelerinde Meydana Gelen Çoklu kinaz İnhibitörleri. Ön. Onkol. 2019; 9 :1220. doi: 10.3389/fonc.2019.01220. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
15. Panche AN, Diwan AD, Chandra SR Flavonoidler: Genel bir bakış. J. Nutr. bilim 2016; 5 :e47. doi: 10.1017/jns.2016.41. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
16. Wang J., Xu J., Gong X., Yang M., Zhang C., Li M. Çin Salvia Türlerinden Polifenollerin Biyosentezi, Kimyası ve Farmakolojisi: Bir İnceleme. Moleküller. 2019; 24 :155. doi: 10.3390/moleküller24010155. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
17. Ferhi S., Santaniello S., Zerizer S., Cruciani S., Fadda A., Sanna D., Dore A., Maioli M., D'hallewin G. Üzüm Yapraklarından Toplam Fenoller Hücre Proliferasyonunu Önler ve Apoptozu Modüle eder -MCF-7 ve HepG2 İnsan Kanser Hücre Hatlarında İlgili Gen Ekspresyonu. Moleküller. 2019; 24 :612. doi: 10.3390/moleküller24030612. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
18. Barberis A., Spissu Y., Fadda A., Azara E., Serra PA Portakal, yaban mersini ve kivi suyundaki askorbik asit ve antioksidan kapasitenin fulleren veya nanotüplerle modifiye edilmiş askorbat çıkarıcı ile birleştirilmiş bir telemetrik sistemle eşzamanlı amperometrik tespiti biyosensör. Biyosens. Biyoelektron. 2015; 6715 :214–223. doi: 10.1016/j.bios.2014.08.019. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
19. Pascale RM, Simile MM, De Miglio MR, Muroni MR, Calvisi DF, Asara G., Casabona D., Frau M., Seddaiu MA, Feo F. Genetik yatkınlığı olan ve olmayan sıçanların karaciğer lezyonlarında hücre döngüsü düzensizliği hepatokarsinogenez. Hepatoloji. 2002; 35 :1341-1350. doi: 10.1053/jhep.2002.33682. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
20. Robertson C., Ronald CB TANDEM: Proteinleri kütle spektrumlarıyla eşleştirme. Biyoinformatik. 2004; 20 :1466–1467. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
21. Keller A., Nesvizhskii AI, Kolker E., Aebersold R. MS/MS ve veritabanı araştırması ile yapılan peptit tanımlamalarının doğruluğunu tahmin etmek için ampirik istatistiksel model. Anal. Kimya 2002; 74 :5383-5392. doi: 10.1021/ac025747h. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
22. Ma K., Vitek O., Nesvizhskii AI MS/MS spektrumlarının PeptideProphet ile tanımlanmasına yönelik istatistiksel bir model oluşturma perspektifi. BMC Biyoinformatik. 2012; 13 :S1. doi: 10.1186/1471-2105-13-S16-S1. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
23. Liebler DC, MacCoss MJ Skyline: Hedeflenen proteomik deneyleri oluşturmak ve analiz etmek için açık kaynaklı bir belge düzenleyici. Biyoinformatik. 2010; 26 :966-968. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
24. Schilling B., Rardin MJ, MacLean BX, Zawadzka AM, Frewen BE, Cusack MP, Sorensen DJ, Bereman MS, Jing E., Wu CC, et al. Skyline'da MS1 ile ekstrakte edilmiş iyon kromatogramları kullanılarak proteomik verilerin platformdan bağımsız ve etiketsiz nicelendirilmesi: Protein asetilasyonu ve fosforilasyonuna uygulama. Mol. Hücre. Proteom. 2012; 11 :202–214. doi: 10.1074/mcp.M112.017707. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
25. Choi M., Chang CY, Clough T., Broudy D., Killeen T., MacLean B., Vitek O. MSstats: Kantitatif kütle spektrometrisine dayalı proteomik deneylerin istatistiksel analizi için bir R paketi. Biyoinformatik. 2014; 30 :2524–2526. doi: 10.1093/biyoinformatik/btu305. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
26. Lou Y., Yao J., Zereshki A., Dou Z., Ahmed K., Wang H., Hu J., Wang Y., Yao X. NEK2A, MAD1 ile etkileşime girer ve muhtemelen yeni bir entegratör olarak işlev görür. mil kontrol noktası sinyali. J. Biol. Kimya 2004; 279 :20049–20057. doi: 10.1074/jbc.M314205200. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
27. Vizcaino JA, Deutsch EW, Wang R., Csordas A., Reisinger F., Ríos D., Dianes JA, Sun Z., Farrah T., Bandeira N., et al. ProteomeXchange, küresel olarak koordine edilmiş proteomik veri gönderimi ve yayılımı sağlar. Nat. Biyoteknoloji. 2014; 32 :223–226. doi: 10.1038/nbt.2839. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
28. Kang BH, Plescia J., Dohi T., Rosa J., Doxsey SJ, Altieri DC Organele özgü bir Hsp90 şaperon ağı ile tümör hücresi mitokondriyal homeostazının düzenlenmesi. Hücre. 2007; 131 :257–270. doi: 10.1016/j.cell.2007.08.028. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
29. Matassa DS, Agliarulo I., Avolio R., Landriscina M., Esposito F. TRAP1 Kanser Metabolizmasının Düzenlemesi: Onkogen veya Tümör Bastırıcı Olarak İkili Rol. Genler (Basel) 2018; 9 :E195. doi: 10.3390/genes9040195. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
30. Johnson ES, Blogel G. Ubc9, ubikuitin benzeri protein Smt3p için konjuge enzimdir. J. Biol. Kimya 1997; 272 :26799–26802. doi: 10.1074/jbc.272.43.26799. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
31. Manza LL, Codreanu SG, Stamer SL, Smith DL, Wells KS, Roberts RL, Liebler DC Elektrofil ve oksidatif strese yanıt olarak protein toplamada global kaymalar. Kimya Araş. Toksikol. 2004; 17 :1706-1715. doi: 10.1021/tx049767l. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
32. Rabellino A., Khanna KK Meme kanseri patogenezinde ve tedavisinde SUMOylation yolunun etkisi. Krit. Rev. Biyokimya. Mol. Biol. 2020; 18 :1–17. doi: 10.1080/10409238.2020.1738332. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
33. Hu J., Zhang Y., Jiang X., Zhang H., Gao Z., Li Y., Fu R., Li L., Li J., Cui H., et al. CaMKII'nin ROS aracılı aktivasyonu ve mitokondriyal translokasyonu, isorhamnetin ve klorokin ile üçlü negatif meme kanseri hücrelerinde Drp1'e bağlı mitokondriyal fisyon ve apoptoza katkıda bulunur. J. Uzm. Klinik. Kanser Araş. 2019; 38 :225. doi: 10.1186/s13046-019-1201-4. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
34. Tor YS, Yazan LS, Foo JB, Wibowo A., İsmail N., Cheah YK, Abdullah R., İsmail M., İsmail IS, Yeap SK MCF-7'de oksidatif stres oluşturma yoluyla apoptoz indüksiyonu, mitokondriye bağımlı ve Dillenia sufruticosa'nın etil asetat özü ve kimyasal profili ile kaspazdan bağımsız yol. PLoS BİR. 2015; 10 :e0127441. doi: 10.1371/journal.pone.0127441. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
35. Gomig THB, Cavalli IJ, Souza RLR, Lucena ACR, Batista M., Machado KC, Marchini FK, Marchi FA, Lima RS, Urban CA, et al. Meme kanseri proteomik verilerinin yüksek verimli kütle spektrometrisi ve biyoinformatik analizi. Veri Özeti. 2019; 25 :104125. doi: 10.1016/j.dib.2019.104125. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
36. Yu J., Deng R., Zhu HH, Zhang SS, Zhu C., Montminy M., Davis R., Feng GS P38 MAP kinaz, E3 ligaz COP1 ve SH2Tyrosine'nin uyumlu eylemiyle Yağ Asidi Sentazı bozulmasının Modülasyonu Fosfataz Shp2. J. Biol. Kimya 2013; 288 :3823–3830. doi: 10.1074/jbc.M112.397885. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
37. Bueno MJ, Jimenez-Renard V., Samino S., Capellades J., Junza A., López-Rodriguez ML, Garcia-Carceles J., Lopez-Fabuel I., Bolaños JP, Chandel NS, et al. 2B'de yağ asidi sentazının, transforme hücrelerde ankrajdan bağımsız büyüme geçişine olan önemi. Nat. Komün. 2019; 10 :5011. doi: 10.1038/s41467-019-13028-1. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
38. Schley PD, Jijon HB, Robinson LE, Field CJ MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinde omega-3 yağ asidi kaynaklı büyüme inhibisyonunun mekanizmaları. Meme Kanseri Araş. Davranmak. 2005; 92 :187–195. doi: 10.1007/s10549-005-2415-z. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
39. Lee JS, Sul JY, Park JB Amentoflavon tarafından yağ asidi sentaz inhibisyonu, SKBR3 insan meme kanseri hücrelerinde HER2/neu (erbB2) onkogenini bastırır. Fitoster. Araş. 2013; 27 :713–720. doi: 10.1002/ptr.4778. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
40. Adedara IA, Olabiyi BF, Idris UF, Onibiyo EM, Farombi EO Taurin, erkek sıçanlarda beyin-hipofiz-gonad ekseni boyunca inflamasyonda, kaspaz-3 aktivitesinde ve oksidatif hasarda ters sodyum florür aracılı artış. Olabilmek. J. Physiol. Eczacılık 2017; 95 :1019–1029. doi: 10.1139/cjpp-2016-0641. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
41. Chen W., Zhang H., Liu Y. Fucoxanthin'in Farelerde Benzo(A)Pyrene Neden Olduğu Akciğer Kanseri Üzerinde Anti-İnflamatuvar ve Apoptotik Sinyalleme Etkisi. J. Çevre. Patol. Toksikol. Onkol. 2019; 38 :239–251. doi: 10.1615/JEnvironPatholToxicolOncol.2019030301. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
42. Baumann J., Wong J., Sun Y., Conklin DS Palmitat kaynaklı ER stresi, HER2/neuppozitif meme kanseri hücrelerinde trastuzumab duyarlılığını arttırır. BMC Kanser. 2016; 16 :551. doi: 10.1186/s12885-016-2611-8. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
43. Menendez JA, Lupu R. Yağ asidi sentazı, meme kanseri hücrelerinde östrojen reseptörü-a sinyalini düzenler. Onkogenez. 2017; 6 :e299. doi: 10.1038/oncsis.2017.4. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
44. Chang L., Fang S., Chen Y., Yang Z., Yuan Y., Zhang J., Ye L., Gu W. FASN'nin inhibisyonu, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücrelerinin malign biyolojik davranışını baskılar. Glikoz metabolizmasını ve AKT/ERK yolunu düzensizleştirir. Lipidler Sağlık Dis. 2019; 18 :118. doi: 10.1186/s12944-019-1058-8. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
45. Zhang C., Hu J., Sheng L., Yuan M., Wu Y., Chen L., Wang G., Qiu Z. Ellagik asit, farelerde AKT güdümlü hepatik steatoz yoluyla de novo lipogenezi baskılayarak iyileştirir. AKT/SREBP-1/FASN yolu. Gıda Fonksiyonu. 2019; 10 :34103420. doi: 10.1039/C9FO00284G. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
46. Gardner RC, Assinder SJ, Christie G. Memeli 20 S ve 26 S proteazomlarının peptidil boronik asit inhibitörlerinin karakterizasyonu ve bunların kültürlenmiş hücrelerde proteazomların inhibisyonu. Biyokimya. 2000 ; 346 :447-454. doi: 10.1042/bj3460447. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
47. Little JL, Wheeler FB, Koumenis C., Kridel SJ Yağ Asidi Sentezi ve Proteazom Yolları Arasındaki Karışmanın Bozulması Katlanmamış Protein Tepki Sinyalini ve Hücre Ölümünü Geliştirir. Mol. Kanser Var. 2008; 7 :3816–3824. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-08-0558. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
48. Yoshida S., Tsutsumi S., Muhlebach G., Sourbier C., Lee MJ, Lee S., Vartholomaiou E., Tatokoro M., Beebe K., Miyajima N. Moleküler şaperon TRAP1, mitokondriyal solunum arasındaki metabolik geçişi düzenler ve aerobik glikoliz. Proc. Natl. Acad. bilim AMERİKA BİRLEŞİK DEVLETLERİ. 2013; 110 :1604-1612. doi: 10.1073/pnas.1220659110. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
49. Lu J., Tan M., Cai Q. Tümör ilerlemesinde Warburg etkisi: Bir anti-metastaz mekanizması olarak mitokondriyal oksidatif metabolizma. Kanser Let. 2015; 356 :156-164. doi: 10.1016/j.canlet.2014.04.001. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
50. Romanenko AM, Kinoshita A., Wanibuchi H., Wei M., Zaparin WK, Vinnichenko WI, Vozianov AF, Fukushima S. İnsanlarda kalıcı uzun süreli düşük doz iyonlaştırıcı radyasyonun neden olduğu mesane lezyonlarında ubiquitination ve sumylallasyonun katılımı. J. Urol. 2006; 175 :739–743. doi: 10.1016/S0022-5347(05)00172-2. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]

