Cinnamomum verum yaprağı uçucu yağının Candida türlerinin virülans faktörleri üzerine etkisi ve Galleria mellonella modeli ile in vivo toksisitenin belirlenmesi
Gayan Kanchana Wijesinghe , 1, + Flávia Camila Maia , 1 Thaís Rossini de Oliveira , 1 Simone N Busato de Feiria , 1 Felipe Joia , 1 Janaina Priscila Barbosa , 1 Giovana Cláudia Boni , 1 Janaina de Cássia Orlandi Sardi , 2 Pedro Luiz Rosalen , 2 ve José Francisco Höfling 1
Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk Reddi
Bu makale, PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır .
Git: Soyut
ARKA FON
Cinnamomum verum'dan ekstrakte edilen uçucu yağlar (EO) , yüzyıllardır antimikrobiyal ajan olarak kullanılmıştır. C. verum yaprağı yağının mikroorganizmaların virülansına karşı etkileri henüz iyi çalışılmamıştır. AMAÇLAR
Bu çalışma etkisini değerlendiren C. verum üç hastalık oluşturma faktörlerinin karşı yaprağı yağı , Candida albicans , C. tropicalis ve C dubliniensis'in ve in vivo toksisitesi. YÖNTEMLER
EO'nun kimyasal bileşimi, gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) kullanılarak belirlendi. Minimum inhibitör konsantrasyon (MIC), klinik ve laboratuvar standartları enstitüsü (CLSI) M27-A3 broth mikrodilüsyonu kullanılarak belirlendi. EO'nun ilk yapışma üzerindeki etkisi, Candida hücrelerinin polistiren yüzeyine 2 saat yapışmasına izin verildikten sonra XTT tahlili kullanılarak ölçülmüştür . EO varlığında Candida'nın biyofilm oluşumu, XTT canlılık tahlili kullanılarak ölçülmüştür. Germ tüpü oluşumunun azaltılması üzerindeki etkinlik, standart protokol kullanılarak değerlendirildi. EO tedavisi altında biyofilm oluşumunun ve ilerlemesinin görselleştirilmesi, sırasıyla taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve Zaman atlamalı mikroskop kullanılarak yapıldı. EO'nun in-vivo toksisitesi kullanılarak belirlendiGalleria mellonella larvaları. Klorheksidin diglukonat: pozitif kontrol. SONUÇLAR
Eugenol, EO'nun ana bileşiğiydi. MIC, 1.0 mg/mL idi. İlk yapışma içinde% 50 azalma ile elde edilmiştir C. albicans , C. tropicalis ve C dubliniensis'in 1.0 ile> 2.0 ve 0.34 mg / mL. 0,5 ve 1,0 mg/mL, germ tüpü oluşumunu önemli ölçüde inhibe eder. Biyofilm oluşturmaya yönelik MBIC 50 , ≤ 0.35 mg/mL idi. 1.0 mg/mL, Candida'nın biyofilm ilerlemesini önler . SEM görüntüleri, hücre duvarı hasarları, hücresel büzülmeler ve azalmış hif oluşumu sergiledi. Test edilen herhangi bir konsantrasyonda in-vivo deney modelinde hiçbir öldürücü etki kaydedilmedi . ÇÖZÜM
C. verum yaprak yağı, Candida'nın virülans faktörlerine karşı etki gösterir ve herhangi bir toksisite göstermez.
Anahtar kelimeler: Cinnamomum verum, uçucu yağ, Candida spp., biyofilmler, antivirülans, Galleria mellonella
Candida spp. fırsatçı mantar enfeksiyonlarının en yaygın nedensel ajanıdır ve cilt ve kulak enfeksiyonları, genitoüriner kandidiyazis, hastane pnömonileri, tıbbi cihazla ilişkili enfeksiyonlar ve Kandidemiler dahil yaşamı tehdit etmeyen mukokutanöz hastalıklara invaziv ciddi yaşamı tehdit eden bir dizi duruma yol açar. 1 , 2 , 3 , 4
Bazı Candida türleri kommensalizm gösterir ve insan vücudunun deri ve mukozal yüzeylerini kolonize eder. Ağır derecede hasta olan veya bağışıklığı zayıf olan hastalar hem yüzeysel hem de yaşamı tehdit eden sistemik Candida enfeksiyonları geliştirmeye daha yatkındır . 5 Enfeksiyonlar için predispozan faktörler: aşırı yaş, hormonal değişiklikler, beslenme yetersizliği, HIV insidansı, sık antimikrobiyal maruziyet, kemoterapötik tedaviler, karbonhidrattan zengin (glikoz) diyetler, protez kullanımı ve düşük bağışıklık. 6 , 7 , 8 , 9 konak faktörleri olarak. Mevcut verilere dayanarak, Candida'nın toplam oluşumu enfeksiyonlar, tüm dünyada 100.000 nüfus başına 1.2-25 vaka veya 1000 hastaneye yatış başına 0.19-2.5 civarındadır. Bunların %13'ü, zayıf bağışıklık vb. gibi altta yatan predispozan faktörü olan hastalarda rapor edilmiştir. 10 , 11
Tüm Candida türleri arasında, mantar enfeksiyonları vakalarında en sık görülen etiyolojik ajan Candida albicans'tır ve bu hastalık vakalarının %50'sine varan oranda ilişkilidir. 12 Bu tür, çeşitli yerlerde insan vücudunun bulunduğu ortama kolayca uyum sağlama ve çoğalma kapasitesine sahiptir. İnsan vücudunun farklı dokularında hayatta kalabilme yeteneği, hif formu ile maya formu arasındaki morfolojik geçiş kapasitesi ile ilgilidir. 13 Mayer ve arkadaşlarına göre, hif ve maya enfeksiyon sürecinde yer alır ve daha küçük olan maya yayılabilirken, hif proteinazlar ve fosfolipaz enzimleri yardımıyla epiteli geçerek konakçı dokuyu işgal eder, fagositik hücrelerden kaçar. 14 , 15 , 16 , 17 Candida'nın virülansıyla ilişkili başka bir faktörspp. biyofilm oluşturma, hücre yapışmasını ve biyofilmin hücre dışı matrisinin oluşumunu ve ayrıca daha fazla yapışmasını destekleyen proteinlerin sentezini teşvik etme yeteneğidir. Biyofilm yapısı, hücre dışı matrise penetrasyon zorluğu ve bağışıklık sisteminin etkisi nedeniyle antimikrobiyal ajanlara karşı direnci arttırır, ayrıca akış pompaları olarak antifungallere direnç mekanizmalarının gen ekspresyonunun artmasına izin verir. 18
Birçok bakteri ve mantar türünde olduğu gibi, antimikrobiyal direnç Candida spp. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (CDC), 2012-2016 yılları arasında Candida izolatlarına neden olan tüm sistemik enfeksiyonların yaklaşık %7 ve %1,6'sının birinci sıra antifungal ilaca, flukonazole ve ekinokandinlere direnç gösterdiğini bildirmektedir. 19 Bu nedenle, mevcut antifungal ajanlarla ilişkili toksisitelerin ve ilaç etkileşimlerinin üstesinden gelmenin yanı sıra ortaya çıkan antimikrobiyal direnç geliştirme sorununu etkin bir şekilde ele almak için yeni terapötik seçeneklere ihtiyaç vardır. 20Bitki kaynaklı doğal terapötikler, düşük toksisitesi, kolay erişilebilirliği, maliyet etkinliği ve yüksek terapötik gücü nedeniyle modern dünyanın büyük çoğunluğu arasında daha popüler hale geliyor. 20 Bu yönüyle Cinnamomum verum / Gerçek Tarçın'ın ekonomik ve farmasötik-tıbbi açıdan büyük ilgi gösterdiği gösterilmiştir. 21
Tarçın ağacının çeşitli kısımlarından (kabuk, yaprak, meyve ve çiçek vb.) elde edilen fitokimyasallar, eski çağlardan beri mutfak baharatı ve şifalı bitki olarak kullanılmaktadır. Aynı zamanda birçok eski Asya'da (özellikle Hindistan, Çin ve Sri Lanka'da) terapötik müstahzarlarda bir bileşen olarak kullanılmıştır. 21 Geleneksel halk tıbbında tarçın, antimikrobiyal ve anti-parazitik bir ajan olarak kullanımının yanı sıra göz iltihabı, vajinit, romatizma, nevralji, yara ve diş ağrıları gibi birçok hastalık durumunun tedavisinde kullanılmaktadır. Tarçın ayrıca bronşit, kaşıntı, idrar yolları ve sindirim sistemi ile ilgili hastalıkların tedavisinde de faydalıdır. 22
Birçok rağmen in vitro ile mikrobiyolojik çalışmalar C verum gibi çok sayıda antimikrobiyal direnç sergileyen de dahil olmak üzere sağlık alanında birçok mikrop türleri, ilgili antimikrobiyal aktivite gösterirler Acinetobacter spp., Bacillus spp., Enterobacter spp., Enterococcus faecalis , Escherichia coli , Mycobacterium tuberculosis , Klebsiella pneumoniae ve Haemophilus influenzae vb. 22 Anti- Candida aktivitesi, özellikle Candida spp virülansına etkisi . hala daha az kapsamlıdır.
Bu çalışma, C. verum yaprağı esansiyel yağlarının (EO) Candida spp.'nin ilk yapışması, germ tüpü oluşumu ve biyofilm oluşumu üzerindeki etkisini değerlendirmeyi ve Galleria mellonella larva modeli kullanılarak in-vivo toksisitesini belirlemeyi amaçlamıştır .
Git: MALZEMELER VE YÖNTEMLER
Mantar suşları - Üç Candida tip suşlar, C. albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis (ATCC MYA-646) Piracicaba, Unicamp Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölgesi, Diş Fakültesi elde edilir, Bu çalışmada Brezilya kullanılmıştır. Candida spp'nin standart suşları . stoklar -80ºC'de ultrafreezerde %80 grycerol içinde muhafaza edildi. Stok organizmaları yeniden aktive etmek için, taze hazırlanmış Saboraud Dextrose Agar (SDA, OXOID) kültür ortamında alt kültürlendi, aerobik olarak 37ºC'de 24 saat inkübe edildi.
Standart inoküller 5 x 10 tekabül 0.08-0.10 (600 nm) emme eşdeğerdir McFarland ölçek (0.5), ile uygun olarak bulanıklık ayarlanması ile hazırlanmıştır 6 koloni oluşturan birim (CFU) / ml.
Uçucu yağ - C. verum yapraklarının EO'su, Romik Lanka Marketing Services, Moratuwa, Sri Lanka'dan (WCC/3569) satın alındı. C verum EO 32 mg / mL seyreltilmiş, Tween 80 (% 0.05) çözeltisi ve daha sonra sonifıkasyon ile MOPS [3- (N-morfolino) propan sülfonik asit], 1 döngü ile tamponlanmış Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 20 saniye.
EO'nun kimyasal analizi - C. verum EO'nun kimyasal analizi, HP-6890 (Agilent, ABD) gaz kromatografı ve HP-5975 (Agilent, ABD) seçici kütle dedektörü kullanılarak yapıldı; HP-5MS Kapiler Sütun (30 mx 0,25 mm x 0,25 µm); sıcaklıklar: enjektör (220ºC), dedektör (250ºC), kolon (60ºC), 3ºC/dak, 240ºC; 1.0 mL/dk 18'lik taşıyıcı gazın (yüksek oranda kurutulmuş He) akış hızı . 1.0 uL yağ split modda enjekte edildi ve iyonizasyon kaynağı 70 eV idi. Bileşenlerin bağıl bolluğu aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı. 23
Yüzde bolluğu (%) = (Kromatogramın bileşen alanı/toplam alanı) × 100
Analitleri tanımlamaya yönelik veri tabanı, NIST-11 (Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü) kütle spektral veri tabanı ve NIST kütle spektral arama programıydı (Sürüm 2.0 g).
Minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) belirlenmesi - MIC, modifikasyonlu klinik ve laboratuvar standartları enstitüsü (CLSI) M27-A3 broth mikrodilüsyon yöntemi kullanılarak belirlendi. 24 Kısaca, MOPS ile, RPMI 1640 içinde EO seyreltme 100 uL hazırlanan standart mantar hücresi süspansiyonları, 100 uL (1 x 10 ile karıştırıldı 6 aerobik ve ardından, 96 gözlü bir steril ve düz altlı polistiren mikrotiter plakası içinde hücre / ml) 37ºC'de 24 saat inkübasyon. İnkübasyondan sonra plakalar, büyümenin varlığı ve yokluğu (süspansiyonların bulanıklığı) açısından görsel olarak gözlemlendi. Herhangi bir bulanıklık olmaksızın minimum tedavi konsantrasyonu MİK noktası olarak kabul edildi.
Büyüme kontrolü: EO + standart hücre süspansiyonu yerine 100 µL tamponlu RPMI 1640. Pozitif kontrol: 120 mg/mL klorheksidin diglukonat test edildi.
İlk yapışma etkisi - etkisi C. verum ile yaprağı yağı C. albicans (ATCC MYA-2876), C dubliniensis (ATCC MYA-646) ve C tropicalis , steril polistiren yüzeye (750 ATCC) yapışma kullanılarak incelenmiştir Raut ve diğerleri tarafından daha önce yayınlanmış metodoloji. 25
Sabouraud dekstroz agar (SDA) üzerinde 24 saatlik taze Candida kültürlerinden birkaç koloni, etiketli steril kültür ortamı şişesinde 50 mL YPD broth'a inoküle edildi ve 30 rpm'de (Nova) çalkalayıcı bir inkübatörde 35-37ºC'de 18-24 saat inkübe edildi. Aletler, Brezilya).
İnkübasyondan sonra, hücreler hasat edilmiş ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkandı ve inokülüm 1.0 x 10 'a ayarlanmıştır 7 hücre / ml RPMI Neubauer sayım kullanılarak sonra hücreler 1640 ortamında odası sayma geliştirilmiş. 24
Doksan altı oyuklu steril düz tabanlı mikrotitre plakası bu süspansiyonlarla (100 uL/kuyucuk) tohumlandı ve bir çalkalayıcı inkübatörde (75 rpm, Nova Instruments, Brezilya) 37ºC'de 2 saat boyunca plakaların polistiren yüzeyine yapışmasına izin verildi. 2 mg/mL ila 0.0039 mg/mL (100 µL/kuyu) arasında değişen C. verum yaprağı yağının farklı konsantrasyonlarının varlığı . Yağsız kuyular büyüme kontrolü olarak tutuldu. MOPS+%0.05 Tween 80 ile tamponlanmış RPMI, negatif kontrol kuyularına ilave edildi. Pozitif kontrol olarak MOPS (Sigma-Aldrich, ABD) ile tamponlanmış RPMI 1640 içinde 120 mg/mL klorheksidin diglukonat kullanıldı.
2 saatlik inkübasyondan sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için kuyucuklar 200 uL steril normal salin ile yıkandı. Her bir oyuğa bağlı hücreler, XTT metabolik tahlili kullanılarak ölçülmüştür. Kısaca 80 μL XTT [2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenol)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide, Sigma-Aldrich] ve menadion (Sigma-Aldrich) solüsyonu (4 μL) Her kuyucuğa 10 mL XTT içinde menadion eklendi ve plakalar ışıktan korumak için bir parça alüminyum kağıt ile kaplandı ve 2 saat 37 ºC'de inkübe edildi . Daha sonra elde edilen çözeltinin absorbansı 490 nm'de mikrotitre plaka okuyucu /Versa MAX, moleküler Cihazlar, ABD. 26
Yapıştırılan hücrelerin yüzde azalması, test gruplarının ve negatif kontrol grubunun ortalama XTT aktivitesinin karşılaştırılmasıyla hesaplandı. 24
Germ tüpü oluşumu üzerindeki etki - Blastoconidia'dan germ tüplerinin oluşumu, gerçek hiflerin gelişiminde ilk adımdır ve morfolojik formlar arasında geçiş yapma yeteneği, potansiyel bir virülans faktörü olarak öne sürülmüştür. Tek hücreli blastokonidyal formla karşılaştırıldığında, hiflerin konak dokulara yapışma ve bu dokulara nüfuz etme yeteneği daha yüksektir.
Hammer ve diğerleri tarafından açıklanan bir deney. 27 , C. verum yaprak yağının blastoconidia'dan C. albicans (ATCC MYA-2876) ve C. dubliniensis (ATCC MYA-646) hifasına morfolojik geçişi (germ tüpü/hifal oluşumu) üzerindeki etkilerini incelemek için yapılmıştır .
C. verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonatın üç konsantrasyonu (1/4 MIC, 1/2 MIC ve MIC) steril cam Bijou şişelerinde 1 mL hacimlerde fetal sığır serumu (FBS) (Sigma-Aldrich) içinde iki katı dozda hazırlandı. istenen nihai konsantrasyon şu şekildedir: 0.25, 0.5, 1.0 ve 0 mg/mL.
Maya özütü-pepton-dekstroz (YPD) ortamında önceden açıklandığı gibi hazırlanan hücre süspansiyonlarının eşit hacimleri (1 mL) her C. verum yaprağı yağı muamelesine ilave edildi ve iyice karıştırıldı. Tüm tedaviler daha sonra aerobik olarak 37ºC'de çalkalanmadan inkübe edildi ve iyice karıştırıldıktan sonra 0 saat, 2 saat, 4 saat ve 6 saatte örneklendi.
Hazırlanan süspansiyonlardan 10 μL'lik Neubauer geliştirilmiş sayım odasına her zaman noktasında yüklendi ve 500 Candida hücresindeki çimlenen hücre sayısı (germ tüplü hücreler) sayıldı ve çimlenen hücre sayısına bölünerek germ tüp oluşum yüzdesi hesaplandı. beşe kadar.
(EO) varlığında biyofilm gelişimi üzerindeki etki - Her organizmanın 100 μL standart inokulumu 96 kuyucuklu steril düz tabanlı bir mikroplaka plakasına aşılandı, ardından çalkalama altında 120 dakika aerobik inkübasyon (37ºC'de 75 rpm)( Nova Aletler, Brezilya). Plaka daha sonra bir kez steril PBS ile yıkandı ve her bir uçucu yağ seyreltisinden 100 µL tedavi kuyularına ayrı ayrı ilave edildi. Büyüme kontrol kuyularına MOPS ile tamponlanmış 100 µL RPMI 1640 ve negatif kontrol kuyularına yağ yerine %0.05 Tween 80 ile tamponlanmış RPMI 1640 ilave edildi. 28 Klorheksidin diglukonat pozitif kontrol olarak kullanıldı. Plaka daha sonra aerobik olarak 37ºC'de 24 saat inkübe edildi.
Biyofilm biyokütlesi, daha önce açıklanan XTT metabolik tahlili kullanılarak 24 saatlik inkübasyondan sonra ölçülmüştür.
Biyofilm oluşturmak için minimum toksik konsantrasyon (MTC) - MTC , Candida spp. oluşturan biyofilmleri öldürmek için gereken C. verum yaprağı yağının minimum konsantrasyonunu belirler . tamamen. Biyofilm oluşturan yağın MTC'sini saptamak için CFU tahlili kullanıldı. Farklı konsantrasyonlarda C. verum yaprağı yağı ile 24 saatlik muameleden sonra, yapışan biyofilmin kütlesi steril bir hücre kazıyıcı kullanılarak kazındı ve 100 µL steril normal salin içinde tamamen homojenleştirildi ve daha sonra süspansiyon seri olarak seyreltildi (10 -1 ila 10 -6). Daha sonra, 100 uL'lik bir alikuot, SDA ortamı üzerine kaplanmıştır. Agar plakaları 37ºC'de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra koloni oluşturan birimler sayıldı ve sonuçlar CFU/mL olarak ifade edildi. 29
C. verum yaprak yağı varlığında biyofilm oluşturmanın taramalı elektron mikroskobu (SEM) - Farklı konsantrasyonlarda C. verum yağı varlığında oluşturulan biyofilmlerin ultra yapısal özellikleri SEM kullanılarak değerlendirildi. 24
Steril kapak slipleri ayrı olarak 12 oyuklu hücre kültürü kümesine yerleştirildi. Kapak slipleri, 1 ml standart hücre süspansiyonu (1 x 10 daldırıldı 7 muntazam sağlamak için hücre / mL) , Candida yapışma ve bir sallanan kuluçka makinesi (Nova Instruments, Brezilya) içinde 37 ° C'de 120 dakika inkübe edildi. Daha sonra lameller steril bir forseps kullanılarak dikkatlice hareket ettirildi ve 0,5 mg/mL, 1,0 mg/mL ve 2 mg/mL C. verum içeren yeni 12 oyuklu plakaya nazikçe daldırıldıRPMI 1640 (1 mL/kuyu) içinde yağ. Lameller aerobik olarak 37ºC'de 24 saat inkübe edildi. 24 saatlik inkübasyondan sonra, EO seyreltmelerinin mevcudiyetinde oluşturulmuş biyofilmlere sahip lameller daha sonra steril PBS ile üç kez yıkandı. Daha sonra 4ºC'de %2,5 glutaraldehit içeren yeni bir 24 oyuklu hücre kültürü kümesine aktarıldılar. 60 dakika glutraldehit ile sabitlendikten sonra, numuneler bir dizi etanol solüsyonunda (10 dakika için %70, 10 dakika için %80, 10 dakika için %95 ve mutlak etanol içinde 10 dakika) dehidre edildi ve bir gece boyunca havada kurutuldu. altın ile püskürtme kaplamadan önce inkübatör. Klorheksidin diglukonat (0.25 mg/mL ve 0.125 mg/mL) ve Flukonazol (0.008 mg/mL), maruziyet sonrası biyofilm mimarisini yaygın antifungaller ve C. verum yaprak yağı tedavisi ile karşılaştırmak için pozitif kontroller olarak kullanıldı .
Biyofilm ilerleme analizi (Zaman Atlamalı Mikroskop) - C. verum yaprak yağı varlığında Candida in vitro biyofilmlerinin ilerlemesi Zaman Atlamalı Mikroskop kullanılarak değerlendirildi. C. verum yaprak yağı varlığında biyofilm ilerlemesinin analizi için , C. albicans (ATCC MYA-2876); C dubliniensis (ATCC MYA-646) ve C tropicalis (ATCC 750), 24 kuyulu hücre kültürü kümesinin polistiren yüzeyi üzerine yapıştırılmış ve üç konsantrasyonda (0.5 mg / mL, 1.0 mg / mL ve 2.0 mg ile tedavi edilmiştir / mL) C. verumDaha önce açıklandığı gibi yaprak yağı. Tedaviyi ekledikten sonra 37ºC'de 24 saatlik inkübasyon sırasında, biyofilm oluşturma görüntüleri 0, 4 saat, 8 saat, 12 saat, 16 saat, 20 saat ve 24 saat zaman atlamalı mikroskop 24 (ZEISS ApoTome.2) kullanılarak yakalandı. ).
C. verum uçucu yağının G. mellonella larvaları üzerindeki in-vivo toksisitesi - İn-vivo toksisite deneyi, daha önce Wijesinghe (2019) tarafından tarif edildiği gibi G. mellonella larvaları üzerinde gerçekleştirilmiştir . 24 Çalışma grubu ve kontrol grubu (n = 10) larvaları (RJ Mous Livebait, Hollanda) seçildi ve seçilen larvalar bir Petri kabında (10/petri kabı) tutuldu. Vücutlarında koyu pigmentasyonlar veya belirgin melanizasyon dahil olmak üzere renk değişiklikleri olan larvalar ve 0,2-0,3 g vücut ağırlığının dışındaki larvalar hariç tutulmuştur. C. verum yaprağının EO dilüsyonları steril PBS içinde hazırlandı (Konsantrasyonlar 0,5 ila 1000 mg/mL arasında değişiyordu).
On (10) uL EO dilüsyonu, 1 mL'lik bir şırınga kullanılarak larvaların son sol ön bacağından hemosele enjekte edildi. EO uygulanmadan önce prick alanı %70 etanol ile dekontamine edildi. Larva içeren tabaklar daha sonra bir kapakla kapatıldı ve 37ºC'de aerobik inkübatörde tutuldu. Negatif kontrol grubuna (n=10) %0.05 Tween 80 ile 10 µL Steril PBS uygulandı.
Larvaların canlılığı, vücut görünümünün (kahverengi-koyu kahverengi renk) görsel olarak incelenmesi ve vücut hareketinin olmaması ile izlendi. Deney iki kez tekrarlandı.
İstatistiksel analiz - İstatistiksel analiz, Statistical Package for Social Sciences (SPSS) sürüm 16 kullanılarak gerçekleştirildi. Üçten fazla veri setinin çoklu ortalamaları, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve iki yönlü ANOVA kullanılarak karşılaştırıldı. Anlamlılık düzeyi %5 olarak alınmıştır (p < 0.05).
Git: SONUÇLAR
Kimyasal bileşim - Tanımlanmış ve karakterize edilmiş kimyasal bileşenler ve bunların göreceli bolluğu,Tablo I. En bol bulunan aktif bileşik Eugenol'dür (%77.22). Benzil benzoat (%4,53), Trans caryophyllene (%3.39), Asetil öjenol (%2.75) ve Linalool (%2.11), spektrumlar (NIST) arasında >%95 benzerlik ile küçük bileşenler olarak bulundu (Tablo I). TABLO I
Gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) ile tespit edilen Cinnamomum verum yaprağı esansiyel yağının (EO) kimyasal bileşenleri ve nispi bolluğu
mikrofon -Tablo IIC. verum EO ve pozitif kontrol klorheksidin diglukonata karşılık gelen MIC değerlerini temsil eder . Hem C. verum hem de klorheksidin diglukonat, planktonik C. albicans (ATCC MYA-2876) ve C. dubliniensis (ATCC MYA-646) üzerinde benzer bir etkinlik sergiledi . C tropikalis (ATCC 750), C. verum yaprak yağına kıyasla klorheksidin diglukonat için daha duyarlıydı . TABLO II
Candida spp'nin minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) . Deney, üç ayrı deney ile üç kopya halinde yapıldı. Pozitif kontrol olarak klorheksidin diglukonat kullanıldı
İlk yapışma üzerindeki etki - C. verum yaprağı yağının Candida'nın polistiren yüzeylere yapışması üzerindeki etkisini belirlemek için mikrotitre plaka XTT yönteminin sonuçları şu şekilde gösterilmiştir:1.
1:
XTT metabolik aktivitesi azalma yüzdesi Candida albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis farklı konsantrasyonlarının varlığında (ATCC MYA-646) tarçın verum (CV) yaprağı yağı ve klorheksidin diglükonat (CHL). Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder.
Elde edilen verilere göre, C. verum yaprak yağı, negatif kontrole kıyasla tüm test suşlarının polistiren yüzeye yapışmasını etkili bir şekilde azaltır. C. albicans , 1.0 mg/mL konsantrasyonla yapışmada %50 azalma sağlarken, C. tropikalis ve C. dubliniensis , sırasıyla > 2.0 mg/mL ve 0.34 mg/mL yağ konsantrasyonları ile yapışmada %50 azalma göstermiştir. Klorheksidin diglükonat yapışma% 50 azalma sergilemiştir C. albicans , C. tropicalis ve C dubliniensis'in sırasıyla 1.06 mg / mL, 0.72 mg / ml ve 1.32 mg / ml konsantrasyonlar ile (Tablo III). TABLO III
Minimum konsantrasyonları tarçın verum yaprak uçucu yağ (EO) ve klorheksidin diglükonat (CHL) yapışmasını azaltmak için gerekli olan Candida albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis ile (ATCC MYA-646) %50
C. verum yaprağı yağının germ tüpü oluşumuna etkisi -İncir. 26 saatlik deney süresi boyunca 0.25, 0.5 ve 1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonat varlığında germ tüpü oluşturan hücrelerin yüzdesini gösterir .
İncir. 2:
(A) Candida albicans (ATCC MYA-2876) ve (B) C. dubliniensis (ATCC MYA-646)'nın 0.25, 0.5 ve 1.0 mg/mL Cinnamomum verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonat ile 6 saatlik test süresi içinde mikrop tüpü oluşum yüzdesi 2 saat aralıklarla. 0 mg/mL konsantrasyon, negatif kontrolü gösterir. Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder.
Elde edilen verilere göre, hem C. verum yaprak yağı hem de klorheksidin diglukonat, test edilen tüm konsantrasyonlarda C. albicans ve C. dubliniensis'in germ tüpü oluşumunu önemli ölçüde azalttı (p < 0.05). 1.0 mg/mL (MIC) konsantrasyonunda hem C. verum yaprağı yağı hem de klorheksidin diglukonat , deney süresi (6 saat) boyunca her iki Candida türünün germ tüpü oluşumunu tamamen engelledi .
Biyofilm oluşturmanın minimum biyofilm önleyici konsantrasyonu - Bu deneyde, biyofilm oluşumunu %50 (negatif kontrole kıyasla) engellemek için gereken minimum C. verum yaprağı yağı konsantrasyonu belirlendi. Uçucu yağ varlığında oluşan biyofilmlerin biyokütlesi/canlılığı, XTT canlılık tahlili kullanılarak belirlendi.Şekil 3 negatif kontrole kıyasla biyofilm oluşturmanın XTT metabolik aktivitesinin yüzde azalmasını gösterdi.
Şekil 3:
XTT metabolik aktivitesi azalma yüzdesi Candida albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis (ATCC MYA-646), farklı konsantrasyonlarda varlığı ile oluşturan biyofilm tarçın verum (CV) yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonat (CHL). Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder. Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder.
Elde edilen verilere göre biyofilm oluşumunu %50 azaltmak için gereken konsantrasyonlar aşağıdaki gibidir (Tablo IV). TABLO IV
En az biyofilm inhibe edici konsantrasyonlar (MBIC 50 arasında biyofilm oluşturulması için) Candida albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis (ATCC MYA-646)
CHL: klorheksidin diglukonat.
MTC - Candida hücrelerini öldürerek biyofilm oluşumunu tamamen önlemek için gereken minimum C. verum yaprağı yağı konsantrasyonu, CFU testi kullanılarak belirlendi.4farklı konsantrasyonlarda C. verum yaprağı yağı ve CFU testi ile belirlenen klorheksidin diglukonatın mevcudiyeti ile biyofilm oluşturma canlılığını temsil eder .Tablo V test suşlarının biyofilm oluşumunu tamamen önlemek için gereken minimum tedavi konsantrasyonunu temsil eder.
4:
varlığında Candida albicans (CA) (ATCC MYA-2876), C. tropikalis (CT) (ATCC 750) ve C. dubliniensis (CD) (ATCC MYA-646) biyofilmlerinin log koloni oluşturan birim (CFU) değerleri . (A) Cinnamomum verum (CV) yaprak yağı ve (B) klorheksidin diglukonat (CHL)'nin farklı konsantrasyonları . Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder. TABLO V
Candida albicans (ATCC MYA-2876), C. tropikalis (ATCC 750) ve C. dubliniensis'in (ATCC MYA-646) oluşturan biyofilmlerini (MTC) tamamen öldüren Cinnamomum verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonat konsantrasyonları
1.0 mg / mL C verum , tüm test suşlarının oluşturulması biyofilm öldürmek C. albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis (ATCC MYA-646). Klorheksidin diglukonat , C. verum yaprak yağına kıyasla düşük konsantrasyonlarda Candida türlerinin biyofilm oluşturmasını öldürür . İçin , C. albicans , klorheksidin diglükonat ile öldürme konsantrasyonu 0.25 mg / ml (dört kez düşük bu değere göre konsantrasyon C. verum yaprağı yağı) ile ve C. tropicalis ve C dubliniensis'in , öldürme konsantrasyonu 0.125 mg / ml ( Bu değere kıyasla sekiz kat daha az konsantrasyonC.verum ).
Biyofilm oluşturmanın SEM'i - 0.5, 1.0 ve 2.0 mg/mL C. varlığında C. albicans (ATCC MYA-2876), C. tropikalis (ATCC 750) ve C. dubliniensis (ATCC MYA-646) biyofilm oluşturma üst yapısı . verum yaprağı yağı, klorheksidin diglukonat ve Flukonazol, SEM tarafından kalitatif olarak değerlendirildi (Şekil 5, ,6,6, ,77).
Ayrı bir pencerede aç
Şekil 5:
0.5 mg/mL Cinnamomum verum yaprağı yağı (A ve D), 1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı (B ve E) varlığında biyofilm oluşturan Candida albicans'ın (ATCC MYA-2876) taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri , 2 mg/mL C. verum yaprağı yağı (C ve F), 0,25 mg/mL klorheksidin diglukonat (G ve J) ve 0,008 mg/mL Flukonazol (H ve K). I ve L: negatif kontrol. Kırmızı daireler: tedavilerle hücre duvarı deformiteleri.