[maturidi]

ÜZÜM

Üzüm Çekirdeği Faydaları

Üzüm Çekirdeğinin Faydaları. Üzüm çekirdeği özü bitkiler tarafından üretilen kimyasallar olan çeşitli fitokimyasallar yönünden oldukça zengindir. Üzüm suyu özünün antioksidan bileşenleri, özellikle serbest radikallerin verdiği hasarın yok edilmesinde rol oynarlar. Serbest radikalleri etkisiz hale getirme gücü bakımından pysnojenol’lerin, E vitamininden 50, C vitamininden ise 20 kat daha kuvvetli olduğu saptanmıştır.
Çam kabuğu ekstresi ve üzüm çekirdeği ekstresi OPC’nin birincil kaynaklarıdır. Üzüm çekirdeği ekstresi daha ucuz olmasının yanı sıra çam kabuğunda bulunmayan bir antioksidan içerir.
Hücre mutasyonunu yavaşlatmaya yardımcı olması ve kolajenin sağlıklı ve esnek kalmasını sağlaması nedeniyle Avrupalı bilim adamları tarafından ‘gençlik besini‘ olarak niteleniyor.
Üzüm çekirdeğinin sağlık yönünden taşıdığı değer 1947 yılında Fransız tıp profesörü ve kimyacı Jack Masquelier tarafından keşfedilmiştir. 1950′de üzüm çekirdeği Resivit adıyla Fransa’da satılan ilk damar koruyucu ilaç olarak 50 yılı aşkın bir süredir Fransız doktorlar tarafından reçete edilmektedir.
Dr. Masquelier üzüm çekirdeğini göz kamaşması, gece körlüğü, maküler dejenerasyon, varis, diş eti kanaması, saman nezlesi gibi rahatsızlıkların tedavisinde kullanmıştır.
Üzüm çekirdeği son derece geniş farmakolojik aktivite gösteren ve serbest radikalleri etkisiz hale getiren oligomeric proanthocyanidin (%92-95) içerir.
Antioksidan Nedir?

Serbest Radikaller ve Antioksidanlar : Antioksidanlar serbest radikalleri etkisizleştirir. İnsan vücudunda serbest radikal (oksidan) denilen maddelerle onların zarar verici etkisini gideren antioksidanlar bulunur. Otuzlu yaşlara doğru denge antioksidan aleyhine bozulmaya başlar ve bunun sonucunda kanser gibi önemli hastalıklara zemin hazırlanır.
Antioksidanlar vücuttaki oksidasyonu engellerler. Yaşlanma ve kanser gibi olayların temelinde oksidasyon vardır. Üzüm çekirdeği DNA yı oksidatif zararlardan korur, yaşlanmaya ve kanser oluşumuna karşı mücadele eder.
Serbest radikaller vücudumuzda kimyasal reaksiyonlar sonucu oluştuğu gibi sigara, kirli hava gibi faktörlerle dışardan da gelebilir.