Ayrı bir pencerede aç
Şekil 6:
0.5 mg/mL Cinnamomum verum yaprağı yağı (A ve D), 1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı (B ve E), 2.0 varlığında biyofilm oluşturan Candida tropikalis'in (ATCC 750) taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri mg/mL C. verum yaprağı yağı (C ve F), 0.125 mg/mL klorheksidin diglukonat (G ve J) ve 0.008 mg/mL Flukonazol (H ve K) I ve L: negatif kontrol. Kırmızı daire: tedavilerle hücre duvarı deformiteleri. Kırmızı düz ok: hücre içi bileşenlerin sızıntıları.
Ayrı bir pencerede aç
7:
0.5 mg/mL Cinnamomum verum yaprağı yağı (A ve D), 1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı (B ve E) varlığında biyofilm oluşturan Candida dubliniensis'in (ATCC MYA-646) taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri , 2mg/mL C. verum yaprağı yağı (C ve F), 0.125 mg/mL klorheksidin diglukonat (G ve J) ve 0.008 mg/mL Flukonazol (H ve K) I ve L: negatif kontrol. Kırmızı daire: tedavilerle hücre duvarı deformiteleri.
Cinnamomum verum yaprağı yağı , hücre duvarına zarar vererek Candida hücresinin büzülmesine ve hücre içi materyallerin sızmasına neden olur. Bu etkiler konsantrasyona bağlıdır. 2 mg/mL C. verum yaprağı yağı ile maksimum hücre hasarı gözlendi . Ve C. verum yaprağı yağı, biyofilm gelişimini ve biyofilm hücre yoğunluğunu azaltmıştır.
Zaman atlamalı mikroskop kullanılarak biyofilm ilerleme analizi -Şekil 8AC, C. albicans'ın (ATCC MYA-2876) oluşan biyofilmlerinin zaman atlamalı mikroskobik görüntülerini gösterir ; C dubliniensis (ATCC MYA-646) ve C tropicalis uçucu yağ tedavisiz (ATCC 750), 0.5 mg / mL, 1.0 mg / ml ve 2.0 mg / ml C. verum 24 saat bir süre için yaprağı yağı tedavisi.
Ayrı bir pencerede aç
8:
(A) Candida albicans'ın (ATCC MYA-2876) gelişen biyofilmlerinin Zaman Atlamalı görüntüleri . Her sütun, Cinnamomum verum yaprağı yağı tedavisinin konsantrasyonunu temsil eder . (B) biyofilm geliştirme zaman ihmaller görüntü C. tropicalis (ATCC 750). Her sütun, C. verum yaprağı yağı muamelesinin konsantrasyonunu temsil eder . (C) C. dubliniensis'in (ATCC MYA-646) gelişen biyofilmlerinin Zaman Atlamalı görüntüleri . Her sütun, C. verum yaprağı yağı muamelesinin konsantrasyonunu temsil eder .
İşlenmemiş (negatif) kontrol biyofilminin ilerlemesi, gözlem süresi boyunca aşırı biyofilm gelişimini gösterir. 0,5 mg/mL C. verum yaprağı konsantrasyonu Candida spp.'nin biyofilm gelişiminin gecikmesine neden olmuştur . 1.0 mg / ml ve 2.0 mg / ml C. verum yaprağı yağı tamamen inhibe C tropicalis ve C dubliniensis hücresi proliferasyonu ve 0 h biyofilm gelişimi.
1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı ile C. albicans , 8 saate kadar hafif hücre proliferasyonu sergilerken, 2.0 mg/mL biyofilm gelişimini tamamen inhibe etti.
İn-vivo C. verum yaprağı yağı (G. mellonella larvaları) toksisitesi - in vivo toksikliği C verum yaprak EO ile değerlendirildi in vivo G. Mellonella EO farklı konsantrasyonları ile işlemden sonra larva modeli. Muamele edilen larvaların %100 hayatta kaldığı, test edilen tüm konsantrasyonlarda (0.5, 1.0, 2.0, 16.0, 32.0, 64.0, 128.0, 250.0, 500.0, 1000.0 mg/mL) gözlemlendi, bu da tüm deney süresi boyunca (5 gün) deneysel modelde C. verum yaprağı EO toksisitesi (Şekil 9).
Şekil 9:
Beş günlük deney süresi boyunca Cinnamomum verum yaprağı yağının uygulanmasından sonra Galleria mellonella larvalarının hayatta kalma oranı . Larvalara steril fosfat tamponlu salin (PBS) uygulanarak kontrol eğrisi elde edildi.
Git: TARTIŞMA
Candida spp. konakçı dokularda başarılı bir şekilde kolonize olmaya katkıda bulunan birçok virülent faktör gösterir. Konak yüzeylere yapışma (biyofilm oluşumunun ilk basamağı), germ tüpü oluşumu, biyofilm oluşumu, proteinazların ve diğer hidrolitik enzimlerin salgılanması ve aldehit üretimi bunlardan bazılarıdır. 30 Fitomedikal terapötikler, antimikrobiyal direncin yüksek oranda ortaya çıkması ve mikrobiyal patojenlerin artan virülansı nedeniyle modern dünyada daha popüler hale geliyor. 21 Öte yandan, kolay erişim, konakçı için toksisite olmaması, yüksek etkinlik ve maliyet etkinliği, antimikrobiyal doğal ürünlerin terapötik alternatifler olarak yaygın şekilde kullanılmasına katkıda bulunur. 21 Bu çalışma, bu tür bitki kaynaklı antimikrobiyal ajan C. verum yaprak EO'nun en yaygın insan mantar patojeni Candida spp.'nin virülans mekanizmalarını kontrol etme üzerindeki etkinliğini değerlendirmek için yapılmıştır . Ayrıca in-vivo laboratuvar deney modeli olan G. melonella larvaları üzerindeki toksisite de değerlendirilmiştir.
Konak yüzeylere veya abiyotik yüzeylere yapışma, mikrobiyal patojenlerin kolonizasyonunun ilk adımıdır. EO, 1.0 mg / mL konsantrasyonda yapışmasını düşük C. albicans ,> 2.0 mg / ml ve 0.34 mg / petrol ml konsantrasyonları düşük ise,% 50 C tropicalis ve C. dubliniensis sırasıyla% 50 yapışma. Referans mantar karşıtı klorheksidin diglükonat sergilenen yapışma azalma% 50 C. albicans , C. tropicalis ve C dubliniensis'in 1.06 mg / mL, 0.72 mg / mL ve 1.32 mg / mL konsantrasyonlar mevcut olabilir. Daha da önemlisi, daha düşük konsantrasyonlarda C. albicans ve C. dubliniensis'in yapışmasında %50 azalma sağlanmıştır.C. verum yaprak yağı, klorheksidin diglukonat kontrolüne kıyasla bu iki suşun yapışmasını önlemede C. verum EO'nun daha yüksek etkinliğini gösterir . Elde edilen verilere göre, 2.0 mg/mL klorheksidin diglukonat, tüm test suşlarının yapışmasını tamamen inhibe eder, ancak gözlem, test süresi (2 saat) sırasında organizmaların tamamen öldürülmesine bağlı olabilir. Konak yüzeylere yapışma, biyofilm oluşumunun ana virülans faktörlerinden ve ilk adımlarından biri olduğundan, C. verum EO'nun Candida spp. üzerindeki yapışma önleyici özellikleri . bir antimikrobiyal ajan olarak uygunluğuna katkıda bulunur.
Germ tüpü oluşumu, C. albicans ve C. dubliniensis'in konakçı dokuları istila ederek besinlerin emilimini sağlayan bir diğer önemli virülent faktördür . Etkisi C VERUM alt MIC (0.25 ve 0.5 mg / ml), her ikisi de C. verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglükonat miktarı hem mikrop tüp oluşumunu azaltmak C. albicans ve C dubliniensis'in MIC (1.0 mg / ml), oysa test suşlarının germ tüpü oluşumunu tamamen inhibe eder. Zamanla ( C. albicans için , 2 saat sonra ve C. dubliniensis için, 4 saat sonra) üretilen germ tüpleri yalancı hif ve hifaya dönüştüğü için kontrol grubu dahil tüm gruplarda germ tüpü oluşumu kademeli olarak azaldı. C. verum yaprağı EO'nun Candida spp.'nin adezyonu ve germ tüpü oluşumu üzerindeki etkisine dair yayınlanmış hiçbir bilimsel kanıt bulunmamaktadır . Mevcut çalışma, Tarçın yaprağı yağının Candida spp'nin öldürücü faktörlerini kontrol etme üzerindeki etkinliğini bulmak için tasarlanmıştır . mevcut verilerin bu boşluğunu doldurmak için. Yapışma ve germ tüpü oluşumu, Candida'nın enfeksiyona neden olma yeteneğinin temel özellikleridir ve bu nedenle, bu faktörlere müdahale eden antimikrobiyal maddeler, potansiyel anti- Candida ajanları olarak kabul edilir . Bu nedenle C. verumyaprak EO, Candida enfeksiyonlarına karşı terapötik bir alternatif olarak geliştirilebilir .
Biyofilm, hücrelerden ve çevreden türetilen hücre dışı bir matrise gömülü yüzeye bağlı mikrobiyal topluluklardır. 21 Biyofilmler, bu dış stresleri nötralize etmek için çeşitli mekanizmalar sergilediklerinden, biyofilmler planktonik muadillerine kıyasla fiziksel ve kimyasal streslere karşı daha dirençlidir. Hücre dışı biyofilm matrisi, antimikrobiyal ajanların biyofilme difüzyonu için fiziksel veya kimyasal bir bariyer görevi görür. Ayrıca, besinlerin sınırlı mevcudiyeti ile biyofilm topluluğu, üstel büyümeden yavaş büyüme veya hiç büyüme durumuna doğru kayar. Yukarıdaki faktörlerin tümü ve bir biyofilm fenotipinin uyarılması ve çekirdek algılama, bir biyofilmin antimikrobiyal ajanlarına karşı yüksek dirence katkıda bulunur. 31 , 32 Biyofilmlerin mevcut antimikrobiyal stratejilere direnci giderek yaygınlaştığından, özellikle patojenin virülansını etkin bir şekilde kontrol ederek yeni, toksik olmayan, ucuz ve etkili tedavi seçenekleri icat etmek için daha fazla çalışma yapılmalıdır. Mevcut çalışmada, potansiyel bir fitomedikal ajan olarak C. verum yaprağı EO'nun etkinliği, Candida biyofilmlerinin oluşturulmasında değerlendirilmiştir . C. verum EO, C. albicans (ATCC MYA-2876), C. tropikalis (ATCC 750) ve C. dubliniensis'in biyofilmlerinin oluşumunda potansiyel bir antibiyofilm etkisi sergiledi .(ATCC MYA-646) test suşları. Biyofilm gelişimini %50 azaltmak için gereken konsantrasyonlar (negatif kontrol ile karşılaştırıldığında), üç test suşu için sırasıyla 0.15, 0.35 ve 0.2 mg/mL idi. Ve MTC (biyofilm gelişimini tamamen durdurmak için gereken EO konsantrasyonları) tüm test suşları için 1.0 mg/mL idi. Önemli olarak, bu MTC değerleri, biyofilmlerin planktonik muadilinden daha dirençli mikrobiyal topluluklar olarak kabul edilmesine rağmen , C. verum EO'nun biyofilm oluşturmanın yüksek öldürme potansiyelini gösteren test suşlarının MIC ve MFC değerlerinden düşüktür. Bu veriler, C. verum yağının, Candida biyofilmlerinin normal oluşum sürecini kesintiye uğratma üzerindeki potansiyel etkisini göstermektedir .
C. verum yaprak yağının kimyasal stresi altında biyofilm ilerlemesi hızlandırılmış mikroskopla görüntülendi ve bu deneyden elde edilen sonuçlar yukarıdaki gözlemi doğruluyor. 2 x MTC (2 mg/mL) C. verum EO, 0. saatten itibaren tüm test suşlarının biyofilm gelişimini tamamen inhibe ederken, 0. saatten itibaren MTC (1 mg/mL) ile ilerleyen C. albicans'ta hafif hücresel proliferasyon ve biyofilm gelişimi gözlemlendi. 8 saate kadar. 8 saat sonra, biyofilm geliştiren C. albicans'ta görünür bir biyofilm gelişimi kaydedilmedi . C. tropikalis ve C. dubliniensis biyofilm gelişimi, MTC tarafından 0. saatte tamamen inhibe edilmiştir. Sub-MTC (0,5 mg/mL), test edilen tüm biyofilm gelişiminin gecikmesine neden olurCandida suşları. Bu sonuçlar, biyofilm önleyici bir strateji olarak C. verum yaprak EO'nun olası etkin kullanımını göstermektedir . Ayrıca, SEM ve zaman atlamalı mikroskopiden elde edilen veriler, EO'nun Candida biyofilminin ilerlemesi üzerindeki etkisinin doza bağımlı olduğunu ortaya koymaktadır .
C. verum yaprak EO varlığı ile geliştirilen Candida biyofilmlerinin yapısını anlamak için SEM görüntüleri alınmıştır . Test suşlarının tüm biyofilmleri, tarçın yaprağı yağı tedavisi ile azaltılmış hücre yoğunluğu, hücre duvarı hasarları, hücre duvarı deformiteleri ve hücre içi materyal sızıntıları sergiledi. Daha da önemlisi, SEM görüntüleri, C. verum yaprağı esansiyel yağının etkilerinin doza bağımlı doğasını doğrulamaktadır . Flukonazol, azol grubuna ait bilinen bir antifungal ajandır ve lanosterolün ergosterole dönüşmesini engelleyerek fungal sterol, ergosterol sentezini engeller. 33 Öte yandan klorheksidin diglukonat, antibakteriyel ağız gargarası olarak kullanılan bir biguaniddir. Morfoloji hücrelerini değiştirir ve mikroorganizmaların hücre duvarına zarar verir ve hücre içi bileşenleri serbest bırakır. Oral kandidiyaz için iyi bilinen bir terapötik antifungal ajan olarak önerilmiştir. 34 , 35 , her iki antimikrobik maddelerin yana üzerinde bir etkiye sahip Candida hücre duvarı oluşturan ince yapısı , Candida ile biyofilm 0.25 mg / ml klorheksidin diglükonat için ( C. albicans ), 0.125 mg / ml klorheksidin diglükonat için ( C. tropicalis ve C dubliniensis'in ) ve 0,008 mg/mL Flukonazol ( in vitro olarak önerilen maksimumtahlil konsantrasyonu, CLSI) de görselleştirildi. Benzer gözlemler, klorheksidin diglukonat ve 0.008 mg/mL Flukonazolün MTC'sine maruz bırakıldığında elde edilmiştir. Flukonazolün maruziyet sonrası tepkisinin yoğunluğu, düşük konsantrasyon nedeniyle minimal olmuştur.
Klorheksidin diglukonat düşünüldüğünde, C. verum yaprak yağı ile benzer etki göstermiştir ( Candida hücrelerinin hücre duvarlarına zarar verir ve sitoplazmik sızıntılara neden olur). Bundan başka, SEM gözlemlerine göre, klorheksidin diglükonat psödo hifler oluşumu azalmıştır C. tropicalis , negatif kontrol ile karşılaştırıldığında. SEM kullanılarak analiz edilen biyofilmlerin hiçbirinde biyofilmlerin karakteristiği olan ekstraselüler polimerik matris gözlenmemiştir, çünkü ön işlemler ve ekipmanın elektron ışını matris tahribatına neden olabilir.
C. verum yağının Candida biyofilm oluşumu üzerindeki etkisi iyi çalışılmamış olsa da, çeşitli bilim adamları tarafından Tarçın yağının farklı bakteri türlerinin virülansı ve biyofilm tükenmesi üzerindeki etkinliğini değerlendirmek için birkaç çalışma yapılmıştır. Kalia et al. 2015 yılında 36 , biyofilm oluşumunun inhibisyonunu ve proteolitik enzim üretimi ve kümelenme aktivitesi gibi diğer çekirdek algılama (QS) ile ilişkili virülans faktörlerini ve etkili biyofilm azaltma ve QS üzerindeki antagonist etkiyi ölçerek tarçın yağının Pseudomonas aeruginosa'ya karşı anti-nispeten algılama aktivitesini inceledi. . Ayrıca, 2019'da Erfan ve Marouf, solunum yolu bakteriyel patojenlerinin ( Staphylococcus aureus) virülans genlerinin aşağı regülasyonunu gözlemledi., E. coli , Avibacterium paragallinarum ve Pasteurella multocida vb.) tarçın yağı ile. Antibiyotiğe dirençli bakteriyel enfeksiyonların kontrolü için rutin antibiyotikler yerine tarçın yağının olası kullanımını önerdiler. 37 Zhang ve ark. 2020 ve Kim ve ark. 2014'te 38 , 39 , C. verum kabuğu yağının mikrobiyal toksinlerin inhibisyonu, biyofilm gelişimini kesintiye uğratması ve patojenik bakteri türlerinin çekirdek algılaması dahil olmak üzere birkaç anti-virülans mekanizması tanımladı . Ancak C. verum yaprağı yağının mantar öldürücülüğü üzerindeki anti-virülans özellikleri geniş çapta çalışılmamıştır.