Üzüm Çekirdeği Faydaları Nelerdir ?
• Üzüm çekirdeğindeki maddeler (Oligomerik Proantosiyanidinler (OPC)) damar sertliğine karşı önemli etkilere sahiptir. Arterlerin bütünlüğünü korumaya yardımcı olur ve dolaşımı rahatlatır. Kan ve lenf dolaşımını düzenler. Periferal dolaşımı önemli bir şekilde iyileştirir.
• Araştırmalar, OPC’nin damarları sağlamlaştırarak ve esnekliklerini yeniden kazandırarak, tekrar derinin içine çekilmelerini sağladığını göstermektedir.
• Damar duvarındaki kollajen ve elastin adlı iki protein, damar duvarının elastikliğini ve geçirgenliğini büyük oranda belirler. OPC, bu iki yapı-taşı proteine bağlanarak, onların yıkıcı enzimler tarafından bozulmalarını önler, onların birleşmelerine ve olgunlaşmalarına yardım eder.
• 1981 yılında 50 varis hastası üzerinde yapılan çift-kör kontrollü bir deneyde, bir ay boyunca alınan günlük 150 miligram OPC’nin, ağrı, yanma, karıncalanma ve atardamarların şişme derecesini azaltmada kullanılan Diosmine adlı ilaçtan daha hızlı ve uzun süreli etkili olduğunu göstermiştir. Fransa’da varis hastası olan 92 kişi üzerinde yapılan bir çalışmada ise; 4 hafta boyunca günde 300 miligram OPC alımının, ağrıyı, karıncalanmayı, geceleyin ortaya çıkan bacak kramplarını ve şişkinliği %50′ den daha fazla oranda azalttığını göstermiştir.
• Üzüm çekirdeğindeki proantosiyanidinlerin beyin ve karaciğer hasarı üzerinde beta karoten, C vitamini ve E vitamini gibi antioksidanlardan daha güçlü koruyucu etki gösterdiği saptanmıştır.
• Klinik araştırmalar, üzüm çekirdeğinin toplardamar yetersizliğinin, retina hasarlarının ve bazı cilt hastalıklarının tedavisinde olumlu etkiler sağladığını göstermektedir.
• Üzüm çekirdeği özü, özellikle Fransa ve İtalya’daki doktorlar tarafından beyne ve kalbe giden kan akımını düzenlemek için, varis, diş etlerinde kanama, glokom, hemoroid, fazla adet kanaması ve damar sertliğine yönelik öneriliyor.
• California-Davis Üniversitesi tarafından 2006 yılında yapılan çalışmada üzüm çekirdeği ekstresinin kan basıncını azaltmada etkili olduğu tespit edilmiştir.
• OPC, kalp krizi ve felç yönünden risk taşıyan kan pıhtılaşmasına karşı da olumlu etkiler göstermektedir. Arizona Üniversitesi’nden Dr.Ronald Watson, OPC’nin trombosit kümelenmesini normale döndürdüğünü belirtmektedir. Dr.Watson yaptığı deneylerde, sigara içen insanlarda trombosit kümelenmesini tespit etmiş ve bu kişilerin OPC alımından 20 dakika sonra trombositlerinin normale döndüğünü saptamıştır.
• ‘Metabolism’ 2009 Aralık sayısında yer alan klinik çalışmanın sonucuna göre üzüm çekirdeği ekstresi metabolik sendromlu hastalarda yüksek tansiyonun düşürülmesinde plasebo tedavisinden daha etkili olmuştur.
• Üzüm çekirdeği kronik venöz yetmezlik gibi sorunlarda olumlu etkiler sağlayabilir. Yaralanma ya da ameliyat sonrası görülen şişliği azaltabilir. 10 ila 30 gün süresince dolaşım için günlük 150-300 mg, şişlik içinse 200-400mg alımı öneriliyor.
• Avrupa’da yapılan araştırmalar, üzüm çekirdeğinin vücut içerisinde histamin salgısını önlendiğini ve saman nezlesi gibi alerjik reaksiyonlarda etkili olduğunu göstermektedir.
• Fransa’da 100 denek üzerinde yapılan araştırmada 5 hafta süresince günlük 200 miligram üzüm çekirdeği alımının, parlak ışıklara maruz kaldıktan sonra görme keskinliğine yeniden kavuşma hızının arttığı saptanmıştır.
• Üzüm çekirdeğinin yüksek antioksidan aktivitesi, meme, prostat, akciğer, kolon ve mide gibi bazı kanser türlerini önlemeye yardımcı olabilir. Laboratuar çalışmaları üzüm çekirdeği ekstresinin çeşitli kanser hücrelerinin büyümesini engellediğini göstermektedir.
• 2010 yılında ‘Neoplasia’ adlı dergide yer alan bir çalışmada kolon ve bağırsak kanseri olan farelere altı hafta boyunca üzüm çekirdeği ekstresi verilmiş ve polip sayısı %40 azalmıştır. Boyutu 2 mm daha büyük poliplerin sayısı %71 azalmıştır.
•Journal of Medicinal Food adlı dergide yayınlanan bir bilimsel çalışmada, kırmızı üzüm çekirdeği ekstresinin deney hayvanlarının cildinde, UV ile oluşturulan oksidatif strese karşı koruyucu etki gösterdiği tespit edilmiştir.
• Alabama Üniversitesi Dermatoloji Bölümünce yaplan ve sonuçları ‘Pharmaceutical Research’ 2010 yılı Haziran sayısında yayınlanan araştırmada, üzüm çekirdeğindeki proantosiyanidin’lerin UV ışınla oluşturulan deri tümörü gelişimine karşı koruyucu etki gösterdiği saptanmıştır.
• ‘Frontiers in Bioscience’, 2011 Haziran sayısında yayınlanan çalışmaya göre kombine edilmiş üzüm çekirdeği ekstresi ile resveratrol’un insan kolon kanser hücrelerini öldürmede etkinliğinin olduğu tespit edilmiştir.
• C-reaktif protein düzeyleri, hem kalp hastalıkları hem de diyabet riskiyle ilgili bir iltihaplanma ölçüsüdür. İnflamasyon arttıkça kalp hastalığı riski artar. İngiltere’de yapılan ve sonuçları ‘Diabetes Medicine’ 2009 Mayıs sayısında yayınlanan araştırmaya göre 4 hafta boyunca günlük 600 mg üzüm çekirdeği ekstresi alımı C-reaktif proteininde önemli bir azalma sağlamıştır.
Üzüm Çekirdeği Nasıl Kullanılır?

Üzüm çekirdeği kullanımı taze olarak tüketimi dışında birkaç şekilde de alınabilir.
Üzum Çekirdeği Tozu
1 tatlı kaşığı üzüm çekirdegi tozu bal ya da yoğurtla karıştırılıp alınabilir. Açıkta satılan öğütülmüş üzüm çekirdeği kullanmaktan kaçınılmalıdır. Havayla temas etmesi üzüm çekirdeği tozunun sterilize özelliğini kaybetmesine neden olabilir. Günde bir avuç kuru üzüm yenilerek de üzüm çekirdeği alınabilir.
Üzüm Çekirdeği Ekstresi
Üzüm çekirdeği özü kapsül, tablet ve sıvı ekstre olarak satılmaktadır. %40 ila %80 proantosiyanidinler ya da %95 OPC içeren ürünler tercih edilmeli.
Genel antioksidan aktivite için günlük 50 mg-200 mg,
Kronik venöz yetmezlik için 150 mg-300 mg,
Ödem için 200 mg-400mg (10 ila 30 gün)
Üzüm çekirdeğinin bu tür kullanımı dışında kozmetik alanında kullanılan şekilleri de vardır. (üzüm çekirdeği kremi, şampuan, sabun gibi.)
Üzüm Çekirdeğinin Zararları Varmıdır?

Bilinen bir yan etkisi yoktur. Ancak herhangi bir rahatsızlık için ilaç tedavisi gören kişilerin doktorlarına danışarak kullanmaları daha doğru olur.

[maturidi]

Kronik Venöz Yetmezlikten Şikayetçi Olan Hastalarda Kırmızı Asma Yaprağı Ekstraktının Etkinliği ve Tolere Edilebilirliği – Çift-kör, Plasebo Kontrollü Bir Çalışmanın Sonuçları

Soyut

Hedefler
Dermatoloji Bölümü, Bonn Üniversitesi, Sigmund-Freud-Strasse 25, 53229 Bonn, Almanya. Eberhard.Rabe@ukb.uni-bonn.de

Bu çalışmanın amacı, kırmızı asma yaprağı ekstresinin (AS195, Antistax ^® , Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim, Almanya) kronik hastalığı olan hastalarda bacak hacmi ve klinik semptomlar üzerindeki etkisini araştırmaktı. venöz yetmezlik (CVI). Tasarım, malzemeler ve yöntemler

CVI hastalarında (CEAP Derece 3-4a) ve orta ila şiddetli klinik semptomlarda 12 hafta boyunca günde 720 mg AS195 ile çok merkezli, randomize, çift kör ve plasebo kontrollü bir çalışma yürütülmüştür. Etkililik son noktaları, suyun yer değiştirme hacmi ile belirlenen uzuv hacmindeki değişiklikler, 10 cm'lik bir görsel analog skalada değerlendirilen klinik CVI semptomları ve global etkinlik değerlendirmeleridir. Sonuçlar

Tam analiz seti 248 hastayı içeriyordu (plasebo: n = 122; AS195: n = 126). 12 hafta sonra AS195, alt ekstremite hacmini plaseboya göre ortalama 19.9 standart hata (SE) 8.9 ml (%95 güven aralığı (GA): -37.5, −2.3; p = 0.0268; kovaryans analizi, ANCOVA) ile önemli ölçüde azalttı. Hacim azaltma için 0.28'lik standartlaştırılmış etki boyutu, klinik olarak ilgili bir etkiyi gösterir. 84. günde, görsel analog skala ile değerlendirilen 'bacak ağrısı' semptomu AS195 grubunda plasebo grubuna kıyasla azaldı: ortalama fark -6,6 SD 3,3 mm (%95 GA: -13.1,-0,1; p = 0,047 ). Diğer semptomlar önemli bir değişiklik göstermedi. AS195'in tolere edilebilirliği plaseboya benzerdi. Sonuçlar

84 günlük AS195 tedavisi, plasebo grubuna kıyasla aktif tedavi grubunda uzuv hacminde yaklaşık 20 ml azalma ile sonuçlandı. Hastalar, plaseboya kıyasla AS195 ile tedaviyi takiben subjektif iyileşme bildirdiler. Bununla birlikte, hastaların genel etkinlik derecelendirmesi, uzuv hacminde ölçülen azalmalarla iyi bir korelasyon göstermedi.
Deneme Kaydı: ClinicalTrials.gov NCT00855179.anahtar kelimeler

• Kronik venöz yetmezliüi
• Antistax®

Kronik venöz yetmezlik (CVI) yetişkin popülasyonda yaygındır; yaygınlığı yaklaşık %17'dir. ^{1 2 3}
Tipik klinik belirtiler ödem, venöz egzama, cilt hiperpigmentasyonu, beyaz atrofi ve venöz ülserleri içerir. ⁴
Ödem önleyici ilaçlar bacak ödemi, ağrı, yorgunluk, ağır bacaklar ve diğer subjektif semptomları tedavi etmek için kullanılır, ancak çok azı hafif ila orta CVI'da güvenlik ve etkinlik göstermiştir. Bunlar arasında at kestanesi tohumu özleri, hidroksietilrutozitler, Daflon ^® (Servier, Fransa) ve kırmızı asma yaprağı özü AS195 (Antistax ^® ; Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim, Almanya) bulunmaktadır. ^{5 6 7 8 9}
AS195'in farmakolojik etkisi, esas olarak kersetin glukozit, kaempferol glukozit ve kersetin glukuronid gibi flavonollerdeki içeriğine atfedilir; özüt bir bütün olarak aktif bileşen olarak kabul edilir.
AS195, önceki çalışmalarda CVI semptomlarının tedavisinde etkinlik göstermiştir. ^{8 9}
AS195 ile film kaplı tabletlerin etkinliğini ve tolere edilebilirliğini doğrulamak için burada sunulan çalışmayı gerçekleştirdik. Araç ve yöntemler

Çalışma, Uluslararası Uyumlaştırma-İyi Klinik Uygulamalar Konferansı'na (ICH–GCP) göre yapıldı ve Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uyuldu. İlgili ulusal makamlar tarafından yetkilendirilmiş ve ilgili ulusal makamlara bildirilmiş ve ilgili kurumların Etik Kurullarından onay alındıktan sonra başlatılmıştır. Çalışma, EudraCT-No 2008-003932-40 (ClinicalTrials.gov-No NCT00855179) kapsamında gerçekleştirilmiştir. Katılımcılar

Müfettişler, hastaları uygunluk açısından taramadan önce sözlü ve yazılı olarak bilgilendirdi ve yazılı onam aldı. Almanya'daki yirmi merkez, CEAP (Klinik Etiyolojik Anatomik Patofizyolojik) Derece 3 (ödem) veya 4a (venöz hastalığın neden olduğu hafif cilt değişiklikleri, örneğin pigmentasyon ve venöz egzama) olan 18 yaşında veya daha büyük KVY'li erkek veya kadın hastaları işe aldı. . Hastalar, genellikle fleboloji konusunda uzmanlaşmış dermatolog olan flebologlar tarafından değerlendirildi. Dahil edilenler, dijital kompresyondan sonra pretibial çukurlaşma ve tekrarlanabilir şişme olarak tanımlanan stabil ödem olmalıdır (2 haftalık alıştırma süresi boyunca <150 g yer değiştirmiş su farkı). Hastaların 10 cm'lik bir görsel analog skalada (VAS) orta-şiddetli varisli damarlara ve ≥3 cm yoğunlukta bacak ağrısına sahip olmaları gerekiyordu. Eşzamanlı hastalıkları veya muhtemelen çalışmanın son noktalarını etkileyebilecek tedavileri olan hastalar hariç tutulmuştur: bunlar, dekompanse kalp yetmezliği, venöz olmayan ödem, periferik arter hastalığı (ayak bileği/kol basıncı indeksi <0.9), akut flebit, tromboz, florid venöz ülser, lipodermatoskleroz, böbrek yetmezliği, son 4 hafta içinde venoaktif ilaçlarla tedavi, önceki 2 hafta içinde kompresyon tedavisi veya destek çorapları ve önceki 3 ay içinde ölçülen uzvun venöz cerrahisi veya skleroterapisi. Taramadan önceki iki hafta içinde kardiyovasküler ilaçlara veya laksatiflere kararsız yanıt veren veya değişiklikleri olan hastalar ve ayrıca son 3 ay içinde menopoz sonrası hormon replasman tedavisinde değişiklik veya bu tedaviye başlayan kadınlar, çalışma dışı bırakıldı.Müdahaleler, randomizasyon, körleme ve tahsisin gizlenmesi

Plaseboda 2 haftalık alıştırma döneminden sonra, hastalar tekrar uygunluk açısından tarandı ve ardından günde iki film kaplı tablet ile 12 haftalık oral tedaviye dengeli bir şekilde randomize edildi. Tabletler, aktif tedavi grubu için 360 mg tablet ^-1 AS195 (toplam günlük doz: 720 mg AS195) veya plasebo grubu için görünüş ve tat açısından benzer plasebo içermiştir.
Hastalar, sahada bir sonraki mevcut numaranın bulunduğu ilaç kutusunu aldı. Tahsis edilen tedavi grubu, randomizasyon koduna göre belirlendi. Çalışma sponsorunun çalışma performansına dahil olmayan bir bölümü bu kodu doğrulanmış yazılım kullanarak hazırladı. Tedavi tahsisi gizlendi ve sahalardaki hastalar ve çalışma personeli, sponsor ve klinik araştırma organizasyonu (CRO) veri tabanı kilitlendikten sonrasına kadar tedavi atamasına karşı körleştirildi.Çalışma hedefleri, programı ve sonuçları