Yeni bir bitkisel terapötik maddenin icadı söz konusu olduğunda, klinik uygulamasından önce doğal bir ürünün toksikolojik değerlendirmesi önemli bir husustur. Mevcut çalışma , G. mellonella deney modelini kullanarak C. verum EO'nun in-vivo toksisitesini belirlemektedir . 0,5 ila 1000 mg/mL EO arasında değişen tüm test konsantrasyonları ile G. mellonella larvaları ile %100 hayatta kalma gözlemlendi . Bu , deney modelinde C. verum yaprağı yağının toksik olmadığını gösterir . 1000 mg/mL, C. verum yaprağı EO'nun saf konsantrasyonu (seyreltilmemiş) olduğundan, saf çözelti dahil tüm seyreltmeler toksik olmayan olarak kabul edilebilir. Her ne kadar önceki in-vivoHayvan modellerinde ilgili yapılan çalışmalarda, tarçın kabuğu yağı konsantrasyonu önemli ölçüde yüksek bir terapötik aralık olan önemli bir toksisite eksikliği sermiştir 22 in vivo laboratuar hayvan modelleri üzerinde tarçın yaprağı yağı toksikliği çalışılmamıştır.
C. verum yaprağı EO'nun kimyasal analizinin sonuçları, öjenolün en bol kimyasal bileşeni olduğunu (%77.22), diğer kimyasal bileşiklerin daha küçük konsantrasyonlarda ortaya çıktığını gösteren önceki çalışmaların bulgularıyla uyumludur. 40
Kandidiyaz ile ilişkili yüksek oluşum ve ölüm oranları, kandidiyazis tedavisinde yeni terapötik yaklaşımların getirilmesinin acil gerekliliğini vurgulamaktadır. Birden fazla araştırma grubu tarafından yürütülen çeşitli çalışmalar, kandidiyazın patogenezi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır, 15 , 41 ve bu bilgi, bulgularının Candida ve diğer enfeksiyonlardan muzdarip hastalara doğrudan fayda sağlayabilecek tedavi stratejilerine dönüştürülmesi için bir başlangıç noktası oluşturmalıdır . Bunlar arasında daha etkili ve en erken seçenek, Candida enfeksiyonlarının kontrolü ve tedavisi için yeni anti-virülans yaklaşımlarının icadıdır . 42 Germ tüpü oluşumu, konak yüzeylere yapışma ve biyofilm oluşumu kandidiyazis sırasında başlıca virülans faktörlerini oluşturduğundan, bunlar, bu tür alternatif anti-virülans stratejilerinin yeniliği için klinik olarak kullanılmamış bir hedefi temsil eder. Bu çalışmada, doğal bir ürün olan C. verum yaprağı EO'nun toksik olmayan, Candida spp. Her iki kullanılarak belirlenmiştir in vitro ve in vivo deney serisi.
Bir dizi in vitro ve in vivo çalışmada Candida enfeksiyonlarının tedavisi için bitki kaynaklı doğal ürünler kullanılmış olsa da, bu tedavilerin antifungal etkisinin veya Candidal fizyolojisi üzerindeki etkisinin kesin mekanizması net olarak anlaşılmamıştır. C. verum Bu çalışmada kullanılan yaprak EO hastalık oluşturma etkisinin müdahale etmek suretiyle kandidiyazis tedavisinde, toksik olmayan terapötik uygulama için potansiyeli olan bitkisel bir üründür Candida . Bununla birlikte, C. verum'a dayalı bir mantar önleyici madde geliştirmek için , in-vivo toksisite araştırmaları ve klinik deneylerin yanı sıra gen düzenlemesi üzerine moleküler çalışmaları içeren daha ileri deneyler önerilir. yaprak EO.
Sonuç olarak, bu çalışma, Candida spp.'nin üç temel virülans faktörü olan adezyon, germ tüpü oluşumu ve biyofilm oluşumuna karşı bir anti-virülans yaklaşımı olarak C. verum yaprak EO'nun yüksek etkinliğine dair kanıt sağlar . C. verum yapraklarından ekstrakte edilen EO , ana aktif bileşeni olarak öjenol içerir ve G. mellonella larvalarına karşı toksik değildir .
Git: TEŞEKKÜRLER
Destekleri için Brezilya, Campinas Üniversitesi, Piracicaba Dişhekimliği Okulu, Ağız Tanı Departmanı, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji alanındaki tüm akademik ve akademik olmayan personele.
Git: Dipnotlar
Mali destek: CNPq (Hibe No. 132718/2018-9).
Git: REFERANSLAR
1. Kojic EM, Darouiche RO. Tıbbi cihazların Candida enfeksiyonları. Clin Microbiol Rev. 2004; 17 (2):255–267. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
2. Achkar JM, Patates Kızartması M.Ö. Genitoüriner sistemin Candida enfeksiyonları. Clin Microbiol Rev. 2010; 23 (2):253–273. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
3. Douglas LJ. Candida enfeksiyonlarında biyofilmlerin tıbbi önemi. Rev Iberoam Micol. 2002; 19 :139–143. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
4. Oranlar FC. Candida enfeksiyonlarına genel bir bakış. Kritik Rev Mikrobiyol. 1987; 15 (1):15–15. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
5. Sardi JCO, Scorzoni L, Bernardi T, Fusco-Almeida AM, Mendes Giannini MJS. Candida türlerinin güncel epidemiyolojisi, patojenitesi, biyofilm oluşumu, doğal antifungal ürünler ve yeni tedavi seçenekleri. J Med Mikrobiyol. 2013; 62 (1):10–24. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
6. Marsh PD, Martin MV. Ağız mikrobiyolojisi. 4. Oxford: Wright; 1999. [ Google Akademik ]
7. Asmundsdóttir LR, Erlendsdóttir H, Agnarsson BA, Gottfredsson M. Candida dubliniensis ve Candida albicans'ın virülansında suş varyasyonunun önemi, invaziv kandidiyazisin kör bir histopatolojik çalışmasının sonuçları. Clin Mikrobiyol Enfeksiyonu. 2009; 15 (6):576–585. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
8. Samaranayake L, Fidel P, Naglik JR, Sweet S, Teanpaisan R, Coogan MM. HIV enfeksiyonu ile ilişkili mantar enfeksiyonları. Oral Dis. 2002; 8 :151–160. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
9. Sant'Ana PL.Milan EP.Martinez R.Queiroz-Telles F.Ferreira MS.Alcântara AP Aids hastalarından izole edilen oral Candida türlerinin çok merkezli Brezilya çalışması. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002; 97 (2):253–257. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
10. Arendrup MC. İnvaziv kandidiyazis epidemiyolojisi. Curr Opin Kritik Bakım. 2010; 16 (5):445–452. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
11. Bongomin F, Gago S, Oladele RO, Denning DW. Mantar hastalıklarının küresel ve çok uluslu yaygınlığı - kesinliği tahmin edin. J Mantarları (Basel) 2017; 3 :E57. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
12. Pemán J, Zaragoza R. Kritik hastada invaziv kandidiyazisin erken teşhisine doğru. Rev Iberoam Micol. 2012; 29 (2):71–75. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
13. Tsang PW, Bandara HMHN, Fong W. Purpurin, Candida albicans biyofilm oluşumunu ve hif gelişimini baskılar. PLoS Bir. 2012; 7 (11):1–8. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
14. Raju SB, Rajappa S. Ağız boşluğundan Candida'nın izolasyonu ve tanımlanması. ISRN Dent. 2011; 2011 :487921–487921. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
15. Mayer FL, Wilson D, Hube B. Candida albicans patojenite mekanizmaları. Virülans. 2013; 4 (2):119–128. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
16. Luo S, Skerka C, Kurzai O, Zipfel PF. İnsan patojenik mantar Candida albicans'ın tamamlayıcı ve doğuştan gelen bağışıklıktan kaçınma stratejileri. Mol İmmünol. 2013; 56 (3):161–169. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
17. Coutinho HDM. Candida spp'nin virülansını etkileyen faktörler. Batı Hint Med J. 2009; 58 (2):160-163. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
18. Romo JA, Zhang H, Cai H, Kadosh D, Koehler JR, Saville SP. Küresel transkriptomik analizi. Candida albicans, yeni bir filamentasyon inhibitörü ile tedaviye yanıt. mSphere. 2019; 4 :e00620–e00619. doi: 10.1128/mSphere.00620-19. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
19. Toda M, Williams SR, Berkow EL, Farley MM, Harrison LH, Bonner L. Kültür tarafından doğrulanmış kandidemi için nüfusa dayalı aktif gözetim - dört bölge, Amerika Birleşik Devletleri, 2012-2016. MMWR Gözetim Özeti. 2019; 68 :1–15. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
20. Maia F, Wijesinghe G, Oliveira T, Barbosa JP, de Feiria SNB, Boni GC. Phyllanthus niruri L (taş kırıcı), anti-insan hastalıklarına alternatif, antimikrobiyal ajan ve dirençli mikroorganizmalarla mücadelede uygulanabilirliği. Kısa Bir İnceleme. Braz J Nat Sci. 2020; 3 (2):342–342. [ Google Akademik ]
21. Rao PV, Gan SH. Tarçın çok yönlü bir şifalı bitkidir. Kanıta Dayalı Comp Alter Med. 2014; 2014 :642942–642942. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
22. Ranasinghe P, Pigera S, Premakumara GS, Galappaththy P, Constantine GR, Katulanda P. "Gerçek" tarçının (Cinnamomum zeylanicum) tıbbi özellikleri sistematik bir derleme. BMC Tamamlayıcı Alter Med. 2013; 13 :275–275. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
23. Chamorro ER, Zambón SN, Morales WG, Sequeira AF, Velasco GA. Gaz kromatografisi ile uçucu yağların kimyasal bileşiminin incelenmesi. 2012. https://www.intechopen.com/books/gas-chromatography-in-plant-science-wine-technology-toxicology-and-some-special-applications/study-of-the-chemical-composition-of- uçucu yağlar-gaz-kromatografisi
24. Wijesinghe GK. Gerçek Tarçın (Cinnamomum verum) yaprağı yağının in vitro Candida biyofilmlerine etkisi ve sitotoksik etkisi. Campinas: Campinas Eyalet Üniversitesi; 2019. [ Google Akademik ]
25. Raut JS, Shinde RB, Chauhan NM, Karuppayil SM. Bitki kökenli terpenoidler, Candida albicans tarafından morfogenezi, yapışmayı ve biyofilm oluşumunu engeller. Biyolojik kirlilik. 2013; 29 :87-96. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
26. Pierce CG, Uppuluri P, Tristan AR, Wormley FL, Jr, Mowat E, Ramage G. Fungal biyofilmlerin oluşumu için basit ve tekrarlanabilir 96-yuvalı plaka bazlı bir yöntem ve antifungal duyarlılık testine uygulanması. Nat Protokol. 2008; 3 (9):1494–1500. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
27. Çekiç KA, Carson CF, Riley TV. Melaleuca alternifolia (çay ağacı) yağı, Candida albicans tarafından mikrop tüpü oluşumunu engeller. Med Mycol. 2000; 38 :355–362. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
28. Silva NCC, Fernandes A., Jr Tıbbi bitkilerin biyolojik özellikleri, antimikrobiyal aktivitelerinin gözden geçirilmesi. J Venom Anim Toksinleri, Trop Dis. 2010; 16 (3):402–413. [ Google Akademik ]
29. Freitas-Fernandes FS, Cavalcanti YW, Ricomini AP, Filho, Silva WJ, Cury AADB, Bertolini M. Günlük enzimatik protez temizleyici kullanımının poliamid ve poli(metil metakrilat) reçineleri ve in vitro üzerinde oluşturulan Candida albicans biyofilmleri üzerindeki etkisi Araştırma. J Protez Dent. 2014; 112 (6):13491355-13491355. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
30. Calderone RA, Fonzi WA. Candida albicans'ın virülans faktörleri. Trendler Mikrobiyol. 2001; 9 (7):327–335. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
31. Simões M, Simões LC, Vieira MJ. Mevcut ve ortaya çıkan biyofilm kontrol stratejilerinin gözden geçirilmesi. LWT-Food Sci Tech. 2010; 43 :573–583. [ Google Akademik ]
32. Mah TFC. O'Toole GA Antimikrobiyal ajanlara karşı biyofilm direnci mekanizmaları. Trendler Mikrobiyol. 2001; 9 (1):34–39. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
33. Richardson K, Cooper K, Marriott MS, Tarbit MH, Troke PF, Whittle PJ. Yeni bir mantar önleyici ajan olan Flukonazolün keşfi. Klinik Enfeksiyon Dis. 1990; 12 (Ek 3) [ PubMed ] [ Google Akademik ]
34. Da Silva PMB, Acosta EJTR. de Rezende Pinto L.Graeff M.Spolidorio DMP.Almeida RS Klorheksidin glukonat ve sodyum hipoklorit işlemlerinden sonra ısı ile polimerize edilmiş akrilik reçine üzerindeki Candida albicans biyofilmlerinin mikroskobik analizi. Mikozlar. 2011; 54 (6):e712–e717. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
35. Bobichon H, Bouchet P. Klorheksidinin tomurcuklanan Candida albicans üzerindeki etkisi Tarama ve transmisyon elektron mikroskobik çalışması. mikopatoloji. 1987; 100 (1):27–35. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
36. Kalia M.Yadav VK.Singh PK.Sharma D.Pandey H.Narvi SS Tarçın yağının çekirdek algılama üzerindeki etkisi - Pseudomonas aeruginosa'da kontrollü virülans faktörleri ve biyofilm oluşumu. PLoS Bir. 2015; 10 (8):e0135495. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
37. Erfan A, Marouf S. Tarçın yağı, kanatlı solunum yolu bakteriyel ajanlarının virülans genlerini aşağı regüle eder ve in vitro bir bakış açısıyla önemli bakteri inhibisyonunu ortaya çıkarır. Veteriner Dünyası. 2019; 12 (11):1707-1715. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
38. Zhang D, Gan RY, Zhang JR, Farha AK, Li H, Zhu F. Baharat esansiyel yağlarının antivirülans özellikleri ve ilgili mekanizmaları kapsamlı bir inceleme. Compr Rev Gıda Bilimi Gıda Saf. 2020; 19 (3):1018–1055. [ Google Akademik ]
39. Kim Y, Lee J, Kim S, Baek K, Lee J. Tarçın kabuğu yağı ve bileşenleri biyofilm oluşumunu ve toksin üretimini engeller. Int J Gıda Mikrobiol. 2015; 195 :30–39. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
40. Liyanage T, Madhujith T, Wijesinghe KGG. Gerçek tarçın (Cinnamomum verum Presl syn. C. zeylanicum Blum.) ve Sri Lanka'da yetişen beş yabani tarçın türünün uçucu yağındaki ana kimyasal bileşenler üzerinde karşılaştırmalı çalışma. Trop Tarım Arş. 2017; 28 (3):270–270. [ Google Akademik ]
41. Romo JA, Pierce CG, Chaturvedi AK, Lazzell AL, McHardy SF, Saville SP. Yeni bir dizi küçük moleküllü inhibitörler aracılığıyla kandidiyaz için anti-virülans yaklaşımlarının geliştirilmesi. Candida albicans filamentasyonu. mBio. 2017; 8 (6):e01991–e01917. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
42. Pierce CG, Lopez-Ribot JL. Kandidiyaz ilaç keşfi ve yeni ilaçların keşfedilmesi ve tanımlanması için virülansı hedefleyen yeni yaklaşımlar geliştirme. Uzman Opin İlaç Diskovu. 2013; 8 (9):1117–1126. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
Gayan Kanchana Wijesinghe , 1, + Flávia Camila Maia , 1 Thaís Rossini de Oliveira , 1 Simone N Busato de Feiria , 1 Felipe Joia , 1 Janaina Priscila Barbosa , 1 Giovana Cláudia Boni , 1 Janaina de Cássia Orlandi Sardi , 2 Pedro Luiz Rosalen , 2 ve José Francisco Höfling 1
Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk Reddi
Bu makale, PMC'deki diğer makaleler tarafından alıntılanmıştır .