Bu çalışma, AS195 içeren film kaplı tabletlerin tolere edilebilirliğini ve bunların alt ekstremite ödemini azaltmadaki ve CVI hastalarında subjektif semptomları iyileştirmedeki etkinliklerini değerlendirdi. Hastalar, mümkünse öğleden sonra geç saatlerde çalışma merkezlerine her ziyarette aynı zamanda gelmek zorunda kaldılar. Ziyaretler 14. Gün (Tarama, alıştırma başlangıcı), 0/1. Gün (tedavinin başlangıcı) ve 21, 42 ve 84. Günlerde (3 gün içinde) planlandı.
Birincil etkinlik değişkeni, yer değiştiren suyun ağırlığı olarak ölçülen, başlangıçtan 84. güne kadar daha ciddi şekilde etkilenen uzvun hacmindeki değişiklikti. Tüm ölçümler, termoregülatuar ve kardiyovasküler adaptasyon (oturma pozisyonu) için 45 dakika dinlendirildikten sonra ve standart oda sıcaklığında yapıldı. Bacak, 34 °C'de 28 cm seviyesine kadar suyla doldurulmuş özel olarak tasarlanmış bir kaba yerleştirildi. Bacak sokarak yerinden taşan su plastik bir beher içinde toplanmıştır. Yer değiştiren suyun ağırlığı kaydedildi ve bir yazıcı ile dijital bir ölçekte belgelendi. Yer değiştiren suyun ağırlığı, suyun özgül ağırlığından (0.993 g ml- ^{1 ) uzuv hacmini hesaplamak için kullanılabilir.}34 °C'de; bu makale g ve ml'yi birbirinin yerine kullanır). Tüm ölçümler 5-10 dakika içinde iki kez veya birinci ve ikinci ölçümler >20 g arasında farklılık gösteriyorsa üç kez yapıldı. İstatistiksel analizler, ölçümlerin aritmetik ortalamasına dayanıyordu. Hacim ölçümü yapan çalışma personeli çalışmadan önce eğitilmiştir. Çalışma boyunca tekli ölçümlerin değerleri izlendi ve eğer değişkenlik zorluklar gösteriyorsa, personel denetlendi ve yeniden eğitildi.
İkincil etkinlik değişkenleri, başlangıçtan 21 ve 42. Günlere kadar daha fazla etkilenen uzvun hacmindeki değişiklik, baldır çevresinin başlangıçtan 21, 42 ve 84. Günlere kadar değişmesi, subjektif CVI semptomlarındaki değişiklik (yorgun, ağır bacaklar; gerilim ve CVI'ye atfedilebilen bacak ağrısı) başlangıçtan 21, 42 ve 84. Günlere (10 cm VAS), subjektif CVI semptomlarının iyileşme süresi (0-2–5–10–20 gün, iyileşme yok) ve hastalar ve araştırmacılar tarafından küresel etkinlik değerlendirmeleri (4 puanlı sözel derecelendirme ölçeği (VRS); 84. Gün).
Güvenlik uç noktaları, advers olayları (AE'ler), güvenlik laboratuvarı değerlendirmelerini (kan kimyası ve hematoloji), hayati belirtileri (nabız hızı ve kan basıncı) ve hastalar ve araştırmacılar tarafından yapılan global tolere edilebilirlik değerlendirmelerini (4 noktalı VRS; 84. Gün) içermiştir.Eşzamanlı tedavi

Hastalar, analjezik, antienflamatuar (topikal ve sistemik nonsteroidal antienflamatuar ilaçlar veya sistemik kortikosteroidler), anti-migren ilaçları (ergot alkaloidleri dahil) ve psikotrop ilaçları en aza indirmeli veya mümkünse bunlardan kaçınmalıdır. Yüksek dozda laksatifler, kompresyon tedavisi, diüretikler, nitratlar ve diğer vazoaktif, dolaşım veya CVI ilaçları kabul edilemezdi.Örnek boyutu ve istatistikler

Örneklem büyüklüğü tahmini, karşılaştırılabilir bir popülasyonda önceki benzer bir çalışmaya dayanıyordu. ⁹
AS195 grubunda başlangıca karşı 84. günde −42,2 g'lık bir tedavi farkı, plasebo grubunda hiçbir etki ve 100 g'lık ortak bir SD varsayılmıştır. Bu büyüklükteki bir etkiyi %90 güçle ve iki taraflı %5 anlamlılık düzeyiyle saptamak için grup başına 119 hasta gerekliydi. Sonuç olarak, çalışma grup başına 120 tedavi edilen hastayı (toplam 240 hasta) içermeyi amaçladı.
Eksik etkinlik verileri, 'ileriye taşınan son gözlem' (LOCF) prosedürü ile değiştirildi. Eksik veriler, zayıf etkinlik, zayıf tolere edilebilirlik veya AE'ler nedeniyle geri çekilme veya terkten kaynaklanıyorsa, tolere edilebilirlik veya etkililiğin küresel değerlendirmesi için eksik girişlere en az elverişli kategori atanmıştır.
Birincil son nokta '84. Günde uzuv hacmindeki taban çizgisinden değişiklik' ile ilgili olarak tedavi grupları arasındaki farklılıklar, ortak değişkenler olarak merkez ve taban çizgisi ve faktör tedavisi dahil olmak üzere bir kovaryans analizi (ANCOVA) kullanılarak test edildi. Merkez ve başlangıç değerleri için ayarlanan en küçük kare ortalamalar her iki grup için hesaplandı ve AS195 ile plasebo arasında karşılaştırıldı. İlgilenilen tedavi kontrastı için iki taraflı bir %95 güven aralığı (CI) hesaplandı. Merkez etkileşimi ile tedavi, bir duyarlılık analizinde araştırıldı. Birincil analiz, tam analiz veri setine (FAS) dayanıyordu. FAS sonuçlarını desteklemek için birincil son nokta için protokol başına veri seti (PPS) ile bir değerlendirme yapıldı.
Sürekli ikincil son noktalar için (21 ve 42. Günlerde uzuv hacimlerinde başlangıca göre değişiklik; 21, 42 ve 84. Günlerde baldır çevresinde ve subjektif CVI semptomlarında değişiklik), birincil son nokta için kullanılanla aynı istatistiksel yöntem kullanıldı. Wilcoxon's rank testi, semptomların iyileşmesine kadar geçen sürenin değerlendirilmesi ve hastalar ve araştırmacılar tarafından global etkinlik ve tolere edilebilirlik değerlendirmeleri için kullanıldı.
AE'ler MedDRA 12.1'de kodlandı ve tedavi grupları arasındaki insidansları karşılaştırmak için tablo haline getirildi. Hayati belirtilerdeki, laboratuvar değerlerindeki, fiziksel muayenelerdeki veya güvenlikle ilgili diğer verilerdeki değişiklikler, tedavi grubu tarafından özetlendi ve tanımlayıcı olarak karşılaştırıldı. Tüm istatistiksel analizler SAS ^® Sürüm 8.02 ile yapıldı.Sonuçlar Katılımcılar

Nisan ve Kasım 2009 arasında, 20 merkez 283 hastayı kaydetmiştir; Çalışmaya 250 hasta katıldı, 123'ü plaseboya ve 127'si AS195'e randomize edildi. Her iki gruba ayrılan bir hasta tedavi edilmedi (laktoz intoleransı ve randomizasyondan hemen sonra takip kaybı). On yedi hasta (%6,9), 10'u plaseboda (%8,2) ve 7'si AS195 grubunda (%5,6) olmak üzere çalışmayı erken sonlandırdı. Nedeni, beş plasebo hastasında ve bir AS195 hastasında AE'lerdi. Şekil 1 , katılımcıların akışını ve erken devamsızlığın nedenlerini göstermektedir. FAS , tedavi edilen ve birincil son nokta için veri sağlayan 248 hastayı (plasebo: n = 122; AS195: n = 126) içermiştir.
Şekil 1 Çalışmaya katılanların akışı.

• Büyük Resmi Görüntüle
• Şekil Görüntüleyici
• Yüksek çözünürlüklü resmi indir
• İndir (PPT)

Her iki deneme kolunda da benzer sıklıkta, yani plaseboda 11 hasta (FAS'nin %9'u) ve AS195 grubunda 13 hastada (%10) önemli protokol ihlalleri bulundu. Sebepler, yanlış tedavi süresi ( sırasıyla plasebo ve AS195 grubunda n = 9 ve n = 9; birden fazla neden mümkün), birlikte yasaklanmış ilaç ( n = 3; n = 3), run- ilaç tedavisi ( n = 2; n = 3), dahil etme kriterinin ihlali ( n = 0; n = 4) ve ziyaretlerin yanlış zamanlaması ( n = 1; n = 2). Önemli protokol sapmaları olan 24 hastanın tümü (%10), 224 hastayı (FAS'nin %90'ı), plaseboda 111'i (%91) ve AS195 grubunda 113'ü (%90) içeren PPS'den hariç tutulmuştur.Demografi ve temel veriler

Çalışma hastalarının çoğu kadındı ( n = 248'den 202'si; %81,5), ortalama yaş 58 SD 13 yıldı (aralık: 21-87 yıl). Hasta popülasyonu büyük ölçüde fazla kiloluydu ve ortalama vücut kitle indeksi (BMI) 28.3 SD 5.2 kg m ^-2 idi . AS195 grubunda plasebo grubundan daha fazla hasta kadındı (%84'e karşı %79). Aksi takdirde, tedavi grupları arasında demografik parametrelerde anlamlı bir fark yoktu.
Flebolojik durum her iki deneme kolunda da benzerdi. Genel olarak, %64'ünün CEAP puanı 3, %36'sı 4a puanına sahipti. Ortalama KVY süresi 11.5 SD 13 yıldı (aralık: 0-49 yıl).
Katılımcıların çoğunda orta derecede bacak ödemi vardı (%78; şiddetli: %22). Varisli damarlar, deneme popülasyonunun %79'unda orta ve %21'inde şiddetli olarak derecelendirilmiştir. Hiperpigmentasyon (herhangi bir yoğunluk) %57'sinde mevcuttu. Dörtte birinde (%24) genellikle hafif şiddette egzama vardı. Hemen hemen tüm hastalarda (%97) telenjiektazi veya retiküler damarlar vardı (hafif veya orta: %89; şiddetli: %8).
Genel olarak, hastaların %29'u çalışmadan önceki 3 ay içinde CVI tedavisi görmüştü (plasebo: %35; AS195: %22). En sık olarak bunlar kompresyon çoraplarıydı (plasebo: %20; AS195: %13).
Temel etkililik değişkenleri her iki tedavi kolunda da benzerdi ve Tablo 1'de tablo halinde verilmiştir . Üç subjektif CVI semptomunun ortalama değerleri 10 cm'lik VAS'ta yaklaşık 6 cm idi, bu da hastaların çoğunluğunun en azından orta derecede etkilendiğini doğrular.
Tablo 1 Temel etkinlik değişkenleri (Tam Analiz Seti), Tüm veriler: ortalama ve standart sapma (SD).

Yer değiştiren suyun ağırlığı olarak ortalama uzuv hacmi [g]	2339.4 SD 324.0	2306.2 SD 362.5
Menzil	1658–3597	1646–3768
Baldır çevresi [cm]
ortalama, SD	40,3 SD 3,8	39.9 SD 4.1
Menzil	30–51	33–55
Yorgun ağır bacaklar [0–10 cm VAS]
ortalama, SD	6.0 SD 2.1	5.9 SD 2.0
Menzil	0.0–10.0	0.0–9.9
Bacaklarda gerginlik hissi [0–10 cm VAS].
ortalama, SD	5,9 SD 2,2	6.0 SD 2.0
Menzil	0,3–10,0	0,3-9,8
Bacaklarda ağrı [0–10 cm VAS]
ortalama, SD	6.3 SD 1.9	6.2 SD 1.8
Menzil	3.0–10.0	1.2–9.8

• Tabloyu yeni bir sekmede aç

Etki

Bu bölümdeki sonuçlar FAS ve ANCOVA ile ilgilidir, varsa merkez etkisi ve temel değer için ayarlama yapar. Tedavi grupları arasındaki negatif farklılıklar AS195'in üstünlüğünü gösterir. PPS için sonuçlar benzerdi, ancak AS195'in üstünlüğünü daha net gösterme eğilimindeydi.
Plasebo hastalarında, ortalama uzuv hacmi çalışma sırasında başlangıca göre 7,2 SE 6,9 ml, AS195 grubunda 27.1 SE 6,8 ml azaldı ( Tablo 2 ). Bu gruplar arasındaki ortalama fark istatistiksel anlamlılığa ulaşır.
Tablo 2 Yer değiştiren suyun ağırlığı olarak ölçülen uzuv hacmi; taban çizgisinden 84. Güne (Tam Analiz Seti) değiştirin. Tüm veriler: ortalama ve standart hata (SE).

Yer değiştiren suyun ağırlığı olarak uzuv hacmi [g; ortalama SE]
taban çizgisi	2339.1 SE 29.3	2306.2 SE 32.3
84. Gün	2331.1 SE 30.4	2277.6 SE 31.9
Taban çizgisinden değiştir
Düzeltilmiş ortalama (SE) a	−7.2 SE 6.9	-27.1 SE 6.8
Plasebodan farkı
Düzeltilmiş ortalama (SE) a		-19.9 SE 8.9
%95 güven aralığı		(−37,5,−2,3)
p -değeri (ANCOVA)		0.0268

a Merkez etkisi ve temel değerler için ayarlanmış araçlar.

• Tabloyu yeni bir sekmede aç

AS195 grubu zaman içinde bacak ödeminde lineer bir iyileşme gösterirken, plasebo alan hastalar 21 ve 42. Günler arasında bacak ödeminde hafif bir artış ve ardından 42. Günden sonra bir azalma gösterdi (bakınız Şekil 2 ). Gruplar arasındaki fark 21. Günde ( p = 0.702) −2.6 SE 6.7 ml (%95 GA: -15.8, 10.7) ve 42. Günde −17.0 SE 8.6 ml (%95 GA: −34.1, 0.0; p = 0.05 ) idi. ). Şekil 2 Zamanla uzuv hacmindeki taban çizgisinden değişiklik için düzeltilmiş ortalama (SE); yer değiştiren suyun ağırlığı [g] (FAS) olarak ölçülür.

• Büyük Resmi Görüntüle
• Şekil Görüntüleyici
• Yüksek çözünürlüklü resmi indir
• İndir (PPT)

Merkez etkileri ve merkez etkileşimleriyle tedavi önemli değildi. Bu çalışmada erkek hastalar ile kadın hastalar arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. 84. günde plaseboya karşı ortalama hacim azalması erkeklerdi: −23.7 SE 22,7 g, kadınlar −14,3 SE 10,2 g, NS Daha önce CVI tedavisi almış olan hastalar ile almayanlar arasında anlamlı bir fark yoktu. 84. Günde plaseboya karşı ortalama hacim azalması önceki tedaviydi: -32.2 SE 15.9 g, önceki tedavi yok-19,0 SE 11.5 g, NS
Baldır çevresi, plasebo ve AS195 grupları arasında önemli ölçüde farklılık göstermedi. Gruplar arasındaki ortalama fark 21. Gün: −0.04 SE 0.12 cm (%95 GA: -0.27, 0.19; p = 0.73), 42. Gün: −0.13 SE 0.13 cm (%95 GA: -0.39, 0.13; p = 0.32 idi. ) ve 84. Gün: -0.17 SE 0.13 cm (%95 GA: -0.44 0.09; p = 0.20).
Her iki tedavi grubunda da subjektif CVI semptomları düzeldi. AS195, plasebodan daha etkiliydi ve 'yorgun, ağır bacaklar' ve 'bacaklarda ağrı' semptomları için gruplar arasındaki mutlak fark, zaman içinde yaklaşık olarak doğrusal olarak arttı. 'Bacaklarda gerginlik hissi', gruplar arasındaki en büyük farkın 42. Günde olduğunu gösterdi (−6.5 SD 3.0 mm; %95 GA: -12.3, −0.6; p = 0.031; ANCOVA). 84. günde, aktif tedavi ile plasebo arasındaki düzeltilmiş ortalama fark, "yorgun, ağır bacaklar" için -2.9 SD 3.1 mm (%95 GA: -9.0, 3.2), -3.5 SD 3.2 mm (%95 GA: -9.8, 2.8) 'bacaklarda gerginlik hissi' için ve -6,6 SD 3,3 mm (%95 GA: -13.1, −0.1; p = 0.047) 'bacaklarda ağrı' için.
Her üç subjektif semptom için iyileşme süresi, plasebo ve AS195 gruplarında benzerdi. AS195 grubunda, tedavinin ilk 20 günü boyunca %55,6'sı 'bacak ağrısında' (plasebo: %48,3) bir iyileşme hissetti. Her üç semptom için de iyileşme AS195 ve plasebo gruplarında benzer zamanlarda ortaya çıkma eğilimindeydi ( p < 0.1; Wilcoxon testi).
Araştırmacılar, AS195'e randomize edilen hastalar için global klinik etkinliği önemli ölçüde daha iyi değerlendirdi ( p = 0.034, Wilcoxon testi). AS195 hastalarının %71'inde etkinliği iyi veya tatmin edici olarak değerlendirdiler (plasebo: %54). Hasta derecelendirmeleri benzer sonuçlar buldu (AS195: %70 iyi veya tatmin edici; plasebo: %59), ancak gruplar arasındaki fark anlamlı değildi ( p = 0.259) (bakınız Şekil 3 ). 37 hastada, araştırmacıların ve hastaların değerlendirmeleri aynı fikirde değildi. Bu vakaların 16'sında, yedisinde büyük hacim azalmaları (>50 g) ve kısmen sübjektif semptomlarda belirgin bir iyileşme olmasına rağmen, hastalar etkinliği tatmin edici/kötü olarak değerlendirdi. Genel olarak, hasta derecelendirmeleri, araştırmacının değerlendirmeleriyle tatmin edici bir şekilde kabul edildi (Spearman Korelasyon Katsayısır = 0.73), ancak hacimsel ( r = 0.13) ve subjektif klinik semptomlar ( r ≈ 0.43) ile çok az. Şekil 3 Araştırmacıların ve hastaların global klinik etkililik (FAS) derecelendirmeleri.