Git: Soyut
ARKA FON
Cinnamomum verum'dan ekstrakte edilen uçucu yağlar (EO) , yüzyıllardır antimikrobiyal ajan olarak kullanılmıştır. C. verum yaprağı yağının mikroorganizmaların virülansına karşı etkileri henüz iyi çalışılmamıştır. AMAÇLAR
Bu çalışma etkisini değerlendiren C. verum üç hastalık oluşturma faktörlerinin karşı yaprağı yağı , Candida albicans , C. tropicalis ve C dubliniensis'in ve in vivo toksisitesi. YÖNTEMLER
EO'nun kimyasal bileşimi, gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) kullanılarak belirlendi. Minimum inhibitör konsantrasyon (MIC), klinik ve laboratuvar standartları enstitüsü (CLSI) M27-A3 broth mikrodilüsyonu kullanılarak belirlendi. EO'nun ilk yapışma üzerindeki etkisi, Candida hücrelerinin polistiren yüzeyine 2 saat yapışmasına izin verildikten sonra XTT tahlili kullanılarak ölçülmüştür . EO varlığında Candida'nın biyofilm oluşumu, XTT canlılık tahlili kullanılarak ölçülmüştür. Germ tüpü oluşumunun azaltılması üzerindeki etkinlik, standart protokol kullanılarak değerlendirildi. EO tedavisi altında biyofilm oluşumunun ve ilerlemesinin görselleştirilmesi, sırasıyla taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve Zaman atlamalı mikroskop kullanılarak yapıldı. EO'nun in-vivo toksisitesi kullanılarak belirlendiGalleria mellonella larvaları. Klorheksidin diglukonat: pozitif kontrol. SONUÇLAR
Eugenol, EO'nun ana bileşiğiydi. MIC, 1.0 mg/mL idi. İlk yapışma içinde% 50 azalma ile elde edilmiştir C. albicans , C. tropicalis ve C dubliniensis'in 1.0 ile> 2.0 ve 0.34 mg / mL. 0,5 ve 1,0 mg/mL, germ tüpü oluşumunu önemli ölçüde inhibe eder. Biyofilm oluşturmaya yönelik MBIC 50 , ≤ 0.35 mg/mL idi. 1.0 mg/mL, Candida'nın biyofilm ilerlemesini önler . SEM görüntüleri, hücre duvarı hasarları, hücresel büzülmeler ve azalmış hif oluşumu sergiledi. Test edilen herhangi bir konsantrasyonda in-vivo deney modelinde hiçbir öldürücü etki kaydedilmedi . ÇÖZÜM
C. verum yaprak yağı, Candida'nın virülans faktörlerine karşı etki gösterir ve herhangi bir toksisite göstermez.
Anahtar kelimeler: Cinnamomum verum, uçucu yağ, Candida spp., biyofilmler, antivirülans, Galleria mellonella
Candida spp. fırsatçı mantar enfeksiyonlarının en yaygın nedensel ajanıdır ve cilt ve kulak enfeksiyonları, genitoüriner kandidiyazis, hastane pnömonileri, tıbbi cihazla ilişkili enfeksiyonlar ve Kandidemiler dahil yaşamı tehdit etmeyen mukokutanöz hastalıklara invaziv ciddi yaşamı tehdit eden bir dizi duruma yol açar. 1 , 2 , 3 , 4
Bazı Candida türleri kommensalizm gösterir ve insan vücudunun deri ve mukozal yüzeylerini kolonize eder. Ağır derecede hasta olan veya bağışıklığı zayıf olan hastalar hem yüzeysel hem de yaşamı tehdit eden sistemik Candida enfeksiyonları geliştirmeye daha yatkındır . 5 Enfeksiyonlar için predispozan faktörler: aşırı yaş, hormonal değişiklikler, beslenme yetersizliği, HIV insidansı, sık antimikrobiyal maruziyet, kemoterapötik tedaviler, karbonhidrattan zengin (glikoz) diyetler, protez kullanımı ve düşük bağışıklık. 6 , 7 , 8 , 9 konak faktörleri olarak. Mevcut verilere dayanarak, Candida'nın toplam oluşumu enfeksiyonlar, tüm dünyada 100.000 nüfus başına 1.2-25 vaka veya 1000 hastaneye yatış başına 0.19-2.5 civarındadır. Bunların %13'ü, zayıf bağışıklık vb. gibi altta yatan predispozan faktörü olan hastalarda rapor edilmiştir. 10 , 11
Tüm Candida türleri arasında, mantar enfeksiyonları vakalarında en sık görülen etiyolojik ajan Candida albicans'tır ve bu hastalık vakalarının %50'sine varan oranda ilişkilidir. 12 Bu tür, çeşitli yerlerde insan vücudunun bulunduğu ortama kolayca uyum sağlama ve çoğalma kapasitesine sahiptir. İnsan vücudunun farklı dokularında hayatta kalabilme yeteneği, hif formu ile maya formu arasındaki morfolojik geçiş kapasitesi ile ilgilidir. 13 Mayer ve arkadaşlarına göre, hif ve maya enfeksiyon sürecinde yer alır ve daha küçük olan maya yayılabilirken, hif proteinazlar ve fosfolipaz enzimleri yardımıyla epiteli geçerek konakçı dokuyu işgal eder, fagositik hücrelerden kaçar. 14 , 15 , 16 , 17 Candida'nın virülansıyla ilişkili başka bir faktörspp. biyofilm oluşturma, hücre yapışmasını ve biyofilmin hücre dışı matrisinin oluşumunu ve ayrıca daha fazla yapışmasını destekleyen proteinlerin sentezini teşvik etme yeteneğidir. Biyofilm yapısı, hücre dışı matrise penetrasyon zorluğu ve bağışıklık sisteminin etkisi nedeniyle antimikrobiyal ajanlara karşı direnci arttırır, ayrıca akış pompaları olarak antifungallere direnç mekanizmalarının gen ekspresyonunun artmasına izin verir. 18
Birçok bakteri ve mantar türünde olduğu gibi, antimikrobiyal direnç Candida spp. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (CDC), 2012-2016 yılları arasında Candida izolatlarına neden olan tüm sistemik enfeksiyonların yaklaşık %7 ve %1,6'sının birinci sıra antifungal ilaca, flukonazole ve ekinokandinlere direnç gösterdiğini bildirmektedir. 19 Bu nedenle, mevcut antifungal ajanlarla ilişkili toksisitelerin ve ilaç etkileşimlerinin üstesinden gelmenin yanı sıra ortaya çıkan antimikrobiyal direnç geliştirme sorununu etkin bir şekilde ele almak için yeni terapötik seçeneklere ihtiyaç vardır. 20Bitki kaynaklı doğal terapötikler, düşük toksisitesi, kolay erişilebilirliği, maliyet etkinliği ve yüksek terapötik gücü nedeniyle modern dünyanın büyük çoğunluğu arasında daha popüler hale geliyor. 20 Bu yönüyle Cinnamomum verum / Gerçek Tarçın'ın ekonomik ve farmasötik-tıbbi açıdan büyük ilgi gösterdiği gösterilmiştir. 21
Tarçın ağacının çeşitli kısımlarından (kabuk, yaprak, meyve ve çiçek vb.) elde edilen fitokimyasallar, eski çağlardan beri mutfak baharatı ve şifalı bitki olarak kullanılmaktadır. Aynı zamanda birçok eski Asya'da (özellikle Hindistan, Çin ve Sri Lanka'da) terapötik müstahzarlarda bir bileşen olarak kullanılmıştır. 21 Geleneksel halk tıbbında tarçın, antimikrobiyal ve anti-parazitik bir ajan olarak kullanımının yanı sıra göz iltihabı, vajinit, romatizma, nevralji, yara ve diş ağrıları gibi birçok hastalık durumunun tedavisinde kullanılmaktadır. Tarçın ayrıca bronşit, kaşıntı, idrar yolları ve sindirim sistemi ile ilgili hastalıkların tedavisinde de faydalıdır. 22
Birçok rağmen in vitro ile mikrobiyolojik çalışmalar C verum gibi çok sayıda antimikrobiyal direnç sergileyen de dahil olmak üzere sağlık alanında birçok mikrop türleri, ilgili antimikrobiyal aktivite gösterirler Acinetobacter spp., Bacillus spp., Enterobacter spp., Enterococcus faecalis , Escherichia coli , Mycobacterium tuberculosis , Klebsiella pneumoniae ve Haemophilus influenzae vb. 22 Anti- Candida aktivitesi, özellikle Candida spp virülansına etkisi . hala daha az kapsamlıdır.
Bu çalışma, C. verum yaprağı esansiyel yağlarının (EO) Candida spp.'nin ilk yapışması, germ tüpü oluşumu ve biyofilm oluşumu üzerindeki etkisini değerlendirmeyi ve Galleria mellonella larva modeli kullanılarak in-vivo toksisitesini belirlemeyi amaçlamıştır .
Git: MALZEMELER VE YÖNTEMLER
Mantar suşları - Üç Candida tip suşlar, C. albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis (ATCC MYA-646) Piracicaba, Unicamp Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölgesi, Diş Fakültesi elde edilir, Bu çalışmada Brezilya kullanılmıştır. Candida spp'nin standart suşları . stoklar -80ºC'de ultrafreezerde %80 grycerol içinde muhafaza edildi. Stok organizmaları yeniden aktive etmek için, taze hazırlanmış Saboraud Dextrose Agar (SDA, OXOID) kültür ortamında alt kültürlendi, aerobik olarak 37ºC'de 24 saat inkübe edildi.
Standart inoküller 5 x 10 tekabül 0.08-0.10 (600 nm) emme eşdeğerdir McFarland ölçek (0.5), ile uygun olarak bulanıklık ayarlanması ile hazırlanmıştır 6 koloni oluşturan birim (CFU) / ml.
Uçucu yağ - C. verum yapraklarının EO'su, Romik Lanka Marketing Services, Moratuwa, Sri Lanka'dan (WCC/3569) satın alındı. C verum EO 32 mg / mL seyreltilmiş, Tween 80 (% 0.05) çözeltisi ve daha sonra sonifıkasyon ile MOPS [3- (N-morfolino) propan sülfonik asit], 1 döngü ile tamponlanmış Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 20 saniye.
EO'nun kimyasal analizi - C. verum EO'nun kimyasal analizi, HP-6890 (Agilent, ABD) gaz kromatografı ve HP-5975 (Agilent, ABD) seçici kütle dedektörü kullanılarak yapıldı; HP-5MS Kapiler Sütun (30 mx 0,25 mm x 0,25 µm); sıcaklıklar: enjektör (220ºC), dedektör (250ºC), kolon (60ºC), 3ºC/dak, 240ºC; 1.0 mL/dk 18'lik taşıyıcı gazın (yüksek oranda kurutulmuş He) akış hızı . 1.0 uL yağ split modda enjekte edildi ve iyonizasyon kaynağı 70 eV idi. Bileşenlerin bağıl bolluğu aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı. 23
Yüzde bolluğu (%) = (Kromatogramın bileşen alanı/toplam alanı) × 100
Analitleri tanımlamaya yönelik veri tabanı, NIST-11 (Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü) kütle spektral veri tabanı ve NIST kütle spektral arama programıydı (Sürüm 2.0 g).
Minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) belirlenmesi - MIC, modifikasyonlu klinik ve laboratuvar standartları enstitüsü (CLSI) M27-A3 broth mikrodilüsyon yöntemi kullanılarak belirlendi. 24 Kısaca, MOPS ile, RPMI 1640 içinde EO seyreltme 100 uL hazırlanan standart mantar hücresi süspansiyonları, 100 uL (1 x 10 ile karıştırıldı 6 aerobik ve ardından, 96 gözlü bir steril ve düz altlı polistiren mikrotiter plakası içinde hücre / ml) 37ºC'de 24 saat inkübasyon. İnkübasyondan sonra plakalar, büyümenin varlığı ve yokluğu (süspansiyonların bulanıklığı) açısından görsel olarak gözlemlendi. Herhangi bir bulanıklık olmaksızın minimum tedavi konsantrasyonu MİK noktası olarak kabul edildi.
Büyüme kontrolü: EO + standart hücre süspansiyonu yerine 100 µL tamponlu RPMI 1640. Pozitif kontrol: 120 mg/mL klorheksidin diglukonat test edildi.
İlk yapışma etkisi - etkisi C. verum ile yaprağı yağı C. albicans (ATCC MYA-2876), C dubliniensis (ATCC MYA-646) ve C tropicalis , steril polistiren yüzeye (750 ATCC) yapışma kullanılarak incelenmiştir Raut ve diğerleri tarafından daha önce yayınlanmış metodoloji. 25
Sabouraud dekstroz agar (SDA) üzerinde 24 saatlik taze Candida kültürlerinden birkaç koloni, etiketli steril kültür ortamı şişesinde 50 mL YPD broth'a inoküle edildi ve 30 rpm'de (Nova) çalkalayıcı bir inkübatörde 35-37ºC'de 18-24 saat inkübe edildi. Aletler, Brezilya).
İnkübasyondan sonra, hücreler hasat edilmiş ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkandı ve inokülüm 1.0 x 10 'a ayarlanmıştır 7 hücre / ml RPMI Neubauer sayım kullanılarak sonra hücreler 1640 ortamında odası sayma geliştirilmiş. 24
Doksan altı oyuklu steril düz tabanlı mikrotitre plakası bu süspansiyonlarla (100 uL/kuyucuk) tohumlandı ve bir çalkalayıcı inkübatörde (75 rpm, Nova Instruments, Brezilya) 37ºC'de 2 saat boyunca plakaların polistiren yüzeyine yapışmasına izin verildi. 2 mg/mL ila 0.0039 mg/mL (100 µL/kuyu) arasında değişen C. verum yaprağı yağının farklı konsantrasyonlarının varlığı . Yağsız kuyular büyüme kontrolü olarak tutuldu. MOPS+%0.05 Tween 80 ile tamponlanmış RPMI, negatif kontrol kuyularına ilave edildi. Pozitif kontrol olarak MOPS (Sigma-Aldrich, ABD) ile tamponlanmış RPMI 1640 içinde 120 mg/mL klorheksidin diglukonat kullanıldı.
2 saatlik inkübasyondan sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için kuyucuklar 200 uL steril normal salin ile yıkandı. Her bir oyuğa bağlı hücreler, XTT metabolik tahlili kullanılarak ölçülmüştür. Kısaca 80 μL XTT [2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenol)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide, Sigma-Aldrich] ve menadion (Sigma-Aldrich) solüsyonu (4 μL) Her kuyucuğa 10 mL XTT içinde menadion eklendi ve plakalar ışıktan korumak için bir parça alüminyum kağıt ile kaplandı ve 2 saat 37 ºC'de inkübe edildi . Daha sonra elde edilen çözeltinin absorbansı 490 nm'de mikrotitre plaka okuyucu /Versa MAX, moleküler Cihazlar, ABD. 26
Yapıştırılan hücrelerin yüzde azalması, test gruplarının ve negatif kontrol grubunun ortalama XTT aktivitesinin karşılaştırılmasıyla hesaplandı. 24
Germ tüpü oluşumu üzerindeki etki - Blastoconidia'dan germ tüplerinin oluşumu, gerçek hiflerin gelişiminde ilk adımdır ve morfolojik formlar arasında geçiş yapma yeteneği, potansiyel bir virülans faktörü olarak öne sürülmüştür. Tek hücreli blastokonidyal formla karşılaştırıldığında, hiflerin konak dokulara yapışma ve bu dokulara nüfuz etme yeteneği daha yüksektir.
Hammer ve diğerleri tarafından açıklanan bir deney. 27 , C. verum yaprak yağının blastoconidia'dan C. albicans (ATCC MYA-2876) ve C. dubliniensis (ATCC MYA-646) hifasına morfolojik geçişi (germ tüpü/hifal oluşumu) üzerindeki etkilerini incelemek için yapılmıştır .
C. verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonatın üç konsantrasyonu (1/4 MIC, 1/2 MIC ve MIC) steril cam Bijou şişelerinde 1 mL hacimlerde fetal sığır serumu (FBS) (Sigma-Aldrich) içinde iki katı dozda hazırlandı. istenen nihai konsantrasyon şu şekildedir: 0.25, 0.5, 1.0 ve 0 mg/mL.
Maya özütü-pepton-dekstroz (YPD) ortamında önceden açıklandığı gibi hazırlanan hücre süspansiyonlarının eşit hacimleri (1 mL) her C. verum yaprağı yağı muamelesine ilave edildi ve iyice karıştırıldı. Tüm tedaviler daha sonra aerobik olarak 37ºC'de çalkalanmadan inkübe edildi ve iyice karıştırıldıktan sonra 0 saat, 2 saat, 4 saat ve 6 saatte örneklendi.
Hazırlanan süspansiyonlardan 10 μL'lik Neubauer geliştirilmiş sayım odasına her zaman noktasında yüklendi ve 500 Candida hücresindeki çimlenen hücre sayısı (germ tüplü hücreler) sayıldı ve çimlenen hücre sayısına bölünerek germ tüp oluşum yüzdesi hesaplandı. beşe kadar.
(EO) varlığında biyofilm gelişimi üzerindeki etki - Her organizmanın 100 μL standart inokulumu 96 kuyucuklu steril düz tabanlı bir mikroplaka plakasına aşılandı, ardından çalkalama altında 120 dakika aerobik inkübasyon (37ºC'de 75 rpm)( Nova Aletler, Brezilya). Plaka daha sonra bir kez steril PBS ile yıkandı ve her bir uçucu yağ seyreltisinden 100 µL tedavi kuyularına ayrı ayrı ilave edildi. Büyüme kontrol kuyularına MOPS ile tamponlanmış 100 µL RPMI 1640 ve negatif kontrol kuyularına yağ yerine %0.05 Tween 80 ile tamponlanmış RPMI 1640 ilave edildi. 28 Klorheksidin diglukonat pozitif kontrol olarak kullanıldı. Plaka daha sonra aerobik olarak 37ºC'de 24 saat inkübe edildi.
Biyofilm biyokütlesi, daha önce açıklanan XTT metabolik tahlili kullanılarak 24 saatlik inkübasyondan sonra ölçülmüştür.
Biyofilm oluşturmak için minimum toksik konsantrasyon (MTC) - MTC , Candida spp. oluşturan biyofilmleri öldürmek için gereken C. verum yaprağı yağının minimum konsantrasyonunu belirler . tamamen. Biyofilm oluşturan yağın MTC'sini saptamak için CFU tahlili kullanıldı. Farklı konsantrasyonlarda C. verum yaprağı yağı ile 24 saatlik muameleden sonra, yapışan biyofilmin kütlesi steril bir hücre kazıyıcı kullanılarak kazındı ve 100 µL steril normal salin içinde tamamen homojenleştirildi ve daha sonra süspansiyon seri olarak seyreltildi (10 -1 ila 10 -6). Daha sonra, 100 uL'lik bir alikuot, SDA ortamı üzerine kaplanmıştır. Agar plakaları 37ºC'de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra koloni oluşturan birimler sayıldı ve sonuçlar CFU/mL olarak ifade edildi. 29
C. verum yaprak yağı varlığında biyofilm oluşturmanın taramalı elektron mikroskobu (SEM) - Farklı konsantrasyonlarda C. verum yağı varlığında oluşturulan biyofilmlerin ultra yapısal özellikleri SEM kullanılarak değerlendirildi. 24
Steril kapak slipleri ayrı olarak 12 oyuklu hücre kültürü kümesine yerleştirildi. Kapak slipleri, 1 ml standart hücre süspansiyonu (1 x 10 daldırıldı 7 muntazam sağlamak için hücre / mL) , Candida yapışma ve bir sallanan kuluçka makinesi (Nova Instruments, Brezilya) içinde 37 ° C'de 120 dakika inkübe edildi. Daha sonra lameller steril bir forseps kullanılarak dikkatlice hareket ettirildi ve 0,5 mg/mL, 1,0 mg/mL ve 2 mg/mL C. verum içeren yeni 12 oyuklu plakaya nazikçe daldırıldıRPMI 1640 (1 mL/kuyu) içinde yağ. Lameller aerobik olarak 37ºC'de 24 saat inkübe edildi. 24 saatlik inkübasyondan sonra, EO seyreltmelerinin mevcudiyetinde oluşturulmuş biyofilmlere sahip lameller daha sonra steril PBS ile üç kez yıkandı. Daha sonra 4ºC'de %2,5 glutaraldehit içeren yeni bir 24 oyuklu hücre kültürü kümesine aktarıldılar. 60 dakika glutraldehit ile sabitlendikten sonra, numuneler bir dizi etanol solüsyonunda (10 dakika için %70, 10 dakika için %80, 10 dakika için %95 ve mutlak etanol içinde 10 dakika) dehidre edildi ve bir gece boyunca havada kurutuldu. altın ile püskürtme kaplamadan önce inkübatör. Klorheksidin diglukonat (0.25 mg/mL ve 0.125 mg/mL) ve Flukonazol (0.008 mg/mL), maruziyet sonrası biyofilm mimarisini yaygın antifungaller ve C. verum yaprak yağı tedavisi ile karşılaştırmak için pozitif kontroller olarak kullanıldı .
Biyofilm ilerleme analizi (Zaman Atlamalı Mikroskop) - C. verum yaprak yağı varlığında Candida in vitro biyofilmlerinin ilerlemesi Zaman Atlamalı Mikroskop kullanılarak değerlendirildi. C. verum yaprak yağı varlığında biyofilm ilerlemesinin analizi için , C. albicans (ATCC MYA-2876); C dubliniensis (ATCC MYA-646) ve C tropicalis (ATCC 750), 24 kuyulu hücre kültürü kümesinin polistiren yüzeyi üzerine yapıştırılmış ve üç konsantrasyonda (0.5 mg / mL, 1.0 mg / mL ve 2.0 mg ile tedavi edilmiştir / mL) C. verumDaha önce açıklandığı gibi yaprak yağı. Tedaviyi ekledikten sonra 37ºC'de 24 saatlik inkübasyon sırasında, biyofilm oluşturma görüntüleri 0, 4 saat, 8 saat, 12 saat, 16 saat, 20 saat ve 24 saat zaman atlamalı mikroskop 24 (ZEISS ApoTome.2) kullanılarak yakalandı. ).
C. verum uçucu yağının G. mellonella larvaları üzerindeki in-vivo toksisitesi - İn-vivo toksisite deneyi, daha önce Wijesinghe (2019) tarafından tarif edildiği gibi G. mellonella larvaları üzerinde gerçekleştirilmiştir . 24 Çalışma grubu ve kontrol grubu (n = 10) larvaları (RJ Mous Livebait, Hollanda) seçildi ve seçilen larvalar bir Petri kabında (10/petri kabı) tutuldu. Vücutlarında koyu pigmentasyonlar veya belirgin melanizasyon dahil olmak üzere renk değişiklikleri olan larvalar ve 0,2-0,3 g vücut ağırlığının dışındaki larvalar hariç tutulmuştur. C. verum yaprağının EO dilüsyonları steril PBS içinde hazırlandı (Konsantrasyonlar 0,5 ila 1000 mg/mL arasında değişiyordu).
On (10) uL EO dilüsyonu, 1 mL'lik bir şırınga kullanılarak larvaların son sol ön bacağından hemosele enjekte edildi. EO uygulanmadan önce prick alanı %70 etanol ile dekontamine edildi. Larva içeren tabaklar daha sonra bir kapakla kapatıldı ve 37ºC'de aerobik inkübatörde tutuldu. Negatif kontrol grubuna (n=10) %0.05 Tween 80 ile 10 µL Steril PBS uygulandı.
Larvaların canlılığı, vücut görünümünün (kahverengi-koyu kahverengi renk) görsel olarak incelenmesi ve vücut hareketinin olmaması ile izlendi. Deney iki kez tekrarlandı.
İstatistiksel analiz - İstatistiksel analiz, Statistical Package for Social Sciences (SPSS) sürüm 16 kullanılarak gerçekleştirildi. Üçten fazla veri setinin çoklu ortalamaları, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve iki yönlü ANOVA kullanılarak karşılaştırıldı. Anlamlılık düzeyi %5 olarak alınmıştır (p < 0.05).
Git: SONUÇLAR
Kimyasal bileşim - Tanımlanmış ve karakterize edilmiş kimyasal bileşenler ve bunların göreceli bolluğu,Tablo I. En bol bulunan aktif bileşik Eugenol'dür (%77.22). Benzil benzoat (%4,53), Trans caryophyllene (%3.39), Asetil öjenol (%2.75) ve Linalool (%2.11), spektrumlar (NIST) arasında >%95 benzerlik ile küçük bileşenler olarak bulundu (Tablo I). TABLO I
Gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) ile tespit edilen Cinnamomum verum yaprağı esansiyel yağının (EO) kimyasal bileşenleri ve nispi bolluğu
| Tutma süresi (dk) | Birleştirmek | % Bolluk |
| 21.41 | öjenol | 77.22 |
| 36.65 | Benzil benzoat | 4.53 |
| 23.67 | trans karyofillen | 3.39 |
| 28.03 | asetil öjenol | 2.75 |
| 10.56 | Linalol | 2.11 |
| 17.45 | Trans-Sinnamaldehit | 1.69 |
| 24.71 | Asetik asit sinnamil ester | 1.49 |
mikrofon -Tablo IIC. verum EO ve pozitif kontrol klorheksidin diglukonata karşılık gelen MIC değerlerini temsil eder . Hem C. verum hem de klorheksidin diglukonat, planktonik C. albicans (ATCC MYA-2876) ve C. dubliniensis (ATCC MYA-646) üzerinde benzer bir etkinlik sergiledi . C tropikalis (ATCC 750), C. verum yaprak yağına kıyasla klorheksidin diglukonat için daha duyarlıydı . TABLO II
Candida spp'nin minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) . Deney, üç ayrı deney ile üç kopya halinde yapıldı. Pozitif kontrol olarak klorheksidin diglukonat kullanıldı
| organizma | Tarçın verum yağı mg/mL | Klorheksidin diglukonat mg/mL | |
| 1 | C. albicans (ATCC 5314) | 1.0 | 1.0 |
| 2 | C. tropikalis (ATCC 750) | 1.0 | 0,5 |
| 3 | C. dubliniensis (ATCC MYA-646) | 1.0 | 1.0 |
İlk yapışma üzerindeki etki - C. verum yaprağı yağının Candida'nın polistiren yüzeylere yapışması üzerindeki etkisini belirlemek için mikrotitre plaka XTT yönteminin sonuçları şu şekilde gösterilmiştir:1.
1:
XTT metabolik aktivitesi azalma yüzdesi Candida albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis farklı konsantrasyonlarının varlığında (ATCC MYA-646) tarçın verum (CV) yaprağı yağı ve klorheksidin diglükonat (CHL). Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder.
Elde edilen verilere göre, C. verum yaprak yağı, negatif kontrole kıyasla tüm test suşlarının polistiren yüzeye yapışmasını etkili bir şekilde azaltır. C. albicans , 1.0 mg/mL konsantrasyonla yapışmada %50 azalma sağlarken, C. tropikalis ve C. dubliniensis , sırasıyla > 2.0 mg/mL ve 0.34 mg/mL yağ konsantrasyonları ile yapışmada %50 azalma göstermiştir. Klorheksidin diglükonat yapışma% 50 azalma sergilemiştir C. albicans , C. tropicalis ve C dubliniensis'in sırasıyla 1.06 mg / mL, 0.72 mg / ml ve 1.32 mg / ml konsantrasyonlar ile (Tablo III). TABLO III
Minimum konsantrasyonları tarçın verum yaprak uçucu yağ (EO) ve klorheksidin diglükonat (CHL) yapışmasını azaltmak için gerekli olan Candida albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis ile (ATCC MYA-646) %50
| c. albicans | C. tropikal | C. dubliniensis | ||||
| C. verum | CHL | C. verum | CHL | C. verum | CHL | |
| Konsantrasyon (mg/mL) | 1.0 | 1.06 | > 2.0 | 0,72 | 0,2 | 1.32 |
C. verum yaprağı yağının germ tüpü oluşumuna etkisi -İncir. 26 saatlik deney süresi boyunca 0.25, 0.5 ve 1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonat varlığında germ tüpü oluşturan hücrelerin yüzdesini gösterir .
İncir. 2:
(A) Candida albicans (ATCC MYA-2876) ve (B) C. dubliniensis (ATCC MYA-646)'nın 0.25, 0.5 ve 1.0 mg/mL Cinnamomum verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonat ile 6 saatlik test süresi içinde mikrop tüpü oluşum yüzdesi 2 saat aralıklarla. 0 mg/mL konsantrasyon, negatif kontrolü gösterir. Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder.
Elde edilen verilere göre, hem C. verum yaprak yağı hem de klorheksidin diglukonat, test edilen tüm konsantrasyonlarda C. albicans ve C. dubliniensis'in germ tüpü oluşumunu önemli ölçüde azalttı (p < 0.05). 1.0 mg/mL (MIC) konsantrasyonunda hem C. verum yaprağı yağı hem de klorheksidin diglukonat , deney süresi (6 saat) boyunca her iki Candida türünün germ tüpü oluşumunu tamamen engelledi .
Biyofilm oluşturmanın minimum biyofilm önleyici konsantrasyonu - Bu deneyde, biyofilm oluşumunu %50 (negatif kontrole kıyasla) engellemek için gereken minimum C. verum yaprağı yağı konsantrasyonu belirlendi. Uçucu yağ varlığında oluşan biyofilmlerin biyokütlesi/canlılığı, XTT canlılık tahlili kullanılarak belirlendi.Şekil 3 negatif kontrole kıyasla biyofilm oluşturmanın XTT metabolik aktivitesinin yüzde azalmasını gösterdi.
Şekil 3:
XTT metabolik aktivitesi azalma yüzdesi Candida albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis (ATCC MYA-646), farklı konsantrasyonlarda varlığı ile oluşturan biyofilm tarçın verum (CV) yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonat (CHL). Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder. Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder.
Elde edilen verilere göre biyofilm oluşumunu %50 azaltmak için gereken konsantrasyonlar aşağıdaki gibidir (Tablo IV). TABLO IV
En az biyofilm inhibe edici konsantrasyonlar (MBIC 50 arasında biyofilm oluşturulması için) Candida albicans (ATCC MYA-2876), C tropicalis (ATCC 750) ve C dubliniensis (ATCC MYA-646)
| c. albicans | C. tropikal | C. dubliniensis | ||||
| tarçın çiçeği | CHL | C. verum | CHL | C. verum | CHL | |
| MBIC 50 (mg / mL) | 0.15 | 0.05 | 0.35 | 0.08 | 0,2 | 0.025 |
MTC - Candida hücrelerini öldürerek biyofilm oluşumunu tamamen önlemek için gereken minimum C. verum yaprağı yağı konsantrasyonu, CFU testi kullanılarak belirlendi.4farklı konsantrasyonlarda C. verum yaprağı yağı ve CFU testi ile belirlenen klorheksidin diglukonatın mevcudiyeti ile biyofilm oluşturma canlılığını temsil eder .Tablo V test suşlarının biyofilm oluşumunu tamamen önlemek için gereken minimum tedavi konsantrasyonunu temsil eder.
4:
varlığında Candida albicans (CA) (ATCC MYA-2876), C. tropikalis (CT) (ATCC 750) ve C. dubliniensis (CD) (ATCC MYA-646) biyofilmlerinin log koloni oluşturan birim (CFU) değerleri . (A) Cinnamomum verum (CV) yaprak yağı ve (B) klorheksidin diglukonat (CHL)'nin farklı konsantrasyonları . Tüm hata çubukları ± 2 standart sapmayı (SD) temsil eder. TABLO V
Candida albicans (ATCC MYA-2876), C. tropikalis (ATCC 750) ve C. dubliniensis'in (ATCC MYA-646) oluşturan biyofilmlerini (MTC) tamamen öldüren Cinnamomum verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglukonat konsantrasyonları
| test suşu | Konsantrasyon, oluşturan biyofilmleri öldürmeyi gerektirir (mg/mL) | |
| C.verum yağı | klorheksidin diglukonat | |
| C. albicans (ATCC MYA-2876) | 1.0 | 0.25 |
| C. tropikalis (ATCC 750) | 1.0 | 0.125 |
| C. dubliniensis (ATCC MYA-646) | 1.0 | 0.125 |
Biyofilm oluşturmanın SEM'i - 0.5, 1.0 ve 2.0 mg/mL C. varlığında C. albicans (ATCC MYA-2876), C. tropikalis (ATCC 750) ve C. dubliniensis (ATCC MYA-646) biyofilm oluşturma üst yapısı . verum yaprağı yağı, klorheksidin diglukonat ve Flukonazol, SEM tarafından kalitatif olarak değerlendirildi (Şekil 5, ,6,6, ,77).
Ayrı bir pencerede aç
Şekil 5:
0.5 mg/mL Cinnamomum verum yaprağı yağı (A ve D), 1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı (B ve E) varlığında biyofilm oluşturan Candida albicans'ın (ATCC MYA-2876) taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri , 2 mg/mL C. verum yaprağı yağı (C ve F), 0,25 mg/mL klorheksidin diglukonat (G ve J) ve 0,008 mg/mL Flukonazol (H ve K). I ve L: negatif kontrol. Kırmızı daireler: tedavilerle hücre duvarı deformiteleri.