• Büyük Resmi Görüntüle
• Şekil Görüntüleyici
• Yüksek çözünürlüklü resmi indir
• İndir (PPT)

Emniyet

Genel olarak, 73 hasta (FAS'nin %29'u) tedavi aşamasında, 43'ü (%35) plaseboda ve 30'u (%23,8) AS195 grubunda AE yaşadı. Dört plasebo hastası (%3) ve beş AS195 hastası (%4) araştırmacının çalışma ilacıyla ilgili olduğuna karar verdiği AE'ler yaşadı. Bu olaylar hiperkolesterolemi, baş dönmesi, gaz, halsizlik, ürtiker ve uyku bozukluğunun şiddetlenmesiydi.
Nedensellikten bağımsız olarak herhangi bir gruptaki hastaların en az %1'inde ve AS195'te plasebo grubuna göre daha sık meydana gelen AE'ler nazofarenjit (plasebo grubunda n = 3'e karşı n = 2), hiperkolesterolemi ( n = 2'ye karşı n = 2) n = 1), orofaringeal ağrı ( n = 2'ye karşı n = 0), ürtiker ( n = 2'ye karşı n = 0) ve sırt ağrısı ( n = 2'ye karşı n = 0). Ürtiker vakaları, AS195 grubuna göre plaseboda daha sık meydana gelen kaşıntı vakaları ile dengelenir ( n = 2'ye karşı n = 0).
Randomize tedavi aşaması sırasında, sekiz hasta, tümü hastaneye kaldırılmayı içeren ciddi AE'ler yaşadı. Hiçbiri uyuşturucuyla ilgili olarak kabul edilmedi. Dört hastaya AS195 (AE'ler retina dekolmanı; karın ağrısı; intravertebral disk çıkıntısı ve safen venin soyulmasını takiben tromboflebit dahil) ve dört plasebo (AE'ler serebrovasküler kaza; periferik ödem, cilt ülseri, staz dermatiti ve süperenfeksiyon; kalp yetmezliğini içeriyordu) almıştı. ; ve lomber radikülopati). Bir plasebo hastası, takip süresi boyunca ciddi bir AE yaşadı (polimiyalji romatika).
Beş plasebo ve bir AS195 hastası, AE'ler nedeniyle çalışmayı bırakmıştır. Bu AE'ler, erizipel, süperenfeksiyon, serebrovasküler olay, kalp yetmezliği, cilt ülseri, staz dermatiti, plasebo grubunda ekstremitede ağrı ve periferik ödem ve AS195 grubunda intervertebral disk çıkıntısıydı (birden fazla AE'nin kesilmesi mümkündür).
Laboratuvar değerlerindeki veya yaşamsal belirtilerdeki değişiklikler güvenlik sinyallerini ortaya çıkarmadı (veriler gösterilmemiştir). Araştırmacıların ve hastaların genel tolere edilebilirlik değerlendirmeleri, tedavi grupları arasında kayda değer veya istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulmadı (sırasıyla p = 0.533 ve p = 0.919; Wilcoxon testi). Tolerabilite, hastaların %91-97'sinde iyi veya tatmin edici olarak değerlendirildi.Tartışma

Daha önceki bir Faz III çalışmasında, ⁹
360 ve 720 mg gün- ¹ AS195, CVI'nın uzun süreli semptomatik kontrolü için güvenli ve etkili bir tedavi olarak bulundu (Widmer derece I-II). Çalışma ilacı, 12 haftalık tedaviden sonra birincil klinik son nokta olan bacak ödemini önemli ölçüde iyileştirdi. 360 mg grubunda plaseboya kıyasla ödem 76 ml (%95 GA: -106 ila -46 ml) ve 720 mg grubunda 100 ml (%95 GA: -130 ila -70 ml) azaldı. Etki, bacak çevresinin azalması, subjektif semptomların hafifletilmesi ve hastalar ve araştırmacılar tarafından global etkinlik derecelendirmeleri dahil olmak üzere diğer tüm etkinlik parametreleri arasında tutarlıydı. Bir başka çift kör çalışma, AS195'in (günde 360 mg) ayak bileği ve baldır çevresini azalttığını, oysa bu parametrelerin plasebo altında arttığını doğruladı. ⁸
Ayrıca AS195, plaseboya kıyasla mikrovasküler kan akışını ve deri altı oksijen basıncını iyileştirdi.
Bu çalışma, AS195'in CVI hastalarında sürekli olarak nesnel ve öznel sonlanım noktalarını plasebodan daha büyük ölçüde iyileştirdiğini doğruladı. Alt ekstremite hacmini, eşlik eden bacak gerginliği hissini ve CVI ile ilişkili bacak ağrısını plasebodan önemli ölçüde daha fazla azalttı. AS195, alt ekstremite hacmini plaseboya göre 20 ml azalttı. Bu, bu ilaçla yapılan önceki çalışmada bulunandan daha azdır, ⁹ ancak aralıkta bir Cochrane incelemesi ve diğer flebotonik ilaçlarda gözlemlenen yakın tarihli bir genel bakış. ^{10 11}
Öncelikli olarak suyun yer değiştirmesi bacak hacminin hata kaynaklarını tartışan bu genel bakış, plaseboya karşı aktif tedavinin etkilerini +7.5 ml (plasebonun üstünlüğü) ile -100 ml (aktif ilacın üstünlüğü) arasında buldu. 20 ml'lik bir hacim azalması, yaklaşık 2500 ml'lik baldırın tüm hacmi ile karşılaştırıldığında küçük görünebilir. Ancak bu hacim, kemik ve kaslar gibi değişken olmayan büyük kısımlar içerir. Marshall ve arkadaşlarına göre, ödem sadece yaklaşık 650 ml'lik bir anatomik boşlukta birikir ve teorik olarak mobilize edilebilecek bir flebolojik ödemin hacmi yaklaşık 220 ml'dir. ^{12 13} 20 ml'lik bir azalma, bu nedenle, bu maksimum etkinin yaklaşık %10'una karşılık gelir.
Klinik uygunluğu değerlendirmek için , hacim azalmasının standartlaştırılmış etki büyüklüğünü (standartlaştırılmış ortalama fark (SMD)) sonradan hesapladık. Orta derecede belirgin ve klinik olarak anlamlı bir etkiyi gösteren 0.28'lik bir SMD bulduk. ¹⁴ Cochrane incelemesinde, SMD 0.03 ile 2.49 arasında değişiyordu. ¹⁰
Çalışma, farklı bir hasta popülasyonunu içeriyordu. Bu, yaş aralığına (21-87 yıl), CVI süresine (0-49 yıl), temel uzuv hacmine (1646-3768 ml) ve neredeyse 0-10 ölçeğinin tamamını kapsayan klinik semptomlara bakıldığında belirginleşir. Başlangıç değerlerine bakılırsa, hastalar AS195 ile daha önceki Faz III çalışmasına göre CVI'dan daha ciddi şekilde etkilenmiştir. ⁹
Bu çeşitli popülasyon, çalışma sonuçlarımızı genel veya flebolojik uygulamada görüldüğü gibi seçilmemiş bir popülasyona uygulanabilir kılmaktadır.
Kılavuzlar, CVI'da farmakolojik tedavinin yerini tanımlar. ^{15 16}
AS195 gibi flavonoidler, kompresyon tedavisine yetersiz yanıt veren hastalarda veya kompresyonun kontrendike olduğu hastalarda endikedir. Bu, periferik arter tıkayıcı hastalığı olan veya dekompanse kalp yetmezliği olan hastalarda söz konusu olabilir. ¹⁷
Ayrıca, omurga ve/veya ekstremite artriti olan hastalar varis çorabı giyemeyebilir ve açık yarası veya hassasiyet bozukluğu olan hastalar bunları tolere edemeyebilir. AS195 gibi flavonoidler burada bir tedavi seçeneğidir. Kompresyon, ilaç tedavisi ve cerrahi tedavi ile CVI hastaları için çok modlu bir tedavi konseptinin parçası olabilirler. Geleceğe yönelik bir perspektif olarak, kompresyon çoraplarına karşı yapılan bir çalışma veya tedavi olmaması, flavonoidlerin 5 yıllık bir süre boyunca CVI'nın bozulmasını önleyebileceğini gösterdi. ¹⁸
Bu tür sonuçlar doğrulanabilirse, bu, CVI için terapötik cephanede flavonoidlerin yerini genişletebilir.
Sonuç olarak, AS195 iyi tolere edildi ve orta-şiddetli CVI hastalarında bacak hacmini plaseboya göre yaklaşık 20 ml daha fazla azalttı. İkincil etkinlik parametreleri de iyileştirildi. Hastaların etkinlik değerlendirmesi, diğer objektif ve subjektif parametrelerle iyi bir korelasyon göstermedi. Terapi hastalarının görüşlerini ifade ederken hangi yönleri değerlendirdikleri ve ne bekledikleri belirsizdir.Yazar katkıları