Ayrı bir pencerede aç
Şekil 6:
0.5 mg/mL Cinnamomum verum yaprağı yağı (A ve D), 1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı (B ve E), 2.0 varlığında biyofilm oluşturan Candida tropikalis'in (ATCC 750) taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri mg/mL C. verum yaprağı yağı (C ve F), 0.125 mg/mL klorheksidin diglukonat (G ve J) ve 0.008 mg/mL Flukonazol (H ve K) I ve L: negatif kontrol. Kırmızı daire: tedavilerle hücre duvarı deformiteleri. Kırmızı düz ok: hücre içi bileşenlerin sızıntıları.
Ayrı bir pencerede aç
7:
0.5 mg/mL Cinnamomum verum yaprağı yağı (A ve D), 1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı (B ve E) varlığında biyofilm oluşturan Candida dubliniensis'in (ATCC MYA-646) taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri , 2mg/mL C. verum yaprağı yağı (C ve F), 0.125 mg/mL klorheksidin diglukonat (G ve J) ve 0.008 mg/mL Flukonazol (H ve K) I ve L: negatif kontrol. Kırmızı daire: tedavilerle hücre duvarı deformiteleri.
Cinnamomum verum yaprağı yağı , hücre duvarına zarar vererek Candida hücresinin büzülmesine ve hücre içi materyallerin sızmasına neden olur. Bu etkiler konsantrasyona bağlıdır. 2 mg/mL C. verum yaprağı yağı ile maksimum hücre hasarı gözlendi . Ve C. verum yaprağı yağı, biyofilm gelişimini ve biyofilm hücre yoğunluğunu azaltmıştır.
Zaman atlamalı mikroskop kullanılarak biyofilm ilerleme analizi -Şekil 8AC, C. albicans'ın (ATCC MYA-2876) oluşan biyofilmlerinin zaman atlamalı mikroskobik görüntülerini gösterir ; C dubliniensis (ATCC MYA-646) ve C tropicalis uçucu yağ tedavisiz (ATCC 750), 0.5 mg / mL, 1.0 mg / ml ve 2.0 mg / ml C. verum 24 saat bir süre için yaprağı yağı tedavisi.
Ayrı bir pencerede aç
8:
(A) Candida albicans'ın (ATCC MYA-2876) gelişen biyofilmlerinin Zaman Atlamalı görüntüleri . Her sütun, Cinnamomum verum yaprağı yağı tedavisinin konsantrasyonunu temsil eder . (B) biyofilm geliştirme zaman ihmaller görüntü C. tropicalis (ATCC 750). Her sütun, C. verum yaprağı yağı muamelesinin konsantrasyonunu temsil eder . (C) C. dubliniensis'in (ATCC MYA-646) gelişen biyofilmlerinin Zaman Atlamalı görüntüleri . Her sütun, C. verum yaprağı yağı muamelesinin konsantrasyonunu temsil eder .
İşlenmemiş (negatif) kontrol biyofilminin ilerlemesi, gözlem süresi boyunca aşırı biyofilm gelişimini gösterir. 0,5 mg/mL C. verum yaprağı konsantrasyonu Candida spp.'nin biyofilm gelişiminin gecikmesine neden olmuştur . 1.0 mg / ml ve 2.0 mg / ml C. verum yaprağı yağı tamamen inhibe C tropicalis ve C dubliniensis hücresi proliferasyonu ve 0 h biyofilm gelişimi.
1.0 mg/mL C. verum yaprağı yağı ile C. albicans , 8 saate kadar hafif hücre proliferasyonu sergilerken, 2.0 mg/mL biyofilm gelişimini tamamen inhibe etti.
İn-vivo C. verum yaprağı yağı (G. mellonella larvaları) toksisitesi - in vivo toksikliği C verum yaprak EO ile değerlendirildi in vivo G. Mellonella EO farklı konsantrasyonları ile işlemden sonra larva modeli. Muamele edilen larvaların %100 hayatta kaldığı, test edilen tüm konsantrasyonlarda (0.5, 1.0, 2.0, 16.0, 32.0, 64.0, 128.0, 250.0, 500.0, 1000.0 mg/mL) gözlemlendi, bu da tüm deney süresi boyunca (5 gün) deneysel modelde C. verum yaprağı EO toksisitesi (Şekil 9).
Şekil 9:
Beş günlük deney süresi boyunca Cinnamomum verum yaprağı yağının uygulanmasından sonra Galleria mellonella larvalarının hayatta kalma oranı . Larvalara steril fosfat tamponlu salin (PBS) uygulanarak kontrol eğrisi elde edildi.
Git: TARTIŞMA
Candida spp. konakçı dokularda başarılı bir şekilde kolonize olmaya katkıda bulunan birçok virülent faktör gösterir. Konak yüzeylere yapışma (biyofilm oluşumunun ilk basamağı), germ tüpü oluşumu, biyofilm oluşumu, proteinazların ve diğer hidrolitik enzimlerin salgılanması ve aldehit üretimi bunlardan bazılarıdır. 30 Fitomedikal terapötikler, antimikrobiyal direncin yüksek oranda ortaya çıkması ve mikrobiyal patojenlerin artan virülansı nedeniyle modern dünyada daha popüler hale geliyor. 21 Öte yandan, kolay erişim, konakçı için toksisite olmaması, yüksek etkinlik ve maliyet etkinliği, antimikrobiyal doğal ürünlerin terapötik alternatifler olarak yaygın şekilde kullanılmasına katkıda bulunur. 21 Bu çalışma, bu tür bitki kaynaklı antimikrobiyal ajan C. verum yaprak EO'nun en yaygın insan mantar patojeni Candida spp.'nin virülans mekanizmalarını kontrol etme üzerindeki etkinliğini değerlendirmek için yapılmıştır . Ayrıca in-vivo laboratuvar deney modeli olan G. melonella larvaları üzerindeki toksisite de değerlendirilmiştir.
Konak yüzeylere veya abiyotik yüzeylere yapışma, mikrobiyal patojenlerin kolonizasyonunun ilk adımıdır. EO, 1.0 mg / mL konsantrasyonda yapışmasını düşük C. albicans ,> 2.0 mg / ml ve 0.34 mg / petrol ml konsantrasyonları düşük ise,% 50 C tropicalis ve C. dubliniensis sırasıyla% 50 yapışma. Referans mantar karşıtı klorheksidin diglükonat sergilenen yapışma azalma% 50 C. albicans , C. tropicalis ve C dubliniensis'in 1.06 mg / mL, 0.72 mg / mL ve 1.32 mg / mL konsantrasyonlar mevcut olabilir. Daha da önemlisi, daha düşük konsantrasyonlarda C. albicans ve C. dubliniensis'in yapışmasında %50 azalma sağlanmıştır.C. verum yaprak yağı, klorheksidin diglukonat kontrolüne kıyasla bu iki suşun yapışmasını önlemede C. verum EO'nun daha yüksek etkinliğini gösterir . Elde edilen verilere göre, 2.0 mg/mL klorheksidin diglukonat, tüm test suşlarının yapışmasını tamamen inhibe eder, ancak gözlem, test süresi (2 saat) sırasında organizmaların tamamen öldürülmesine bağlı olabilir. Konak yüzeylere yapışma, biyofilm oluşumunun ana virülans faktörlerinden ve ilk adımlarından biri olduğundan, C. verum EO'nun Candida spp. üzerindeki yapışma önleyici özellikleri . bir antimikrobiyal ajan olarak uygunluğuna katkıda bulunur.
Germ tüpü oluşumu, C. albicans ve C. dubliniensis'in konakçı dokuları istila ederek besinlerin emilimini sağlayan bir diğer önemli virülent faktördür . Etkisi C VERUM alt MIC (0.25 ve 0.5 mg / ml), her ikisi de C. verum yaprağı yağı ve klorheksidin diglükonat miktarı hem mikrop tüp oluşumunu azaltmak C. albicans ve C dubliniensis'in MIC (1.0 mg / ml), oysa test suşlarının germ tüpü oluşumunu tamamen inhibe eder. Zamanla ( C. albicans için , 2 saat sonra ve C. dubliniensis için, 4 saat sonra) üretilen germ tüpleri yalancı hif ve hifaya dönüştüğü için kontrol grubu dahil tüm gruplarda germ tüpü oluşumu kademeli olarak azaldı. C. verum yaprağı EO'nun Candida spp.'nin adezyonu ve germ tüpü oluşumu üzerindeki etkisine dair yayınlanmış hiçbir bilimsel kanıt bulunmamaktadır . Mevcut çalışma, Tarçın yaprağı yağının Candida spp'nin öldürücü faktörlerini kontrol etme üzerindeki etkinliğini bulmak için tasarlanmıştır . mevcut verilerin bu boşluğunu doldurmak için. Yapışma ve germ tüpü oluşumu, Candida'nın enfeksiyona neden olma yeteneğinin temel özellikleridir ve bu nedenle, bu faktörlere müdahale eden antimikrobiyal maddeler, potansiyel anti- Candida ajanları olarak kabul edilir . Bu nedenle C. verumyaprak EO, Candida enfeksiyonlarına karşı terapötik bir alternatif olarak geliştirilebilir .
Biyofilm, hücrelerden ve çevreden türetilen hücre dışı bir matrise gömülü yüzeye bağlı mikrobiyal topluluklardır. 21 Biyofilmler, bu dış stresleri nötralize etmek için çeşitli mekanizmalar sergilediklerinden, biyofilmler planktonik muadillerine kıyasla fiziksel ve kimyasal streslere karşı daha dirençlidir. Hücre dışı biyofilm matrisi, antimikrobiyal ajanların biyofilme difüzyonu için fiziksel veya kimyasal bir bariyer görevi görür. Ayrıca, besinlerin sınırlı mevcudiyeti ile biyofilm topluluğu, üstel büyümeden yavaş büyüme veya hiç büyüme durumuna doğru kayar. Yukarıdaki faktörlerin tümü ve bir biyofilm fenotipinin uyarılması ve çekirdek algılama, bir biyofilmin antimikrobiyal ajanlarına karşı yüksek dirence katkıda bulunur. 31 , 32 Biyofilmlerin mevcut antimikrobiyal stratejilere direnci giderek yaygınlaştığından, özellikle patojenin virülansını etkin bir şekilde kontrol ederek yeni, toksik olmayan, ucuz ve etkili tedavi seçenekleri icat etmek için daha fazla çalışma yapılmalıdır. Mevcut çalışmada, potansiyel bir fitomedikal ajan olarak C. verum yaprağı EO'nun etkinliği, Candida biyofilmlerinin oluşturulmasında değerlendirilmiştir . C. verum EO, C. albicans (ATCC MYA-2876), C. tropikalis (ATCC 750) ve C. dubliniensis'in biyofilmlerinin oluşumunda potansiyel bir antibiyofilm etkisi sergiledi .(ATCC MYA-646) test suşları. Biyofilm gelişimini %50 azaltmak için gereken konsantrasyonlar (negatif kontrol ile karşılaştırıldığında), üç test suşu için sırasıyla 0.15, 0.35 ve 0.2 mg/mL idi. Ve MTC (biyofilm gelişimini tamamen durdurmak için gereken EO konsantrasyonları) tüm test suşları için 1.0 mg/mL idi. Önemli olarak, bu MTC değerleri, biyofilmlerin planktonik muadilinden daha dirençli mikrobiyal topluluklar olarak kabul edilmesine rağmen , C. verum EO'nun biyofilm oluşturmanın yüksek öldürme potansiyelini gösteren test suşlarının MIC ve MFC değerlerinden düşüktür. Bu veriler, C. verum yağının, Candida biyofilmlerinin normal oluşum sürecini kesintiye uğratma üzerindeki potansiyel etkisini göstermektedir .
C. verum yaprak yağının kimyasal stresi altında biyofilm ilerlemesi hızlandırılmış mikroskopla görüntülendi ve bu deneyden elde edilen sonuçlar yukarıdaki gözlemi doğruluyor. 2 x MTC (2 mg/mL) C. verum EO, 0. saatten itibaren tüm test suşlarının biyofilm gelişimini tamamen inhibe ederken, 0. saatten itibaren MTC (1 mg/mL) ile ilerleyen C. albicans'ta hafif hücresel proliferasyon ve biyofilm gelişimi gözlemlendi. 8 saate kadar. 8 saat sonra, biyofilm geliştiren C. albicans'ta görünür bir biyofilm gelişimi kaydedilmedi . C. tropikalis ve C. dubliniensis biyofilm gelişimi, MTC tarafından 0. saatte tamamen inhibe edilmiştir. Sub-MTC (0,5 mg/mL), test edilen tüm biyofilm gelişiminin gecikmesine neden olurCandida suşları. Bu sonuçlar, biyofilm önleyici bir strateji olarak C. verum yaprak EO'nun olası etkin kullanımını göstermektedir . Ayrıca, SEM ve zaman atlamalı mikroskopiden elde edilen veriler, EO'nun Candida biyofilminin ilerlemesi üzerindeki etkisinin doza bağımlı olduğunu ortaya koymaktadır .
C. verum yaprak EO varlığı ile geliştirilen Candida biyofilmlerinin yapısını anlamak için SEM görüntüleri alınmıştır . Test suşlarının tüm biyofilmleri, tarçın yaprağı yağı tedavisi ile azaltılmış hücre yoğunluğu, hücre duvarı hasarları, hücre duvarı deformiteleri ve hücre içi materyal sızıntıları sergiledi. Daha da önemlisi, SEM görüntüleri, C. verum yaprağı esansiyel yağının etkilerinin doza bağımlı doğasını doğrulamaktadır . Flukonazol, azol grubuna ait bilinen bir antifungal ajandır ve lanosterolün ergosterole dönüşmesini engelleyerek fungal sterol, ergosterol sentezini engeller. 33 Öte yandan klorheksidin diglukonat, antibakteriyel ağız gargarası olarak kullanılan bir biguaniddir. Morfoloji hücrelerini değiştirir ve mikroorganizmaların hücre duvarına zarar verir ve hücre içi bileşenleri serbest bırakır. Oral kandidiyaz için iyi bilinen bir terapötik antifungal ajan olarak önerilmiştir. 34 , 35 , her iki antimikrobik maddelerin yana üzerinde bir etkiye sahip Candida hücre duvarı oluşturan ince yapısı , Candida ile biyofilm 0.25 mg / ml klorheksidin diglükonat için ( C. albicans ), 0.125 mg / ml klorheksidin diglükonat için ( C. tropicalis ve C dubliniensis'in ) ve 0,008 mg/mL Flukonazol ( in vitro olarak önerilen maksimumtahlil konsantrasyonu, CLSI) de görselleştirildi. Benzer gözlemler, klorheksidin diglukonat ve 0.008 mg/mL Flukonazolün MTC'sine maruz bırakıldığında elde edilmiştir. Flukonazolün maruziyet sonrası tepkisinin yoğunluğu, düşük konsantrasyon nedeniyle minimal olmuştur.
Klorheksidin diglukonat düşünüldüğünde, C. verum yaprak yağı ile benzer etki göstermiştir ( Candida hücrelerinin hücre duvarlarına zarar verir ve sitoplazmik sızıntılara neden olur). Bundan başka, SEM gözlemlerine göre, klorheksidin diglükonat psödo hifler oluşumu azalmıştır C. tropicalis , negatif kontrol ile karşılaştırıldığında. SEM kullanılarak analiz edilen biyofilmlerin hiçbirinde biyofilmlerin karakteristiği olan ekstraselüler polimerik matris gözlenmemiştir, çünkü ön işlemler ve ekipmanın elektron ışını matris tahribatına neden olabilir.
C. verum yağının Candida biyofilm oluşumu üzerindeki etkisi iyi çalışılmamış olsa da, çeşitli bilim adamları tarafından Tarçın yağının farklı bakteri türlerinin virülansı ve biyofilm tükenmesi üzerindeki etkinliğini değerlendirmek için birkaç çalışma yapılmıştır. Kalia et al. 2015 yılında 36 , biyofilm oluşumunun inhibisyonunu ve proteolitik enzim üretimi ve kümelenme aktivitesi gibi diğer çekirdek algılama (QS) ile ilişkili virülans faktörlerini ve etkili biyofilm azaltma ve QS üzerindeki antagonist etkiyi ölçerek tarçın yağının Pseudomonas aeruginosa'ya karşı anti-nispeten algılama aktivitesini inceledi. . Ayrıca, 2019'da Erfan ve Marouf, solunum yolu bakteriyel patojenlerinin ( Staphylococcus aureus) virülans genlerinin aşağı regülasyonunu gözlemledi., E. coli , Avibacterium paragallinarum ve Pasteurella multocida vb.) tarçın yağı ile. Antibiyotiğe dirençli bakteriyel enfeksiyonların kontrolü için rutin antibiyotikler yerine tarçın yağının olası kullanımını önerdiler. 37 Zhang ve ark. 2020 ve Kim ve ark. 2014'te 38 , 39 , C. verum kabuğu yağının mikrobiyal toksinlerin inhibisyonu, biyofilm gelişimini kesintiye uğratması ve patojenik bakteri türlerinin çekirdek algılaması dahil olmak üzere birkaç anti-virülans mekanizması tanımladı . Ancak C. verum yaprağı yağının mantar öldürücülüğü üzerindeki anti-virülans özellikleri geniş çapta çalışılmamıştır.
Yeni bir bitkisel terapötik maddenin icadı söz konusu olduğunda, klinik uygulamasından önce doğal bir ürünün toksikolojik değerlendirmesi önemli bir husustur. Mevcut çalışma , G. mellonella deney modelini kullanarak C. verum EO'nun in-vivo toksisitesini belirlemektedir . 0,5 ila 1000 mg/mL EO arasında değişen tüm test konsantrasyonları ile G. mellonella larvaları ile %100 hayatta kalma gözlemlendi . Bu , deney modelinde C. verum yaprağı yağının toksik olmadığını gösterir . 1000 mg/mL, C. verum yaprağı EO'nun saf konsantrasyonu (seyreltilmemiş) olduğundan, saf çözelti dahil tüm seyreltmeler toksik olmayan olarak kabul edilebilir. Her ne kadar önceki in-vivoHayvan modellerinde ilgili yapılan çalışmalarda, tarçın kabuğu yağı konsantrasyonu önemli ölçüde yüksek bir terapötik aralık olan önemli bir toksisite eksikliği sermiştir 22 in vivo laboratuar hayvan modelleri üzerinde tarçın yaprağı yağı toksikliği çalışılmamıştır.
C. verum yaprağı EO'nun kimyasal analizinin sonuçları, öjenolün en bol kimyasal bileşeni olduğunu (%77.22), diğer kimyasal bileşiklerin daha küçük konsantrasyonlarda ortaya çıktığını gösteren önceki çalışmaların bulgularıyla uyumludur. 40
Kandidiyaz ile ilişkili yüksek oluşum ve ölüm oranları, kandidiyazis tedavisinde yeni terapötik yaklaşımların getirilmesinin acil gerekliliğini vurgulamaktadır. Birden fazla araştırma grubu tarafından yürütülen çeşitli çalışmalar, kandidiyazın patogenezi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır, 15 , 41 ve bu bilgi, bulgularının Candida ve diğer enfeksiyonlardan muzdarip hastalara doğrudan fayda sağlayabilecek tedavi stratejilerine dönüştürülmesi için bir başlangıç noktası oluşturmalıdır . Bunlar arasında daha etkili ve en erken seçenek, Candida enfeksiyonlarının kontrolü ve tedavisi için yeni anti-virülans yaklaşımlarının icadıdır . 42 Germ tüpü oluşumu, konak yüzeylere yapışma ve biyofilm oluşumu kandidiyazis sırasında başlıca virülans faktörlerini oluşturduğundan, bunlar, bu tür alternatif anti-virülans stratejilerinin yeniliği için klinik olarak kullanılmamış bir hedefi temsil eder. Bu çalışmada, doğal bir ürün olan C. verum yaprağı EO'nun toksik olmayan, Candida spp. Her iki kullanılarak belirlenmiştir in vitro ve in vivo deney serisi.
Bir dizi in vitro ve in vivo çalışmada Candida enfeksiyonlarının tedavisi için bitki kaynaklı doğal ürünler kullanılmış olsa da, bu tedavilerin antifungal etkisinin veya Candidal fizyolojisi üzerindeki etkisinin kesin mekanizması net olarak anlaşılmamıştır. C. verum Bu çalışmada kullanılan yaprak EO hastalık oluşturma etkisinin müdahale etmek suretiyle kandidiyazis tedavisinde, toksik olmayan terapötik uygulama için potansiyeli olan bitkisel bir üründür Candida . Bununla birlikte, C. verum'a dayalı bir mantar önleyici madde geliştirmek için , in-vivo toksisite araştırmaları ve klinik deneylerin yanı sıra gen düzenlemesi üzerine moleküler çalışmaları içeren daha ileri deneyler önerilir. yaprak EO.
Sonuç olarak, bu çalışma, Candida spp.'nin üç temel virülans faktörü olan adezyon, germ tüpü oluşumu ve biyofilm oluşumuna karşı bir anti-virülans yaklaşımı olarak C. verum yaprak EO'nun yüksek etkinliğine dair kanıt sağlar . C. verum yapraklarından ekstrakte edilen EO , ana aktif bileşeni olarak öjenol içerir ve G. mellonella larvalarına karşı toksik değildir .
Git: TEŞEKKÜRLER
Destekleri için Brezilya, Campinas Üniversitesi, Piracicaba Dişhekimliği Okulu, Ağız Tanı Departmanı, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji alanındaki tüm akademik ve akademik olmayan personele.
Git: Dipnotlar
Mali destek: CNPq (Hibe No. 132718/2018-9).
Git: REFERANSLAR
1. Kojic EM, Darouiche RO. Tıbbi cihazların Candida enfeksiyonları. Clin Microbiol Rev. 2004; 17 (2):255–267. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
2. Achkar JM, Patates Kızartması M.Ö. Genitoüriner sistemin Candida enfeksiyonları. Clin Microbiol Rev. 2010; 23 (2):253–273. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
3. Douglas LJ. Candida enfeksiyonlarında biyofilmlerin tıbbi önemi. Rev Iberoam Micol. 2002; 19 :139–143. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
4. Oranlar FC. Candida enfeksiyonlarına genel bir bakış. Kritik Rev Mikrobiyol. 1987; 15 (1):15–15. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
5. Sardi JCO, Scorzoni L, Bernardi T, Fusco-Almeida AM, Mendes Giannini MJS. Candida türlerinin güncel epidemiyolojisi, patojenitesi, biyofilm oluşumu, doğal antifungal ürünler ve yeni tedavi seçenekleri. J Med Mikrobiyol. 2013; 62 (1):10–24. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
6. Marsh PD, Martin MV. Ağız mikrobiyolojisi. 4. Oxford: Wright; 1999. [ Google Akademik ]
7. Asmundsdóttir LR, Erlendsdóttir H, Agnarsson BA, Gottfredsson M. Candida dubliniensis ve Candida albicans'ın virülansında suş varyasyonunun önemi, invaziv kandidiyazisin kör bir histopatolojik çalışmasının sonuçları. Clin Mikrobiyol Enfeksiyonu. 2009; 15 (6):576–585. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
8. Samaranayake L, Fidel P, Naglik JR, Sweet S, Teanpaisan R, Coogan MM. HIV enfeksiyonu ile ilişkili mantar enfeksiyonları. Oral Dis. 2002; 8 :151–160. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
9. Sant'Ana PL.Milan EP.Martinez R.Queiroz-Telles F.Ferreira MS.Alcântara AP Aids hastalarından izole edilen oral Candida türlerinin çok merkezli Brezilya çalışması. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002; 97 (2):253–257. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
10. Arendrup MC. İnvaziv kandidiyazis epidemiyolojisi. Curr Opin Kritik Bakım. 2010; 16 (5):445–452. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
11. Bongomin F, Gago S, Oladele RO, Denning DW. Mantar hastalıklarının küresel ve çok uluslu yaygınlığı - kesinliği tahmin edin. J Mantarları (Basel) 2017; 3 :E57. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
12. Pemán J, Zaragoza R. Kritik hastada invaziv kandidiyazisin erken teşhisine doğru. Rev Iberoam Micol. 2012; 29 (2):71–75. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
13. Tsang PW, Bandara HMHN, Fong W. Purpurin, Candida albicans biyofilm oluşumunu ve hif gelişimini baskılar. PLoS Bir. 2012; 7 (11):1–8. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
14. Raju SB, Rajappa S. Ağız boşluğundan Candida'nın izolasyonu ve tanımlanması. ISRN Dent. 2011; 2011 :487921–487921. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
15. Mayer FL, Wilson D, Hube B. Candida albicans patojenite mekanizmaları. Virülans. 2013; 4 (2):119–128. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
16. Luo S, Skerka C, Kurzai O, Zipfel PF. İnsan patojenik mantar Candida albicans'ın tamamlayıcı ve doğuştan gelen bağışıklıktan kaçınma stratejileri. Mol İmmünol. 2013; 56 (3):161–169. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
17. Coutinho HDM. Candida spp'nin virülansını etkileyen faktörler. Batı Hint Med J. 2009; 58 (2):160-163. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
18. Romo JA, Zhang H, Cai H, Kadosh D, Koehler JR, Saville SP. Küresel transkriptomik analizi. Candida albicans, yeni bir filamentasyon inhibitörü ile tedaviye yanıt. mSphere. 2019; 4 :e00620–e00619. doi: 10.1128/mSphere.00620-19. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
19. Toda M, Williams SR, Berkow EL, Farley MM, Harrison LH, Bonner L. Kültür tarafından doğrulanmış kandidemi için nüfusa dayalı aktif gözetim - dört bölge, Amerika Birleşik Devletleri, 2012-2016. MMWR Gözetim Özeti. 2019; 68 :1–15. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
20. Maia F, Wijesinghe G, Oliveira T, Barbosa JP, de Feiria SNB, Boni GC. Phyllanthus niruri L (taş kırıcı), anti-insan hastalıklarına alternatif, antimikrobiyal ajan ve dirençli mikroorganizmalarla mücadelede uygulanabilirliği. Kısa Bir İnceleme. Braz J Nat Sci. 2020; 3 (2):342–342. [ Google Akademik ]
21. Rao PV, Gan SH. Tarçın çok yönlü bir şifalı bitkidir. Kanıta Dayalı Comp Alter Med. 2014; 2014 :642942–642942. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
22. Ranasinghe P, Pigera S, Premakumara GS, Galappaththy P, Constantine GR, Katulanda P. "Gerçek" tarçının (Cinnamomum zeylanicum) tıbbi özellikleri sistematik bir derleme. BMC Tamamlayıcı Alter Med. 2013; 13 :275–275. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
23. Chamorro ER, Zambón SN, Morales WG, Sequeira AF, Velasco GA. Gaz kromatografisi ile uçucu yağların kimyasal bileşiminin incelenmesi. 2012. https://www.intechopen.com/books/gas-chromatography-in-plant-science-wine-technology-toxicology-and-some-special-applications/study-of-the-chemical-composition-of- uçucu yağlar-gaz-kromatografisi
24. Wijesinghe GK. Gerçek Tarçın (Cinnamomum verum) yaprağı yağının in vitro Candida biyofilmlerine etkisi ve sitotoksik etkisi. Campinas: Campinas Eyalet Üniversitesi; 2019. [ Google Akademik ]
25. Raut JS, Shinde RB, Chauhan NM, Karuppayil SM. Bitki kökenli terpenoidler, Candida albicans tarafından morfogenezi, yapışmayı ve biyofilm oluşumunu engeller. Biyolojik kirlilik. 2013; 29 :87-96. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
26. Pierce CG, Uppuluri P, Tristan AR, Wormley FL, Jr, Mowat E, Ramage G. Fungal biyofilmlerin oluşumu için basit ve tekrarlanabilir 96-yuvalı plaka bazlı bir yöntem ve antifungal duyarlılık testine uygulanması. Nat Protokol. 2008; 3 (9):1494–1500. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
27. Çekiç KA, Carson CF, Riley TV. Melaleuca alternifolia (çay ağacı) yağı, Candida albicans tarafından mikrop tüpü oluşumunu engeller. Med Mycol. 2000; 38 :355–362. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
28. Silva NCC, Fernandes A., Jr Tıbbi bitkilerin biyolojik özellikleri, antimikrobiyal aktivitelerinin gözden geçirilmesi. J Venom Anim Toksinleri, Trop Dis. 2010; 16 (3):402–413. [ Google Akademik ]
29. Freitas-Fernandes FS, Cavalcanti YW, Ricomini AP, Filho, Silva WJ, Cury AADB, Bertolini M. Günlük enzimatik protez temizleyici kullanımının poliamid ve poli(metil metakrilat) reçineleri ve in vitro üzerinde oluşturulan Candida albicans biyofilmleri üzerindeki etkisi Araştırma. J Protez Dent. 2014; 112 (6):13491355-13491355. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
30. Calderone RA, Fonzi WA. Candida albicans'ın virülans faktörleri. Trendler Mikrobiyol. 2001; 9 (7):327–335. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
31. Simões M, Simões LC, Vieira MJ. Mevcut ve ortaya çıkan biyofilm kontrol stratejilerinin gözden geçirilmesi. LWT-Food Sci Tech. 2010; 43 :573–583. [ Google Akademik ]
32. Mah TFC. O'Toole GA Antimikrobiyal ajanlara karşı biyofilm direnci mekanizmaları. Trendler Mikrobiyol. 2001; 9 (1):34–39. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
33. Richardson K, Cooper K, Marriott MS, Tarbit MH, Troke PF, Whittle PJ. Yeni bir mantar önleyici ajan olan Flukonazolün keşfi. Klinik Enfeksiyon Dis. 1990; 12 (Ek 3) [ PubMed ] [ Google Akademik ]
34. Da Silva PMB, Acosta EJTR. de Rezende Pinto L.Graeff M.Spolidorio DMP.Almeida RS Klorheksidin glukonat ve sodyum hipoklorit işlemlerinden sonra ısı ile polimerize edilmiş akrilik reçine üzerindeki Candida albicans biyofilmlerinin mikroskobik analizi. Mikozlar. 2011; 54 (6):e712–e717. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
35. Bobichon H, Bouchet P. Klorheksidinin tomurcuklanan Candida albicans üzerindeki etkisi Tarama ve transmisyon elektron mikroskobik çalışması. mikopatoloji. 1987; 100 (1):27–35. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
36. Kalia M.Yadav VK.Singh PK.Sharma D.Pandey H.Narvi SS Tarçın yağının çekirdek algılama üzerindeki etkisi - Pseudomonas aeruginosa'da kontrollü virülans faktörleri ve biyofilm oluşumu. PLoS Bir. 2015; 10 (8):e0135495. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
37. Erfan A, Marouf S. Tarçın yağı, kanatlı solunum yolu bakteriyel ajanlarının virülans genlerini aşağı regüle eder ve in vitro bir bakış açısıyla önemli bakteri inhibisyonunu ortaya çıkarır. Veteriner Dünyası. 2019; 12 (11):1707-1715. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
38. Zhang D, Gan RY, Zhang JR, Farha AK, Li H, Zhu F. Baharat esansiyel yağlarının antivirülans özellikleri ve ilgili mekanizmaları kapsamlı bir inceleme. Compr Rev Gıda Bilimi Gıda Saf. 2020; 19 (3):1018–1055. [ Google Akademik ]
39. Kim Y, Lee J, Kim S, Baek K, Lee J. Tarçın kabuğu yağı ve bileşenleri biyofilm oluşumunu ve toksin üretimini engeller. Int J Gıda Mikrobiol. 2015; 195 :30–39. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
40. Liyanage T, Madhujith T, Wijesinghe KGG. Gerçek tarçın (Cinnamomum verum Presl syn. C. zeylanicum Blum.) ve Sri Lanka'da yetişen beş yabani tarçın türünün uçucu yağındaki ana kimyasal bileşenler üzerinde karşılaştırmalı çalışma. Trop Tarım Arş. 2017; 28 (3):270–270. [ Google Akademik ]
41. Romo JA, Pierce CG, Chaturvedi AK, Lazzell AL, McHardy SF, Saville SP. Yeni bir dizi küçük moleküllü inhibitörler aracılığıyla kandidiyaz için anti-virülans yaklaşımlarının geliştirilmesi. Candida albicans filamentasyonu. mBio. 2017; 8 (6):e01991–e01917. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
42. Pierce CG, Lopez-Ribot JL. Kandidiyaz ilaç keşfi ve yeni ilaçların keşfedilmesi ve tanımlanması için virülansı hedefleyen yeni yaklaşımlar geliştirme. Uzman Opin İlaç Diskovu. 2013; 8 (9):1117–1126. [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
C09–11. [ 
Yorum yap