ER ve MS, rapor edilen çalışmanın araştırmacılarıydı, çalışmanın planlanmasına, verilerin analizine ve yorumlanmasına ve makalenin taslaklarına ve düzeltmelerine katkıda bulundular.
AE bu çalışmayı planladı ve çalışma denetimine, verilerin analizine ve yorumlanmasına ve makalenin yazılmasına katkıda bulundu.
ES, çalışma planlamasına ve makalenin gözden geçirilmesine katkıda bulundu.
BO çalışma planlamasına, verilerin analizine ve yorumlanmasına, makalenin yazılmasına katkıda bulundu ve yazarların yorumlarını koordine etti.
Tüm yazarlar son makaleyi okudu ve onayladı.Teşekkür

Boehringer Ingelheim GmbH, GCP'ye göre çalışma sponsoruydu ve finansmandan sorumluydu. Yazarlar, istatistiksel analizler için Erika Richter'e ve veri yönetimi için Andreas Pilnei'ye teşekkür eder.Çıkar çatışması

ER, MS: Bu makale ile ilgili finansal veya finansal olmayan rekabet eden çıkarlar yoktur. Her ikisi de çalışmanın araştırmacılarıydı.
AE ve ES, AS195'in çalışma sponsoru ve üreticisi olan Boehringer Ingelheim GmbH'nin çalışanlarıdır.
BO, bu yazının hazırlanması için ücret aldı.Referanslar

1. Kronik venöz yetmezliğin sosyoekonomik etkisi. Hafife alınan bir halk sağlığı sorunu.
   Int Angiol. 1998; 17 : 161-167
   Makalede Görüntüle Google Akademik
2. Kronik venöz yetmezliğin prevalansı ve risk faktörleri.
   Anjiyoloji. 2001; 52 : S5-S15
   Makalede Görüntüle Google Akademik
3. Bonner Venenstudie der Deutschen Gesellschaft für Phlebologie − Epidemiologische Untersuchung zur Frage der Häufigkeit ve Ausprägung von chronischen Venenkrankheiten in der städtischen ve ländlichen Wohnbevölkerung.
   Fleboloji. 2003; 32 : 1-14
   Makalede Görüntüle Google Akademik
4. Kronik venöz hastalık. New England Tıp Dergisi. 2006; 355 : 488-498 Makalede Görüntüle Google Akademik Frick RW
5. Kronik venöz yetmezlik için üç tedavi: escin, hidroksietilrutoside ve daflon. Anjiyoloji. 2000; 51 : 197-205 Makalede Görüntüle Google Akademik
6. Kronik venöz yetmezlik için tamamlayıcı tedaviler. Alternatif ve Tamamlayıcı Terapilere Odaklanın. 2001; 6 : 3-5 Makalede Görüntüle Google Akademik
7. Kronik venöz yetmezlik için at kestanesi tohumu özü. Cochrane Kütüphanesi. 2001;( Sayı 3 ) Makalede Görüntüle Google Akademik
8. Oral olarak uygulanan kırmızı asma yaprağı özü AS195 ile kronik venöz yetmezliği olan hastalarda kutanöz mikro sirkülasyon ve oksijen kaynağının klinik olarak iyileştirilmesi. Randomize, çift kör, plasebo kontrollü çapraz geçişli bir çalışma. Ar-Ge'de İlaçlar. 2004; 5 : 63-71 Makalede Görüntüle Google Akademik
9. Kronik venöz yetmezlikte (evre I-II) kırmızı asma yaprağı AS195'in (folia vitis viniferae) oral olarak uygulanan ekstraktının etkinliği. Randomize, çift kör, plasebo kontrollü bir çalışma.
   Arzneimittelforschung. 2000; 50 : 109-117 Makalede Görüntüle Google Akademik
10. Cochrane Veritabanı Sistemi Rev. 2005; 3 ( CD003229 ) Makalede Görüntüle Google Akademik Klinik çalışmalarda su deplasmanlı bacak hacmi – hata kaynaklarının tartışılması.Google Akademik
11. BMC Med Res Metodol. 2010; 10 : 5 Makalede Görüntüle
12. Hydroxyethylrutoside zur Behandlung der chronischen Veneninsuffizienz Grad I ve II. Fleboloji. 2005; 34 : 157-164 Makalede Görüntüle. Google Akademik Marshall M.
13. Medikamentöse Therapie von chronischen Venenleiden.TW Dermatoloji. 1993; 23 : 244-248 Makalede Görüntüle Google Akademik Cohen J.
14. Davranış bilimleri için istatistiksel güç analizi. 2. baskı. Erlbaum , Hillsdale, NJ 1988 Makalede Görüntüle Google Akademik
15. Leitlinien zur Diagnostik und Therapie der chronischen venösen Insuffizienz (CVI). Fleboloji. 1998; 27 : 32-35 Makalede Görüntüle Google Akademik Deutsche Gesellschaft für Phlebologie
16. Teşhis ve Tedavi des Ulcus cruris venosum. S3−Leitlinie der Deutschen Gesellschaft für Phlebologie.AWMF Yönerge Kayıt No. 037/009. Ağustos 2008; Makalede GörüntüleGoogle Akademik
17. Leitlinie: Phlebologischer Kompressionsverband (PKV). AWMF Yönerge Kayıt No. 037/005. 25 Haz 2009; Makalede GörüntüleGoogle Akademik
18. O-(beta-hidroksietil)-rutozitler kullanılarak venöz hipertansiyon ve diyabetik mikroanjiyopatide ödem ve artmış kılcal filtrasyonun 5 yıllık kontrolü ve tedavisi: ileriye dönük karşılaştırmalı bir klinik kayıt. Anjiyoloji. 2008; 59 : 14S-20S Makalede Görüntüle Google Akademik

[maturidi]

vitis vinifera